ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF Qualea grandiflora Mart. (VOCHYSIACEAE)

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1 34 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE Qualea grandiflora Mart. (VOCHYSIACEAE) Clapton Olimpio de Moura 1, Gyzelle Pereira Vilhena do Nascimento 2, Catarina Rocha Garofalo Pinto 3. RESUMO A resistência aos fármacos antimicrobianos se tornou um enorme problema de saúde publica. Pesquisas realizadas estimam que milhares de pessoas morram todo ano por estarem infectadas por microrganismos multidrogas resistentes. Os microrganismos causadores de infecções vêm se adaptando desde a descoberta dos primeiros antibióticos até hoje, e o desenvolvimento de novas drogas que combatam esses microrganismos não tem acompanhado essa adaptação. Vários estudos têm sido desenvolvidos com a intenção de se encontrar substâncias ativas úteis para a terapia em plantas usadas na medicina tradicional. O bioma Cerrado possui vasta riqueza ecológica e por isso tem sido alvo de diversas pesquisas com esta finalidade. No presente estudo teve-se como objetivo avaliar a presença ou ausência de atividade antimicrobiana nos extratos alcoólico, hidroalcoólico e hexânico da casca interna da espécie Qualea grandiflora Mart., pertencente ao Cerrado. Foram realizados testes frente às cepas bacterianas Gram-positivas, Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes, e frente às cepas Gram-negativas, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Todos os resultados obtidos através do extrato Hexânico foram negativos. O extrato Alcoólico apresentou atividade contra Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Enquanto o extrato hidroalcoólico apresentou atividade contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. Através dos resultados obtidos neste estudo e na literatura é presumível dizer que os extratos com características mais polares da casca de Qualea grandiflora Mart. apresentem atividade antimicrobiana, principalmente sobre cepas Gram-positivas. Unitermos: Resistência bacteriana, Cerrado, Antimicrobianos. ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF Qualea grandiflora Mart. (VOCHYSIACEAE) ABSTRACT The resistance to antimicrobial drugs has become a huge public health problem. Surveys estimate that thousands of people die every year because they are infected with multidrugresistant microorganisms. The microorganisms that cause infections have been adapting themselves since the discovery of the first antibiotic until the present day, and the development of new drugs to fight these microorganisms have not kept pace with this adaptation. Several studies have been developed with the intention of finding active compounds useful for therapy in plants used in traditional medicine. The Cerrado biome has a vast ecological wealth and so has been the subject of much research for this purpose. The present study was to evaluate the presence or absence of antimicrobial activity in alcoholic, hydroalcoholic and hexanic extracts of the inner bark of the Qualea grandiflora Mart., specie belonging to Cerrado. Tests were conducted against the Grampositive bacterial strains, Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes, and against the Gram-negative strains, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. All results obtained from the hexanic extract were negative. The alcoholic extract showed activity against Staphylococcus aureus 1 Farmacêutico, Faculdades Integradas da União Educacional do Planalto Central, Gama, Distrito Federal, Brasil. claptonmoura@gmail.com; 2 Farmacêutica, Docente da disciplina de Farmacognosia, Faculdades Integradas da União Educacional do Planalto Central, Gama, Distrito Federal, Brasil. gyzashaday@gmail.com; 3 Bióloga, Docente da disciplina de Botânica Aplicada à Farmácia, Faculdades Integradas da União Educacional do Planalto Central, Gama, Distrito Federal, Brasil. catarinagaro@gmail.com Este trabalho corresponde à monografia de conclusão do curso de farmácia de Clapton Olimpio de Moura. Recebido em 21/06/ 2012 Aceite para publicação 26/09/2012

2 35 and Pseudomonas aeruginosa, and the hydroalcoholic extract showed activity against Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes. With the results obtained in this study and in the literature, it is expected to say that the extracts with more polar features from the bark of Qualea grandiflora Mart. have antimicrobial activity, mainly on Gram-positive strains. Uniterms: Bacterial resistance, Cerrado, Antimicrobial drugs. INTRODUÇÃO Desde a descoberta da penicilina até os dias atuais, diversos antimicrobianos foram produzidos pela indústria química e farmacêutica (Ribeiro et al., 2009). Entretanto, o bom resultado no desenvolvimento de novos antimicrobianos caminhou paralelamente com o êxito dos microrganismos em resistir aos efeitos desses fármacos. Além disso, esse equilíbrio desencadeou a condição emergente da resistência bacteriana aos antimicrobianos (Rang et al.,2007). A resistência aos antimicrobianos é atualmente um extenso problema no que se refere à saúde pública mundial (Wannmacher, 2004; Who, 2011a, b). Um dos elementos agravantes a essa situação é que existe uma tendência de que os microrganismos já resistentes a varias classes de antimicrobianos se tornem resistentes a todas as opções terapêuticas disponíveis. Outro fator que causa preocupação é a produção de novos antimicrobianos, que ao contrário do que se esperava vem diminuindo expressivamente nos últimos vinte e cinco anos (Labarca L; Araos B, 2009). A ascendência da resistência antimicrobiana e o declínio na produção de novos fármacos apontam nitidamente para a necessidade de desenvolvimento de novas substâncias que venham em contraposição aos microrganismos resistentes (Labarca L; Araos B, 2009). Dentro desse contexto, as plantas demonstram ser um grande atrativo para a prospecção química, uma vez que os produtos de origem natural sempre constituíram uma ampla fonte para a produção de novos fármacos (Xu; Lee, 2001). Sabe-se que o Cerrado é um bioma que comporta vasta riqueza em espécies animais, vegetais e microbiológicas (Aquino; Oliveira, 2006). Essa riqueza faz com que este seja um bioma altamente atrativo para a pesquisa, incluindo a pesquisa por novas moléculas farmacêuticas (Espíndola, 2007; Costa, 2011). A espécie Qualea grandiflora Mart. (figuras 1, 2, 3 e 4), pertencente à família Vochysiaceae, vem sendo analisada por estudiosos e utilizada na medicina popular com vários desígnios, entre eles o combate aos microrganismos patogênicos (Silva Junior, 2005). Dentro dessa perspectiva, o objeto deste trabalho foi verificar a possível atividade antibacteriana de extratos brutos da casca interna de Qualea grandiflora Mart. (Q. grandiflora). Figura 1 Q. grandiflora.

3 36 Fonte: Rede de Sementes do Cerrado, 2011 Figura 2 Folhas da Q. grandiflora. Fonte: Rede de Sementes do Cerrado, 2011 Figura 3 Frutos secos de Q. grandiflora. Fonte: Figura 4 Flores da Q. grandiflora. Fonte: MATERIAL E MÉTODOS Material botânico: O material botânico utilizado no presente estudo foi adquirido em área pertencente ao Jardim Botânico de Brasília (JBB), durante a primeira semana do mês de setembro de A espécie vegetal foi identificada in loco pela Gerente de Fitologia do JBB, Mariana Souza, e comparada com exsicatas presentes no Herbário do JBB. A coleta foi realizada em cinco

4 37 indivíduos da espécie em áreas diferentes do JBB, com auxilio do geógrafo Augusto Cesar Soares, funcionário do JBB. As cascas obtidas foram lavadas em água corrente para a retirada de resíduos e poeira. Posteriormente a lavagem, o material foi posto sobre papel tolha para a retirada do excesso de umidade. Após este procedimento o material foi posto para a secagem em estufa durante dois dias a 60 ºC. Microrganismos: No presente estudo foram realizados testes com cepas de bactérias Grampositivas e Gram-negativas, listadas na Tabela 1, que são frequentemente associadas a varias patologias infecciosas em humanos (Rubin; Fabber, 1999; Marrs et al., 2005; Thomson; Bonomo, 2005; Berre et al., 2006; Iwatsuki et al., 2006; Marra et al., 2006). Todas as cepas utilizadas neste estudo foram cedidas pelo Dr. José de Souza Soares, professor das Faculdades Integradas da União Educacional do Planalto Central (FACIPLAC - DF). Tabela 1: Cepas de bactérias com seus respectivos números padrões. ESPÉCIE BACTERIANA NÚMERO PADRÂO Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC Streptococcus pyogenes ATCC ATCC = American Type Culture Collection Obtenção dos extratos: Para a obtenção dos extratos empregados neste estudo foi utilizado um método semelhante ao de decocção, onde o material vegetal foi posto juntamente com um liquido solvente em um recipiente fechado, e em seguida aquecido até que o solvente entre em estado de ebulição. Foram utilizados três solventes, sendo eles: Etanol, Água destilada e n-hexano. Para a preparação dos extratos alcoólico (Etanol 99,5%) e hidroalcoólico (Proporção 1:1 de água destilada e Etanol 99,5%), foram medidos 500 ml do solvente e adicionados 100 g da casca interna seca em um béquer tampado, onde foram postos para aquecimento até que o solvente entrasse em ebulição. Após este procedimento o extrato foi filtrado em funil de vidro, com algodão. O filtrado obtido foi posto em evaporador rotativo por cerca de 12 horas, para a obtenção de um extrato mais concentrado. Posteriormente à evaporação, obteve-se 30 ml de um concentrado a 3,3 mg/μl. O extrato hexânico foi obtido através do mesmo procedimento descrito anteriormente, porém com modificações nos valores do material vegetal e do solvente. Para a extração foram pesados 40 g do material vegetal e adicionados 200 ml do solvente. Após o procedimento de filtração foram adicionados mais 25 g do material vegetal, e novamente foi feita uma extração. Depois da segunda extração, foi realizada mais uma filtração e em seguida o extrato foi submetido à evaporação. Por fim, obteve-se 16 ml de um concentrado a 4,0 mg/μl. Todos os extratos obtidos foram armazenados em vidro âmbar, e conservados em refrigerador durante o período de realização dos ensaios. Sensibilização dos discos: Foram preparados discos de papel filtro com 5 mm de diâmetro, secos e esterilizados. Posteriormente, os discos foram dispostos sobre lâminas de vidro previamente esterilizadas. Em seguida foram adicionados volumes variados dos extratos a serem estudados. Para a realização das análises foram utilizados discos com sensibilizações de 5, 10, 20 e 40 μl dos extratos a 3,3 mg/μl (Alcoólico e Hidroalcoólico) e 4,0 mg/μl (Hexânico). Inoculação dos microrganismos: Para a obtenção dos inóculos, foram utilizadas culturas recentes das bactérias a serem testadas, em seguida foram preparadas suspensões dessas bactérias em caldo BHI e incubadas por um período de 24 horas em estufa a 37ºC. Durante a realização dos testes os

5 38 inóculos foram semeados com auxilio de swabs estéreis em placas de Petri contendo meio Ágar Mueller-Hinton. Prova de disco-difusão: A avaliação da atividade antibacteriana dos extratos foi feita através da metodologia de disco-difusão em meio Ágar Mueller-Hinton, adotada pelo CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute, com algumas adaptações (NCCLS, 2003). O período de incubação das placas foi de 24 horas a 37ºC. Também foram utilizados discos de controle positivo de Tetraciclina 30 μg em todas as placas testadas inclusive nas placas de controle negativo. As placas de controle negativo foram preparadas da mesma maneira que as demais placas, tendo como única exceção à ausência dos microrganismos. Todos os testes foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram calculados de acordo com a média dos halos de inibição em milímetros, e expressos juntamente com o desvio padrão das médias. RESULTADOS Na avaliação feita com os discos sensibilizados com o extrato hexânico em concentrações de 20; 40; 80 e 160 mg/disco, como demonstrado na Tabela 2, não foi possível observar a presença de halos de inibição, contra nenhuma das cepas testadas, o que indica a ausência de atividade antibacteriana do extrato nestas concentrações. Tabela 2: Média do diâmetro da zona de inibição formada pelo extrato hexânico das cascas de Qualea grandiflora e pelo controle positivo (Tetraciclina 30 μg) em exposição a diversas bactérias. Halos (mm) ± Desvio Padrão Bactérias 20mg/disco 40mg/disco 80mg/disco 160mg/disco Tetraciclina E. coli ,0 ± 0,0 P. aeruginosa ,6 ± 1,5 S. aureus ,6 ± 0,5 S. pyogenes ,3 ± 0,5 E. coli = Escherichia coli; P. aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. pyogenes = Streptococcus pyogenes. Nos testes realizados com os discos impregnados com o extrato alcoólico em concentrações de 16,5; 33; 66 e 132 mg/disco não foi possível evidenciar a presença de atividade contra as cepas de Escherichia coli (E. coli) e de Streptococcus pyogenes (S. pyogenes). Já frente às cepas de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) e Staphylococcus aureus (S. aureus), o extrato alcoólico se mostrou promissor, dado que foi possível verificar a presença de zonas de inibição, o que evidencia a presença de atividade antibacteriana contra essas cepas (tabela 3). Tabela 3: Média do diâmetro da zona de inibição formada pelo extrato alcoólico das cascas de Qualea grandiflora e pelo controle positivo (Tetraciclina 30 μg) em exposição a diversas bactérias. Halos (mm) ± Desvio Padrão Bactérias 16,5mg/disco 33mg/disco 66mg/disco 132mg/disco Tetraciclina E. coli ,6 ± 0,5 P. aeruginosa 5,0 ± 4,3 9,0 ± 1,0 10,3 ± 0,5 11,6 ± 0,5 15,3 ± 1,1 S. aureus 9,6 ± 0,5 12,0 ± 0,0 14,3 ± 0, ± 1,1 27,6 ± 0,5 S. pyogenes ,6 ± 0,5 E. coli = Escherichia coli; P. aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. pyogenes = Streptococcus pyogenes. Na análise feita com o extrato hidroalcoólico nas concentrações de 16,5; 33; 66 e 132 mg/disco, foi possível evidenciar a presença zonas de inibição contra as cepas bacterianas

6 39 classificadas como Gram-positivas, S. aureus e S. pyogenes, o que indica a presença de atividade antibacteriana contra estas espécies. Já frente às cepas Gram-negativas, E. coli e P. aeruginosa, não foi possível verificar a presença de halos de inibitórios, apontando para a negatividade de ação antibacteriana contra essas espécies (tabela 4). Tabela 4: Média do diâmetro da zona de inibição formada pelo extrato hidroalcoólico das cascas de Qualea grandiflora e pelo controle positivo (Tetraciclina 30 μg) em exposição a diversas bactérias. Halos (mm) ± Desvio Padrão Bactérias 16,5mg/disco 33mg/disco 66mg/disco 132mg/disco Tetraciclina E. coli ,3 ± 0,5 P. aeruginosa ,3 ± 0,5 S. aureus 8,3 ± 0,5 10,0 ± 1,0 12,3 ± 0,5 15,0 ± 1,0 27,0 ± 1,0 S. pyogenes 9,0 ± 1,0 11,6 ± 0,5 13,3 ± 0,5 15,0 ± 1,0 16,0 ± 0,0 E. coli = Escherichia coli; P. aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. pyogenes = Streptococcus pyogenes. DISCUSSÃO Por meio do presente estudo, foi possível verificar que em nenhuma das concentrações testadas do extrato hexânico da casca de Qualea grandiflora, houve atividade inibitória frente às cepas de S. aureus, S. pyogenes, E. coli e P. aeruginosa. Este resultado indica que os constituintes químicos com caráter mais apolar da casca interna de Q. grandiflora, não possuem potencial antibacteriano frente às cepas estudadas. Porem é importante ressaltar que o solvente utilizado (Hexano), possui elevado grau de volatilidade, e que essa característica pode ter interferido no resultado. Visto que durante a sensibilização dos discos de papel o solvente pode ter evaporado rapidamente e juntamente com ele alguns constituintes da planta. Na avaliação feita com o extrato alcoólico, verificou-se que houve atividade de inibição contra as cepas de S. aureus e P. aeruginosa, e que as cepas de S. pyogenes e E. coli se mostraram resistentes em todas as concentrações. Já nos testes realizados com o extrato hidroalcoólico, solvente mais polar do estudo, foi possível verificar atividade antibacteriana somente nas cepas de bactérias Gram-positivas, S. aureus e S. pyogenes. De acordo com estes resultados, é sugestivo dizer que substâncias que estão presentes na casca de Q. grandiflora e que contenham caráter mais polar possuem atividade antibacteriana, principalmente sobre a espécie S. aureus. Estudos realizados com os extratos etanólicos das folhas de Q. grandiflora demonstraram atividade inibitória principalmente sobre cepas de bactérias Gram-positivas, não sendo eficaz frente a cepas Gram-negativas como E. coli e Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae). É importante ressaltar que neste estudo a atividade inibitória sobre as cepas bacterianas Gram-positivas foram extremamente motivadoras, pois os extratos apresentaram eficácia tanto frente a cepas mais sensíveis aos antimicrobianos existentes, quanto aos microrganismos mais resistentes à terapia atual, como as cepas de S. aureus resistente à meticilina (SARM, ou da sigla em inglês MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) e de Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) resistente à meticilina (SERM, ou da sigla em inglês MRSE Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis) (Ayres et al., 2008a). Os resultados de Ayres et al. (2008a), juntamente com os resultados obtidos através deste estudo, induzem a confirmação da presença de substâncias ativas na espécie Q. grandiflora contra cepas Gram-positivas, especialmente contra cepas do gênero Staphylococcus spp. Ayres et al. (2008a) ainda destaca a presença de triterpenos na família Vochysiaceae como sendo uma das possíveis substâncias que conferem característica antimicrobiana a espécie Q. grandiflora. Em pesquisa realizada por Alves et al. (2000) com as cascas de Q. grandiflora, e tendo como solvente metanol foi possível verificar a ação inibitória sobre cepas de S. aureus e P.

7 40 aeruginosa, o que coincide com os resultados obtidos neste estudo, através dos extratos etanólicos, que possui propriedades físico-químicas semelhantes a do metanol. Pesquisadores responsáveis pelo primeiro estudo químico com os extratos etanólicos das folhas de Q. grandiflora, enfatizam a presença de Taninos, Triterpenos, Flavonóides, Benzoquinonas, Antraquinonas entre outros constituintes químicos nas espécies pertencentes à família Vochysiaceae. É conhecido que taninos e triterpenos possuem atividade de inibição microbiana, o que corrobora juntamente com os estudos realizados para a afirmação de que a espécie Q. grandiflora possua potencial de ação antimicrobiano (Ayres et al., 2008b). Comparando os resultados obtidos na literatura com os resultados obtidos neste estudo, com exceção aos resultados do extrato hexânico que não apresentou atividade sobre nenhuma bactéria, e ao extrato etanólico, que apresentou atividade contra P. aeruginosa e não apresentou atividade contra S. pyogenes, foi possível observar que as cepas bacterianas classificadas como Grampositivas foram mais susceptíveis aos extratos testados, principalmente em relação aos extratos de caráter polar. Esse fato é possivelmente explicado pelas diferenças estruturais que existem entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Mais especificamente entre as diferenças estruturais da parede celular. As bactérias classificadas como Gram-positivas possuem uma parede celular mais simples, formada por uma grossa camada de peptideoglicana ligada covalentemente a ácidos teicóico e/ou teicurônico, essas ligações formam uma rede que permite a passagem de várias moléculas de interesse da célula, o que somado ao caráter hidrofílico dessa parede possibilita a passagem dos agentes antimicrobianos. Já a parede celular das bactérias Gram-negativas possui uma estrutura mais complexa, formada por uma membrana externa, composta de lipopolissacarídeos, que é responsável por limitar a passagem de vários agentes antimicrobianos, é formada ainda por um espaço denominado de espaço periplasmático, onde estão encontradas uma camada (mais fina) de peptideoglicana e várias enzimas que inativam as substâncias que são agressoras a bactéria. Por fim as bactérias Gram-negativas possuem um mecanismo conhecido como Bomba de efluxo, que consiste em um mecanismo que expulsa substâncias estranhas para fora da célula (Denyer; Maillard, 2002; Lambert, 2002; Violante, 2008). A atividade antibacteriana de substâncias com caráter mais polar é de certo modo positiva, visto que substâncias que possuem caráter polar facilitam a produção de novos fármacos, uma vez que favorecem os estudos de desenvolvimento das formas de absorção e biodisponibilização para o organismo (Taveira, 2007). CONCLUSÕES Através desse estudo foi possível verificar a presença de atividade antimicrobiana nos extratos alcoólico e hidroalcoólico, da casca interna de Qualea grandiflora Mart., espécie pertencente ao Cerrado. Os extratos de Q. grandiflora demonstraram atividade inibitória principalmente sobre a cepa Gram-positiva S. aureus. Entretanto a extração alcoólica também apresentou atividade inibitória frente à bactéria Gram-negativa P. aeruginosa, e através da extração hidroalcoólica foi possível verificar a atividade contra a bactéria Gram-positiva S. pyogenes. CONSIDERAÇÕES FINAIS Nesse trabalho, foram feitos apenas testes qualitativos com a finalidade de verificar a presença ou ausência de atividade antibacteriana dos extratos brutos das cascas internas da espécie Q. grandiflora. Posteriormente mais testes deverão ser realizados para que se obtenham valores quantitativos, como a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM). A fim de se caracterizar a ação destes extratos como bactericida ou bacteriostático.

8 41 Além de estudos para a elucidação da atividade antimicrobiana, ensaios químicos e farmacognósticos também devem ser realizados com a finalidade de descobrir e isolar as substâncias que atribuem esta atividade aos extratos da casca de Q. grandiflora Mart. REFERÊNCIAS Alves, T. M. A.; Silva, A. F.; Brandão, M.; Grandi, T. S. M.; Smânia, E. F. A.; Smânia Junior, A.; Zani, C. L. (2000). Biological screening of brazilian medical plants. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 95(3): Aquino, F. G.; Oliveira, M. C. (2006). Reserva legal no bioma Cerrado: uso e preservação. Planaltina: Embrapa Cerrados. Ayres, M. C. C.; Brandão, M. S.; Vieira Junior, G. M.; Menor, J. C. A. S.; Silva, H. B.; Soares, M. J. S.; Chaves, M. H. (2008a). Atividade antibacteriana de plantas úteis e constituintes químicos da raiz de Copernicia prunifera. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18(1): Ayres, M. C. C.; Escórcio, S. P.; Costa, D. A.; Chaves, M. H.; Vieira Junior, G. M.; Cavalheiro, A. J. (2008b). Constituintes químicos das folhas de Qualea grandiflora: atribuição dos dados de RMN de dois flavonóides glicosilados acilados diastereoisoméricos. Química Nova [online], v. 31(6): Berre, L. E.; Faure, K.; Nguyen, S.; Pierre, M.; Ader, F.; Guery, B. (2006). Quorum sensing: une nouvelle cible thérapeutique pour Pseudomonas aeruginosa? Médecine et Maladies Infectieuses, v. 36: Costa, F. B. (2011). Potencial químico do Cerrado. Agência FAPESP. - Acesso em: 29 de agosto de Denyer, S. P.; Maillard, J. Y. (2002). Cellular impermeability and uptake of biocides and antibiotics in Gram-negative bacteria. Journal of Applied Microbiology Symposium, v. 92: 35S-45S. Espíndola, L. S. (2007). Cerrado: fonte de descoberta de novos medicamentos. Brasília Médica, v. 44(1): Iwatsuki, K.; Yamasaki, O.; Morizane, S.; Oono, T. (2006). Staphylococcal cutaneous infections: invasion, evasion and aggression. Journal of Dermatological Science, v. 42: Marra, R. A.; Bar, K.; Bearman, G. M. L.; Wenzel, R. P.; Edmond, M. B. (2006). Systemic inflammatory response syndrome in adult patients with nosocomial bloodstream infection due to Pseudomonas aeruginosa. Journal of Infection, v. 53: Marrs, C.; Zhang, L.; Foxman, B. (2005). Escherichia coli mediated urinary tract infections: Are there distinct uropathogenic E. coli (UPEC) pathotypes? FEMS Microbiology Letters, v. 252: NCCLS National Committee For Clinical Laboratry Standards (2003). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard-Eighth Edition. NCCLS document M2-A8. Pennsylvania: NCCLS.

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