Desenvolvimento de ferramentas moleculares (DNA) para monitoramento ambiental de peixes e plantéis de piscicultura

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1 Universidade Federal de São João del-rei Campus Tancredo de Almeida Neves Departamento de Zootecnia Laboratório de Recursos Genéticos Desenvolvimento de ferramentas moleculares (DNA) para monitoramento ambiental de peixes e plantéis de piscicultura Relatório Final de Projeto de Pesquisa & Desenvolvimento Gerente do Projeto João de Magalhães Lopes Coordenador da equipe de pesquisa Prof. Gabriel de Menezes Yazbeck

2 RESUMO Ações de monitoramento ambiental e mitigação de impactos sobre a ictiofauna migratória beneficiam-se muito do uso de marcadores moleculares de DNA, capazes de revelar a variação genética de estoques naturais e domésticos. Este projeto desenvolveu um painel de caracterização de centenas de milhares de novos loci gênicos do tipo microssatélite, para quatro espécies de piracema do alto rio Grande, MG, utilizadas em atividade de produção voltada à estocagem ambiental de peixes: dourado (Salminus brasiliensis), piapara (Leporinus piavussu), piracanjuba (Brycon orbignyanus) e curimba (Prochilodus lineatus). A metodologia empregada foi a do sequenciamento de nova-geração (NGS), capaz de elucidar uma quantidade sem precedentes de informações genômicas, de forma rápida e acessível. Os novos microssatélites caracterizados foram analisados por meios bioinformáticos, para a seleção de loci com maior probabilidade de polimorfismos genéticos (candidatos a marcadores) e, em seguida, testados e validados em uma amostra populacional de peixes. Os testes de populações foram realizados em indivíduos capturados para a formação de plantel em estação ambiental da CEMIG, no alto rio Grande, para avaliação de caráter mendeliano dos marcadores genéticos. Este procedimento levou ao desenvolvimento e validação de dezenas dos primeiros marcadores moleculares microssatélites descritos para a piracanjuba, uma espécie ameaçada de extinção. Os demais resultados têm o potencial para rapidamente revelarem centenas de novos marcadores válidos para as quatro espécies-alvo do projeto, bem como para muitas espécies próximas destes peixes. Informações inéditas preciosas para a compreensão da biologia básica dessas espécies de piracema foram reveladas. Testes com marcadores microssatélites previamente descritos para espécies próximas foram realizados para avaliação de transferência heteróloga (i.e. entre espécies diferentes), para seu emprego em espécies-alvo do projeto. O primeiro genoma mitocondrial completo para a família Anostomidae foi elucidado no projeto, o que permite o uso de diversos novos marcadores mitocondriais para espécies do gênero Leporinus (piaus e piaparas), incluindo as formas de ocorrência no alto rio Grande, de recente descrição formal na literatura taxonômica. O conjunto de dados gerados nesta pesquisa viabilizou o desenvolvimento de novos recursos moleculares prontos para uso direto e imediato na conservação e na gestão ambiental da ictiofauna de áreas alteradas pela presença de barragens. Os marcadores inéditos constituem novos instrumentos úteis na caracterização genética de indivíduos e populações, na delimitação genética de estoques, no planejamento e avaliação de eficiência de peixamentos, na seleção de matrizes e sistemas de procriação em estações ambientais, na avaliação da necessidade e eficiências de mecanismos de transposição de peixes e medidas de manejo ambiental diante de desastres e mortandades. Essas ferramentas terão impacto significativo na conservação de peixes da bacia do rio Grande e do São Francisco, MG. Palavras-chave: Piracanjuba, piapara, dourado, monitoramento e manejo genético de estoques de peixes. 2

3 INDICE 1. OBJETIVO INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES EQUIPE MOTIVAÇÃO DESCRIÇÃO DO RESULTADO METODOLOGIA ORIGINALIDADE , APLICABILIDADE RELEVÂNCIA RECURSOS EMPREGADOS CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO TRANSFERÊNCIA E DIFUSÃO TECNOLÓGICA DOS RESULTADOS DO PROJETO RAZOABILIDADE DE CUSTOS BIBLIOGRAFIA ANEXOS

4 TÍTULO DO PROJETO Desenvolvimento de ferramentas moleculares (DNA) para monitoramento ambiental de peixes e plantéis de piscicultura (GT345) 1. OBJETIVO TEMA: Meio Ambiente SUBTEMA: Impactos e restrições socioambientais de sistemas de energia elétrica. Objetivo geral: O objetivo principal do projeto é o desenvolvimento de ferramentas moleculares baseadas em marcadores genéticos de Ácido Desoxirribonucleico (DNA), para espécies de interesse nas atividades de gerenciamento e manejo da ictiofauna de reservatórios de Usinas Hidroelétricas (UHEs) e Estações de Piscicultura da CEMIG. Essas ferramentas viabilizam meios de se acessar o perfil genético de indivíduos, cardumes, populações e da espécie como um todo e podem ser aplicadas na gestão da ictiofauna de reservatórios de UHEs, na determinação da necessidade de implementação de Mecanismos de Transposição de Peixes (MTPs), na mitigação de desastres ambientais (mortandades de peixes) e no controle e avaliação de eficiência das atividades de piscicultura e peixamentos, com maior grau de informação, melhor custo/benefício, maior retorno socioambiental e capacidade de intervenção. Objetivos específicos: O presente projeto teve como objetivos específicos: -Isolar e caracterizar regiões de microssatélites do genoma de dourado (Salminus brasiliensis, sinonímia=s. maxillosus), piapara (Leporinus piavussu, até 2012 identificada como L. elongatus/l. obtusidens) e piracanjuba (Brycon orbignyanus), projetar e construir iniciadores para PCR, úteis como marcadores moleculares (marcadores de DNA) populacionais, diretamente aplicáveis às atividades de gerenciamento e manejo de estoques naturais e de pisciculturas utilizados em peixamentos nos reservatórios de bacias como a do rio Grande e do São Francisco, MG. -Testar e padronizar os marcadores microssatélites isolados em outras espécies próximas relacionadas para o desenvolvimento de marcadores genéticos funcionais (heterólogos) nas espécies de interesse desse estudo. 2. INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES Entidade Executora Nome: Universidade Federal de São João Del-Rei - UFSJ Departamento: Departamento de Zootecnia Lab. Recursos Genéticos - Campus Tancredo de Almeida Neves CNPJ: / Endereço Completo: Praça Frei Orlando, nº170, Bairro Centro, CEP , São João Del-Rei Minas Gerais Brasil. Contato: Prof. Gabriel de Menezes Yazbeck Telefone: (32) ou gabriel@ufsj.edu.br Entidade Interveniente 4

5 Nome: Fundação de Apoio a Universidade Federal de São João Del Rei - FAUF CNPJ: / Endereço Completo: Praça Frei Orlando, 170, Centro, CEP , São João Del-Rei Minas Gerais Brasil. Contato: Alessandra Gaede Pinheiro Telefone: (32) fauf@ufsj.edu.br Entidade Proponente Nome: CEMIG Geração e Transmissão S.A. CEMIG GT CNPJ: / Endereço: Avenida Barbacena, 1200, 12º andar- ala B1, Bairro Santo Agostinho - CEP: , Belo Horizonte Minas Gerais Brasil. Contato: João de Magalhães Lopes Telefone: (31) joaoml@cemig.com.br 3. EQUIPE Além do gerente da CEMIG, o projeto de pesquisa envolveu a participação de 03 doutores, 12 bolsistas (sendo 01 de pós-doutorado, 02 de mestrado, 09 pesquisadores júnior de iniciação científica), responsáveis pelo desenvolvimento do projeto na Universidade Federal de São João del- Rei. MSc. João de Magalhães Lopes Gerente do projeto (Cemig) Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Minas Gerais (1999), mestrado em Ecologia, Conservação e Manejo de Vida Silvestre pela Universidade Federal de Minas Gerais (2003) e MBA em Gestão Empresarial pela Universidade Federal de Uberlândia (2007). Atualmente é Analista de Meio Ambiente sênior da Cemig Geração e Transmissão S.A. e estudante de doutorado em Ecologia Aplicada na Universidade Federal de Lavras. Tem experiência na área de Ecologia, com ênfase em dinâmica populacional, relações tróficas e ecologia aplicada, atuando principalmente nos seguintes temas: reprodução de espécies nativas de peixes e conservação e manejo da ictiofauna. Equipe UFSJ: Dr. Gabriel de Menezes Yazbeck Coordenador geral do projeto ( ): O coordenador do projeto, o Prof. Dr. Gabriel de Menezes Yazbeck, defendeu tese de doutorado em Genética na Universidade Federal de Minas Gerais, em 2007, que incluiu estágio sanduíche na University of Victoria, Canadá, intitulada Microssatélites em estudos populacionais de peixes migratórios. No mesmo ano publicou o primeiro conjunto de marcadores moleculares microssatélites isolados para Prochilodus lineatus (Yazbeck e Kalapothakis, 2007). Professor na Universidade Federal de São João del-rei desde 2009, leciona as disciplinas de Genética e Biologia Molecular, coordena o Grupo de Pesquisa e o Laboratório de Recursos Genéticos, é membro do núcleo permanente de docentes do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e membro do recém criado curso de Pós Graduação em Ecologia da UFSJ. Desenvolveu e gerencia o Banco de DNA da Ictiofauna do alto rio Grande e participa do grupo de estudos de bioinformática GATTACA na UFSJ. Foi responsável pela coordenação técnica do projeto, incluindo o delineamento teórico do projeto, planejamento, supervisão e execução de experimentos em biologia molecular, análise e interpretação de dados genéticos e bioinformáticos, orientação de alunos de iniciação científica e mestrado, supervisão de pós-doutorando, análises estatísticas em genética de populações, levantamento bibliográfico, elaboração de comunicações científicas, relatórios e produtos, organização de eventos de capacitação técnica e educação ambiental, obtenção de licenças de coleta e comitê de ética, coleta de material biológico, interface executiva junto à CEMIG, UFSJ e FAUF para viabilização das atividades do projeto. 5

6 Dr. Andrey Leonardo Fagundes de Castro Pesquisador ( ): Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Minas Gerais (1997), mestrado em Ciências Biológicas (Zoologia) pela Universidade Federal da Paraíba (2000) e doutorado em Biologia (Ecology and Evolution) pela University of South Florida (2009). Durante seu período de participação no projeto era Professor Adjunto I da Universidade Federal de São João del-rei, no Departamento de Zootecnia. Tem experiência na área de Ecologia populacional e molecular de peixes, atuando principalmente nos seguintes temas: estrutura populacional, filogeografia, padrões migratórios, censos visuais e comportamento. Auxiliou no planejamento executivo. Dr. Fausto Moreira da Silva Carmo Pesquisador de pós-doutorado ( ): Pesquisador (nível doutor) em atividade de pós-doutoramento, com bolsa da CEMIG: O Dr. Fausto Moreira da Silva Carmo desenvolveu atividade de pós-doutoramento, ao longo de três anos, no Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Mestre em Genética e Evolução pela Universidade Federal de São Carlos e Doutor em Zootecnia pela Universidade Federal de Viçosa. Foi responsável pela organização, manutenção e execução de ensaios em laboratório de biologia molecular, análises computacionais da diversidade genética de marcadores, co-orientação de alunos de iniciação científica e estagiários, coleta de material biológico, interpretação de dados, elaboração de relatórios, eventos e comunicações científicas. Lívia Izabela de Caputo Mestranda ( ): Aluna de mestrado com bolsa da UFSJ. Possui graduação em Ciências Biológicas (Bacharelado e Licenciatura) pela Universidade Federal de São João del-rei (2011). Desenvolveu atividades no PIBID (Programa Institucional de Bolsas de Iniciação a Docência) e Iniciação Científica durante a graduação. Atuou como bolsista de Gestão em Ciência e Tecnologia no Núcleo de Inovação Tecnológica da Universidade Federal de São João del-rei ( ). Atualmente é aluna regularmente matriculada no curso de Pós-Graduação em Biotecnologia - UFSJ. Possui experiência nas áreas de evolução molecular e biologia molecular, bioinformática e propriedade intelectual. Responsável pelos testes de novos marcadores moleculares de S. brasiliensis. Suellen Caetano Moreira Mestranda (2015): Aluna de mestrado com bolsa da UFSJ: Bacharel em Bioquímica pela Universidade Federal de São João del-rei, campus Centro Oeste Dona Lindu (UFSJ). Atualmente é aluna regularmente matriculada no curso de Pós-Graduação em Biotecnologia UFSJ. Responsável pelos testes de novos marcadores moleculares em Leporinus piavussu e P. lineatus. Marcos Antônio da Silva Iniciação Científica ( ): Aluno de iniciação científica com bolsa da CEMIG. Graduou-se em Zootecnia pela Universidade Federal de São João del-rei (2014), onde realizou iniciação científica na área de genética, com ênfase em genética de populações e marcadores moleculares para monitoramento populacionais de peixes de água doce. Atualmente faz mestrado em Zootecnia pela Universidade Federal de Minas Gerais atuando principalmente nos seguintes temas: produção, nutrição e manejo de peixes. Foi responsável por testes heterólogos em B. orbignyanus. Defendeu Trabalho de Conclusão de Curso com tema ligado ao projeto. Erico Macedo Polo Iniciação Científica ( ): Aluno de iniciação científica com bolsa da CEMIG. Atualmente é estudante de mestrado no programa de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEv) do INPA, onde tem desenvolvido um trabalho de biogeografia e evolução de aves. Graduou-se em Ciências Biológicas na Universidade Federal de São João del Rei (UFSJ) em 2013, onde cursou as modalidades de Bacharelado e Licenciatura. Possui experiência em programação de computadores e desenvolvimento de ferramentas para execução de estudos e pesquisas em Biologia. Responsável por análises bioinformáticas. Foi premiado em congresso nacional de Genética com trabalho gerado no projeto em Defendeu Trabalho de Conclusão de Curso com tema ligado ao projeto. 6

7 Barbara Rodrigues Nascimento Iniciação Científica ( ): Aluna de iniciação científica com bolsa da CEMIG. Graduada em Zootecnia pela Universidade Federal de São João del-rei. Tem experiência na área de reação em cadeia da polimerase (PCR), bem como o uso de técnicas de eletroforese de ácidos nucléicos e a análise estatística de dados sobre a diversidade genética de marcadores heterólogos. Foi responsável por ensaios preliminares de heteróloga em L. obtusidens. Lucas Oliveira Costa Iniciação Científica (2013): Aluno de iniciação científica com bolsa da CEMIG. Aluno do curso de Ciência da Computação da Universidade Federal de São João del-rei. Foi responsável por análises bioinformáticas no projeto. José Mauro Ribeiro Iniciação Científica ( ): Aluno de iniciação científica com bolsa da CEMIG. Graduando em Ciência da Computação na Universidade Federal de São João del-rei. Foi responsável por análises bioinformáticas no projeto. Coautor na publicação do primeiro genoma mitocondrial completo de peixes da família dos piaus e piaparas, resultado spin off do projeto. Zélia de Oliveira Teixeira Iniciação Científica (2014): Aluna de iniciação científica com bolsa da CEMIG. Graduanda em Zootecnia pela Universidade Federal de São João del-rei. Foi responsável por testes moleculares com marcadores heterólogos e homólogos de microssatélites de peixes no projeto. Monique Macedo Coelho Iniciação Científica ( ): Aluna de iniciação científica com bolsa da CEMIG: Graduanda em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de São João del-rei. Foi responsável por testes moleculares preliminares com novos microssatélites de peixes do projeto. Priscila Maria de Freitas Viana Iniciação Científica (2014): Aluna de iniciação científica com bolsa da UFSJ: Graduanda em Zootecnia pela Universidade Federal de São João del-rei. Foi responsável por testes moleculares e análise de dados com novos marcadores homólogos de microssatélites de B. orbignyanus no projeto. Acompanhou aluna de Iniciação Científica Jr. Ana Clara de Jesus Iniciação Científica Jr. (2014): Aluna de ensino médio em programa de Iniciação Científica Jr. com bolsa da UFSJ: Estudante do terceiro ano do ensino médio da Escola Estadual Dr. Garcia de Lima, vinculada à Universidade Federal de São João del-rei por meio do programa Primeiros Passos na Ciência. Foi responsável por testes moleculares preliminares e análise de dados com novos marcadores homólogos de microssatélites de B. orbignyanus no projeto. Acompanhada pelo coordenador, pós-doutorando e pela aluna de Iniciação Científica, Priscila M.F. Viana. 4. MOTIVAÇÃO Motivador: A presença de barragens de UHEs tem grande impacto sobre a ictiofauna local e regional em áreas de empreendimento hidroelétrico. A modificação dos regimes hidrológicos, a eliminação de lagoas marginais e as alterações físico-químicas do ambiente aquático induzidas pela formação de reservatórios são alguns dos efeitos importantes sobre as comunidades de peixes. Tais fatores, associados à poluição urbana, industrial e rural, aos desmatamentos de matas ciliares e pesca predatória afligem as populações naturais de peixes, tornando-as mais vulneráveis a eventos de 7

8 extinção local. Particularmente afetados são os peixes migratórios (espécies de piracema). A interrupção de fluxo gênico promovido por levas migratórias pode levar à separação de populações contíguas, redução dos tamanhos populacionais e maior fragilidade e susceptibilidade a eventos de estocasticidade ambiental, genética e demográfica. Isso motiva a produção de peixes em operações de piscicultura (estações ambientais) para a suplementação populacional (peixamento), nas bacias afetadas por barragens. A existência de estoques pesqueiros abundantes e de alta qualidade desempenha um papel socioambiental central, tanto na manutenção dos processos ecológicos, quanto na subsistência de populações ribeirinhas e no desenvolvimento econômico regional (pesca continental artesanal, comercial e esportiva). A caracterização genética de estoques pesqueiros, através da aplicação de marcadores de DNA, permite a delimitação e adoção de medidas de manejo e mitigação em bacias impactadas por atividades de geração de energia por UHEs, com grau de precisão e informatividade anteriormente inédito. Da mesma forma, estes marcadores podem ser aplicados para dirigir as atividades de produção de peixes em estações de pisciculturas (ex. escolha das matrizes e planejamento dos cruzamentos) e a condução de atividades de peixamento de forma a torná-las mais eficientes, precisas e passíveis de acompanhamento (verificação posterior do sucesso do peixamento). Ainda não existem, ou ainda existem em números pequenos, os marcadores de DNA microssatélites para as espécies do projeto. Recentemente, o uso de ferramentas moleculares (marcadores genéticos de DNA) tem revolucionado a gestão da pesca e da aquicultura na Escandinávia e em países como o Canadá, EUA e Japão, por permitir a identificação e caracterização genética dos estoques populacionais de diversas espécies de peixes. Marcadores de DNA constituem o que há de mais avançado no estado da técnica aplicado à gestão ambiental. Essas ferramentas viabilizam a identificação de linhagens de interesse econômico e conservacionista, além de quantificar diretamente a variabilidade genética dos estoques de peixes. A existência de variação genética populacional permite que estoques submetidos à mudanças ambientais respondam às novas pressões ecológicas (ex. mudanças climáticas, espécies exóticas, novas doenças, poluição, etc.) e escapem de eventos de extinção local. Originalidade: A originalidade do projeto está no esforço de desenvolvimento de novos marcadores para espécies nativas de peixes de importância nas atividades de gerenciamento de reservatórios e das pisciculturas, para as quais há poucos ou ainda não há descrição específica de marcadores microssatélites na literatura científica. O recente avanço da genética concretizou formas de levantamento de informações genômicas de espécies não-modelo, de forma rápida, eficiente e economicamente acessível, nos últimos anos. Essas técnicas são coletivamente conhecidas como metodologias de Sequenciamento de DNA de Nova- Geração ou NGS. Através do emprego de NGS, hoje é possível se caracterizar novos marcadores moleculares com grande sucesso, a custos razoáveis, sendo outrora tais resultados apenas possíveis diante de custos proibitivos para grupos individuais de pesquisa (ex. projeto genoma humano). Este projeto visou o uso de tecnologia de ponta no estado da arte, via NGS, com uso da plataforma HiSeq 2000 (Illumina) para alcançar o objetivo de se desenvolvimento novos marcadores moleculares (sobretudo microssatélites) para espécies de piracema de grande importância e de interesse nas estações ambientais do rio Grande e do rio São Francisco, MG. 5. DESCRIÇÃO DO RESULTADO 5.1. TIPO DE RESULTADO Este projeto isolou centenas de milhares de novos potenciais marcadores de DNA microssatélite, além de validar dúzias de novos marcadores genéticos para peixes de piracema. Aqui foi elucidado um grande volume de dados pioneiros, nunca antes obtidos, do genoma de quatro espécies de peixes Neotropicais de piracema de grande importância nas atividades de estações ambientais da CEMIG, para as bacias do rio Grande e São Francisco. Estes resultados permitiram o isolamento de uma coleção inédita de centenas de milhares de novos loci microssatélites espécieespecíficos para estes peixes, que certamente terão grande sucesso na taxa de transferência heteróloga para muitas espécies próximas. A identificação de regiões do genoma com sequências repetitivas curtas de microssatélites (loci do Latim, plural de locus ou local) permite a delimitação de sequências de DNA flanqueadoras, para o desenho de oligonucleotídeos iniciadores (primers) da PCR, a reação em cadeia da polimerase. Uma vez desenhado um par de primers específicos para cada locus, dizemos ter isolado e caracterizado um novo microssatélite. A partir destes dados, 8

9 podemos construir os primers e testá-los empiricamente em ensaios moleculares para a validação de polimorfismo (presença de variação populacional) e comportamento mendeliano. A quantidade de dados gerados nesta pesquisa, graças ao advento de NGS, resultou em um volume de informação que demandará anos de esforço de pesquisa e testes (ou colaboração científica em rede) para seu total aproveitamento. A Tabela 1, a seguir, sumariza os resultados do estudo genômico efetuado através de Sequenciamento de Nova-Geração (NGS) para quatro espécies de piracema de interesse na produção e utilização por pisciculturas voltadas à atividade de peixamentos. A inclusão da espécie Prochilodus lineatus, a principal espécie para a pesca na bacia do alto rio Grande, se deve à oportunidade oferecida pela adoção da técnica de NGS como abordagem rápida, economicamente viável e acessível e de altíssimo rendimento. A tentativa da inclusão de Leporinus obtusidens não foi bem sucedida. Esta é a espécie irmã de L. piavussu, sendo aquela recém-redescrita e esta descrita pela primeira vez em Britski et al. (2012) e endêmica do alto rio Grande. Ambas são quasi-crípticas e eram identificadas como L. elongatus ou L. obtusidens sendo utilizadas nas pisciculturas das estações ambientais. Muitos marcadores de uma espécie, porém, poderão ser aproveitados na outra. Tabela 1: Resultados obtidos por NGS para quatro espécies de piracema de importância ambiental. M=Mega (x 10 6 ) e G=Giga (x 10 9 ). O parâmetro de qualidade Q 20 indica a existência de no máximo um erro a cada 100 pares de base de DNA. Seq.=Sequências curtas de 90 pb. Espécie Conteúdo GC (%) Qualidade (% com Q 20 ) Produção de informação genômica Seq. Bases (M) (G) Número de novos microssatélites S. brasiliensis 41,05 97,44 178,08 16, L. piavussu 40,33 98,69 169,3 15, B. orbignyanus 41,11 97,73 178,21 16, P. lineatus 36,84 97,7 241,8 21, Os dados gerados serão disponibilizados ao público, de comum acordo com a CEMIG, por meio de publicações científicas específicas e bases de dados especializadas. As tabelas com os marcadores selecionados por bioinformática para testes em três das espécies estão apresentadas no Anexo I. O Anexo II apresenta a produção científica oriunda do projeto. Já o Anexo III contém os painéis de centenas de milhares de novos microssatélites para as quatro espécies da Tabela 1. Novos marcadores validados para S. brasiliensis e P. lineatus serão alvo das dissertações de mestrado das duas alunas atualmente matriculadas na Pós Graduação em Biotecnologia da UFSJ. Novos marcadores para Brycon orbignyanus Foi obtida uma lista com microssatélites perfeitos com primers em piracanjuba, um peixe ameaçado de extinção, sem descrição científica de marcadores microssatélites homólogos (i.e. espécie-específicos) na literatura. Destes, pouco mais de são do tipo dinucleotídeo. Um processo de seleção bioinformática dos candidatos foi feito para otimizar a probabilidade de encontro de loci polimórficos, segundo critérios apresentados em Brandström e Ellegren (2008), favorecendo números maiores de repetições (acima de 15) e favorecendo-se motifs (temas) repetitivos maiores. Microssatélites com menor conteúdo CG também tem maior probabilidade de polimorfismo. Isso resultou no ordenamento e na polimerização de cerca de 50 pares primers candidatos a teste. Destes cerca de 50 testados, 29 marcadores obtiveram bons resultados (com banda nítidas, amplificações consistentes e polimórficas). Os 21 restantes não apresentaram padrões satisfatórios e foram temporariamente preteridos, para análises posteriores. Já os 29 marcadores escolhidos, sofreram ajustes finos em condições de (principalmente concentração de Taq DNA polimerase e temperatura de anelamento), para a obtenção de melhor qualidade de padrão de bandas amplificadas. Após encontrada a temperatura ótima de cada marcador, foram feitas PCR de um amostra de população e os géis foram submetidos à eletroforese, por 15 horas, à 3,5 V/cm. Os novos marcadores homólogos para B. orbignyanus e seus primers são apresentados na Tabela 2. 9

10 Tabela 2: Marcadores validados para B. orbignyanus. São apresentados os motifs de repetição, a classe di-, tri- ou tetranucleotídeos e as sequências de iniciadores (primers), determinadas no estudo (todas as sequências são apresentadas no sentido 5-3 ), necessárias para sua aplicação. Locus motif Tipo Iniciador (primer) Direto Iniciador (primer) Reverso Borb01 ATCT Tetra tctgtctatctatctgcctatctgttga aggaggcatagtggtagcatgtag Borb04 ATAG Tetra ttgtgaactatgattccaactgtatgtc ggcctcataaccctttcctaactt Borb06 ATT Tri aggtgggtcttcaattattagcaa gcaacaataaacacaacaataatgct Borb07 ATA Tri tcagtgctctgtgtgcatttttatt aaggaagtttaatgttgccaaacg Borb08 ATT Tri aggaagcggagaaatgtgtattga gggaacatgataaaagtgctgcat Borb09 AAT Tri tttaactccttcagtctgcacagc gtgcgcctacaaataaacagaaca Borb11 ATT Tri tcaccaaccaacagaaaacacaat catctgaggcctgtttggtcttat Borb12 ATT Tri cagatgttattacacgttttgttgcac tgtgagtgtttgtgagtgtttgtga Borb13 ATT Tri acatatggtcatattgcccacacc tgctccaacataatacacaaaatgatg Borb14 ATC Tri tcccaaaataatgactcagcagaa tagcctctctcacagaacaatgga Borb15 ATT Tri cgtagcctcattgtgtagcatagc gccatcactacagtcttttaaccca Borb16 AAT Tri gcacgaaccaatactaggaaatgc tgtaacaaagaaacacactgtcagctc Borb17 ATA Tri tcaaaaagcaaaaagtttaaaacat atgtggaataaagggcaagacaaa Borb18 ATT Tri aaaggcacagtagcaaaagtctgtt aacgtctcgtgagtgtcatctgag Borb21 CA Di agaggcggagaggagatctaaga gttgccaaggagacagcagagt Borb24 AC Di gaaagcttactgttggtcagaggg gctccagtaacttgtacatttgcg Borb25 AC Di cagcagtgattgagtagtcatggg cctgctctccacagagggttatta Borb28 CA Di ccctccttttcttccttgctttat gcttttgattacaggagcatggat Borb29 AC Di cactgtatgcggagcaatttactg tgtacacctacagttgtgtttgtgttg Borb30 CA Di cactgcatatgtccaaactgaactt gctctgtgttccagacaggatct Borb33 AC Di ccaaccagctgagtcagtcagta gctctatggctctatgttctaacgc Borb34 AC Di agcccaacacagcaacagaaa ctttcagccctactcccacg Borb35 AG Di gggcgttaaaacgtaaaactcagtc ctttacgtctctcactcacttgcg Borb36 AG Di ggaaagagaaaaggggagaaga catgccctctttctaggtgagttc Borb38 CA Di actgacagacagagcactcacact aagtagcttgtctggttgcaaagg Borb39 AC Di cataatcgctccagtgcttactca ttagaacaaatacgcttggctcaac Borb43 AC Di agagaaacggcccttcaggat aagcttttctccaaacgtccctat Borb44 AG Di ccaacaacgactccatttacacac attcatggattctcttctcctccc Borb46 CA Di atgcgtaaccctgatctagcaatg tgtcaaaatgtgtgcctttctatgtt Os marcadores selecionados nos testes preliminares foram submetidos à PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) em uma amostra populacional contendo 49 indivíduos da espécie B. orbignyanus. Para cada marcador foi ajustado a temperatura de anelamento, correspondente à temperatura ótima de ação do par de primers (Tabela 3). Cada marcador expressou um faixa de tamanho de banda (Tabela 3) pares de base (pb)- sendo possível analisar o tamanho dos fragmentos de cada locus. A Figura 1 mostra um painel com exemplos dos 29 marcadores estudados, mostrando um exemplo de gel de cada marcador polimórfico. Os tamanhos de banda estimados foram gerados através do software GelAnalyzer, onde as análises de todas as imagens digitais de géis foram realizadas. Os tamanhos em pares de base (pb) foram estimados com o auxílio do marcador de peso molecular, de tamanho conhecido. Através do tamanho dos fragmentos encontrados foi possível identificar e diferenciar os diferentes alelos de cada locus. O valor estimado em pares de base foi transferido para uma tabela dinâmica do Excel, desenvolvida para realizar a binagem do locus em estudo. A binagem consiste em separar e contabilizar o número de bandas correspondentes em cada locus, identificando-os e diferenciando-os uns dos outros, gerando, dessa forma, classes de diferentes alelos de cada marcador (Tabela 3). 10

11 Figura 1: Painel com exemplos de amplificações em 19 indivíduos em cada locus polimórfico desenvolvido neste projeto. 11

12 Tabela 3: Loci validados com as respectivas temperaturas de anelamento correspondentes, tamanho de fragmentos encontrados em 49 peixes e número de alelos. Locus Temperatura de Tamanho do Número de anelamento fragmento (pb) alelos Borb01 61 C Borb04 62 C Borb06 61 C Borb07 62 C Borb08 63 C Borb09 62 C Borb11 60 C Borb12 63 C Borb13 64 C Borb14 62 C Borb15 64 C Borb16 60 C Borb17 62 C Borb18 63 C Borb21 63 C Borb24 62 C Borb25 63 C Borb28 62 C Borb29 63 C Borb30 62 C Borb33 62 C Borb34 63 C Borb35 63 C Borb36 64 C Borb38 62 C Borb39 62 C Borb43 62 C Borb44 62 C Borb46 62 C A tabela dinâmica do Excel gera, também, os dados de entrada para o GenePop. Este programa utiliza os dados obtidos na binagem e nos oferece uma inferência sobre o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), o déficit de heterozigotos ou excesso de heterozigotos, através do uso de testes exatos para inferência estatística (teste de hipóteses). Tais valores de probabilidade são apresentados na Tabela 4, para cada locus. 12

13 Tabela 4: Valores de probabilidade (p) para Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Valores de significância foram ajustados em α=0, Um asterisco (*) indica valores significativos após a correção de Holm-Bonferroni. Locus Teste exato Déficit de Heterozigose Borb01 0,0000* 0,0004* 0,9996 Borb ,5849 Borb06 0,0000* 0,0023 0,9977 Borb07 0,0000* 0,0000* 1 Borb08 0,0000* 0,0001* 0,9999 Borb09 0,0144 0,4149 0,5910 Borb11 0,0000* 0,0013 0,9987 Borb12 0,0055 0,0032 0,9968 Borb13 0,0000* 0,0133 0,9866 Borb14 0,0084 0,0334 0,9666 Borb15 0,0000* 0,0000* 1 Borb16 0,0000* 0,0022 0,9978 Borb17 0,0008 0,0009 0,9991 Borb18 0,0000* 0,0000* 1 Borb21 0,0000* 0,0013 0,9987 Borb24 0,0061 0,0048 0,9953 Borb25 0, ,0004 Borb28 0,0000* 0,0115 0,9885 Borb29 0,0000* 0,0011 0,9989 Borb30 0,0000* 0,0000* 1 Borb33 0,0109 0,6484 0,3519 Borb34 0,0030 0,8212 0,1859 Borb35 0,0049 0,0054 0,9946 Borb36 0,0003* 0,0062 0,9939 Borb38 0,1069 0,0846 0,9154 Borb39 1 0,7360 0,6879 Borb43 0,0096 0,0136 0,9864 Borb44 0,0092 0,1687 0,8340 Borb46 0,0000* 0,0000* 1 Excesso de Heterozigose Um marcador é considerado em equilíbrio (panmixia), quando possui valor não-significativo de probabilidade (p). Conforme a correção de Holm-Bonferroni (para controle da taxa de erro estatístico Tipo I, sem comprometer, ao mesmo tempo, a taxa de erro Tipo II), o valor fixado para significância de p foi de 0,00078, Sendo assim, apenas marcadores com p menor que este valor foram considerados fora do EHW. Marcadores heterólogos para as espécies do projeto Marcadores heterólogos são marcadores originalmente isolados em espécies próximas às espécies de interesse, com potencial de aproveitamento em reações de cruzada, O projeto explorou diferentes marcadores isolados para peixes Neotropicais relacionados as espécie-alvo da pesquisa e aqui apresentamos um sumário (Tabela 5) dos marcadores com maior potencial de utilização (os que resultam em amplificações polimórficas), Alguns marcadores heterólogos polimórfico podem ser pouco aconselháveis, ainda que polimórficos, por poderem segregar alelos nulos (alelos não-amplificáveis na PCR), Note que a espécie de piapara usada para os testes heterólogos foi L, obtusidens, espécie-irmã de L. piavussu. 13

14 Tabela 5 Lista de marcadores heterólogos testados no projeto: resultados de loci apresentados em negrito e com um asterisco (*) foram considerados úteis nas respectivas espécies-alvo após análise de polimorfismo, Outras amplificações indicam amplificações inconsistentes, inespecíficas ou monomórficas, Família Espécie (Referência) Brycon hilarii (Sanches e Galetti, 2006) Brycon opalinus (Barroso et al, 2003) Bryconidae Bryconidae Locus Anostomidae Brycon Salminus Leporinus orbignyanus brasiliensis obtusidens Amplificação Amplificação Amplificação Amplificação Bh5 Amplificação - * Amplificação Bh6 Amplificação - * Bh8 Amplificação Amplificação - Amplificação Bh13 Amplificação - * Bh15 Amplificação Amplificação - Amplificação Bh16 Amplificação - * Bh17 Amplificação - Amplificação BoM1 - * Amplificação BoM2 Amplificação - * BoM5 Amplificação - Amplificação BoM6 - * BoM7 Amplificação - BoM12 Amplificação - 14

15 Salminus brasiliensis (Rueda et al, 2011a) Salminus hilarii (Silva e Hilsdorf, 2011) Salminus franciscanus (Agata et al, 2011) Amplificação BoM13 - * Sm10 Amplificação Amplificação - Sm16 Amplificação - Sm17 Amplificação - Sm23 Amplificação Amplificação - Amplificação Sm25 Amplificação - * Sm33 Amplificação Amplificação - Sm37 Amplificação Amplificação - Sm41 Amplificação Amplificação - Amplificação Sh01 Amplificação - * Sh05 Amplificação Amplificação - Sh10 Amplificação - Sh12 Amplificação Amplificação* - Sh16 - Sh49 Amplificação - Sh56 Amplificação Amplificação - Sh65 Sh85 Amplificação Amplificação Amplificação Amplificação - - Sfra 02 Amplificação - Sfra 03 Amplificação Amplificação* - Sfra 04 Amplificação * Amplificação - Sfra 05 Amplificação Amplificação - 15

16 Prochilodus lineatus (Yazbeck e Kalapothakis, 2007) Prochilodus lineatus (Rueda et al, 2011b) Sfra 10 Amplificação - Sfra 11 Amplificação - - Sfra 13 Amplificação Amplificação - Sfra Sfra 15 Amplificação Amplificação - Sfra 18 Amplificação - - Pli30 - Pli34 - Pli35 - Pli43 - Amplificação Pli60 - Pli61 - Amplificação PL3 - Amplificação PL9 - Amplificação PL14 - Amplificação PL23 - Amplificação PL25 - Amplificação PL28 - Amplificação PL34 - Amplificação 16

17 Leporinus macrocephalus (Morelli et al,, 2007) PL35 - PL64 - PL119 - Amplificação PL139 - PL190 - PL216 - Amplificação* Lmac Amplificação* Lmac Amplificação Lmac Amplificação* Lmac Amplificação* Lmac Amplificação* Lmac Amplificação Lmac Amplificação Lmac Amplificação* 5.2. ESTÁGIO DA CADEIA DE INOVAÇÃO Pesquisa básica dirigida. Foram gerados dados genéticos sobre peixes de piracema para quatro espécies de interesse nas operações ambientais da CEMIG. Os dados gerados agora podem ser prontamente aplicados em medidas de manejo e estudos sobre a variabilidade genética da ictiofauna, bem como podem ser explorados para potencial em desenvolvimento de tecnologias visando a produção comercial (não-conservacionista) destes peixes. Por outro lado, alguns resultados já foram explorados do ponto de vista de desenvolvimento de tecnologia, a partir de dados do estado da arte, aplicados de forma inédita como teste de identificação molecular baseado em PCR (sem necessidade de sequenciamento de DNA) para B. orbignyanus. 6. METODOLOGIA O Laboratório de Recursos Genéticos, pioneiramente, atuou trabalhando na elaboração via NGS de novos marcadores microssatélites para as espécies-alvo do projeto e realizou ensaios utilizando 17

18 técnicas de sequenciamento de DNA de nova geração, que são capazes de otimizar a busca de sequências potenciais para o desenvolvimento de marcadores de microssatélites para as espéciesalvo deste projeto. Foi empregada a plataforma Illumina HiSeq 2000 (sob cuidados da Síntese Biotecnológica, Belo Horizonte) para produção de dados pareados de 90 pb em bibliotecas de fragmentos de 500 pb de DNA genômico de um indivíduo de cada espécie, tombados na coleção do Banco de DNA da Ictiofauna do alto Rio Grande (UFSJ). O DNA genômico total foi extraído com kit comercial Wizard (Promega), segundo instruções do fabricante. Os dados gerados foram usados para montagem de novo (i.e. sem genoma de referência) usando o programa SOAPdenovo 2 (Luo et al., 2012), seguido pela busca de microssatélites perfeitos de di- a hexa-nucleotídeos, com SSRIT (Temnykh et al., 2001) e desenho de primers com Primer3 (Untergrasser et al., 2012). Um procedimento de sorteio dos loci resultantes foi efetuado utilizando-se critérios para maximização de encontro de marcadores polimórficos, segundo expectativas apresentadas em Brandström e Ellegren (2008). Os 50 candidatos com maior posição no ranking de seleção, para cada espécie, foram selecionados para este estudo. Os primers candidatos foram então sintetizados aos cuidados da Molecular Brasil (Belo Horizonte). Para a realização das análises preliminares e populacionais, primeiramente foi feita a extração de DNA de amostras de nadadeira caudal, coletados dos peixes dos planteis de reprodução nas estações de piscicultura de Itutinga (em Itutinga, MG), utilizados para programas de peixamento da CEMIG, por meio do método de Chelex/Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)/Proteinase K, que consiste na preparação de uma mistura de resina Chelex 5% e 0,1% de SDS, Uma alíquota de 0,2 ml dessa mistura foi colocada em tubos de 1,5 ml, contendo os fragmentos das nadadeiras com cerca de 5mm2, previamente identificados. Em seguida, cada tubo, recebeu 0,02 ml de proteinase K (10mg/ml). Após a adição da proteinase K os tubos foram submetidos a forte agitação (vortex) durante 10 segundos, e, em seguida, centrifugados a rpm (17 x G), por 2 minutos. Ao final do processo as amostras foram incubadas à temperatura de 56 C por 30 minutos e, na sequência, serão incubadas a 98 C por 8 minutos. Em seguida serão submetidas a forte agitação (vortex) por 10 segundos e centrifugadas a rpm (17 x G). As amostras foram então diluídas em 1:10 em água ultra pura e armazenadas à 4 C, e foram posteriormente utilizadas para nas reações de PCR. Testes preliminares de (PCR) foram realizados com sete indivíduos de cada espécie, utilizando os novos primers desenvolvidos pelo projeto, e foram verificados os perfis de bandas geradas (monomórficas, polimórficas ou amplificações inconsistentes) em géis de poliacrilamida submetidos à eletroforese. Em seguida, foram feitos testes de gradiente de temperatura de anelamento para os conjuntos de primers que apresentaram perfis polimórficos (de nosso interesse), e foi feita a otimização da temperatura de anelamento para cada conjunto de primer. As amplificações dos primers que se encontraram em boas condições (padrão de bandas com boa qualidade) foram submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR) populacional, com cerca de 49 indivíduos de cada espécie. As PCRs foram realizadas em um volume total de 10 μl, contendo 2 unidades de polimerase de DNA Taq, 5 mm de MgCl 2, 10 μm de cada primer e tampão contendo 10 mm de Tris-HCl e 50 mm de KCl, As reações foram colocadas em um termociclador para a realização da PCR. O termociclador foi programado em três etapas: (1) desnaturação da dupla-fita de DNA, à 94 C por 4 minutos; (2) ciclos programados para cada primer, sendo o primeiro passo à 94 C por 30 segundos, o segundo passo à temperatura de anelamento do primer utilizado - variando de 58 C a 66 C por 30 segundos e o terceiro passo à 72 C por 30 segundos (essa etapa se repete 30 vezes); (3) alongamento das fitas de DNA, com a temperatura de 72 C por 5 minutos, que é a faixa de temperatura ótima para o trabalho da polimerase de DNA polimerase Taq. Após a PCR, são aplicados 3 μl de tampão contendo azul de bromofenol (0,25%) e sacarose (40%) em cada amostra individualmente, para auxiliar na visualização da aplicação no gel e no andamento da corrida do gel. Em seguida, as amostras foram aplicadas em géis de poliacrilamida (10%), e submetidas à eletroforese para separação dos fragmentos. Após a corrida de 15 horas, a 70 V (3,5 V/cm), os géis foram corados com uma solução de 0,005% de brometo de etídeo (a partir do estoque a 10 mg/ml), onde permaneceram por 20 minutos. Após o banho na solução de brometo de etídeo, os géis passam por uma lavagem em água ultra-pura, permanecendo também por 20 minutos, para tirar o excesso de brometo que fica no gel. Decorridos os 20 minutos, os géis foram colocados em um transiluminador, recebendo luz ultravioleta (comprimento de onda entre 380 e 420 nm). O tamanho das bandas em pares de base (pb) foram estimados com o auxílio de um marcador de peso molecular já conhecido. Os géis foram fotografados, editados em programas de fotos (ajustando o brilho e contraste das imagens) e analisados utilizando um software livre - GelAnalyser (Lazar, 2010), onde são definidas as colunas de cada indivíduo, determinadas as bandas, corrigidas distorções no gel e quantificados os números de pares de bases presentes em cada banda/alelos, Os alelos gerados são copiados para uma tabela dinâmica para ser realizada a binagem manual, com a ajuda de histogramas. A binagem consiste na alocação de bandas à classes de diferentes alelos, podendo, assim, determinar a 18

19 frequência de determinado alelo na população. Após a binagem, os resultados foram processados por outro software livre - GenePop (versão 4,1,4, Rousset, 2008) que testa as amostras quanto ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) para cada locus, Quando fora do equilíbrio, os resultados foram avaliados quanto ao déficit e excesso de heterozigotos. Valores de significância foram ajustados com um procedimento de Holm-Bonferroni para testes múltiplos. 7. ORIGINALIDADE 7.1. FATOR INOVADOR PRINCIPAL Os produtos (oligonucleotídeos espécie-específicos) almejados pelo presente projeto são completamente inéditos para as espécies-alvo. Os marcadores espécie-específicos (i.e. homólogos) são superiores em desempenho e resolução aos heterólogos e potencialmente servirão inclusive para o desenvolvimento de sistemas de identificação de material biológico espécie-específica, sexagem e certificação de procedência. A conclusão bem sucedida do projeto constituiu em um grande avanço no desenvolvimento de ferramentas para a gestão de boas práticas ambientais e de produção em relação à ictiofauna das bacias e pisciculturas associadas às UHEs e colocará o Brasil em patamares tecnológicos aplicados já em prática em países como Canadá, EUA e Japão. A quantidade de marcadores encontrados para cada espécie de interesse (dezenas de milhares) nunca foi descrita na literatura sobre peixes Neotropicais que, até o momento, explorou exclusivamente métodos tradicionais de isolamento de microssatélites (sensu Zane et al., 2002). Esse trabalho foi pioneiro no uso de NGS para isolamento de quantidades massivas de marcadores microssatélites potenciais para as espécies-alvo, otimizando os gastos e maximizando os resultados. Foram desenvolvidas análises computacionais que criaram formas de avaliação da eficiência de uso de estimadores estatísticos para genética de populações (jackknife para riqueza alélica de loci microssatélites). Foi elucidado o primeiro genoma mitocondrial completo para os peixes Anostomidae (resultado spin off do projeto). Isso implica na caracterização de toda a sequência de DNA mictocondrial do peixe (L. piavussu), a identificação e anotação funcional de 37 genes, mais a região controle de replicação. Isso gerou um depósito na base mundial de dados genéticos GenBank. As sequencias de microssatélites isolados no projeto serão depositadas em repositórios de informações genômicas para a conservação. Em relação ao estado da arte, o presente projeto viabilizou um salto quantitativo no número de marcadores microssatélites para espécies que já tinham alguns marcadores recém-descritos. Apenas para uma espécie (piracanjuba), isolou-se um número de marcadores que pode ser comparado com a soma de vários marcadores já descrito em várias espécies de piracema de uma só vez BUSCA DE ANTERIORIDADE Até o melhor de nosso conhecimento, não foram publicados trabalhos com uso de NGS no desenvolvimento de microssatélites de peixes Neotropicais de piracema quantidades significativas. Todos os trabalhos de isolamento e caracterização de microssatélites de peixes de piracema (e.g. Barroso et al., 2003; Sanches e Galetti, 2006; Yazbeck e Kalapothakis, 2007) foram feitos com técnicas classificadas como tradicionais (segundo Zane et al. 2002). Durante o desenvolvimento do projeto, os primeiros marcadores espécie-específicos para o dourado (S. brasiliensis, S. franciscanus) foram descritos na literatura (Rueda et al., 2011a e Agata et al., 2011), assim como para tabarana (S. hilarii Silva e Hilsdorf, 2011). Novos marcadores para P. lineatus foram descritos em Rueda et al. (2011b). Estes trabalhos não foram com uso de NGS e, portanto, descrevem uma quantidade relativamente limitada de loci marcadores (e.g. até cerca de 12). Uma busca de anterioridade feita para verificação de novidade quanto ao processo de identificação molecular de material de B. orbignyanus não encontrou tecnologia descrita nos bancos de patentes e literatura científica (e.g. Web of Knowledge). Isso motivou a os membros envolvidos da equipe a solicitar um pedido de privilégio de invenção (pedido de patente) junto ao INPI, visando o potencial de uso na criação comercial desta espécie (Número do registro: BR ) FATORES DE INOVAÇÃO COMPLEMENTARES O aspecto inovador complementar do projeto se caracteriza pela aplicação pioneira de novas 19

20 tecnologias (enquanto método) ao processo de isolamento e caracterização de novos marcadores moleculares de DNA microssatélites. O uso de NGS tem revolucionado as diversas frentes de pesquisa genética e foi aplicada aqui com êxito. Isso garantiu a geração de um volume de dados antes inimaginável e muito acimas das expectativas iniciais do projeto. 8, APLICABILIDADE 8.1. Aplicação na Cemig São muitas as aplicações de marcadores de DNA microssatélites no gerenciamento ambiental da ictiofauna de reservatórios de UHEs (Usinas Hidrelétricas), em pisciculturas e para as empresas do setor de energia elétrica: marcadores genéticos podem ser utilizados, por exemplo, na determinação da necessidade de implementação de MTPs (Mecanismos de Transposição de Peixes); na seleção de matrizes para formação de plantéis de piscicultura; na escolha de plantéis e estoques de peixamentos; na resolução de incertezas taxonômicas entre bacias hidrográficas; na determinação das unidades prioritárias de manejo ambiental (cardumes, linhagens, populações, espécies, bacia, localidade, etc,), levantamentos de espécies pela detecção genética em ovos e alevinos (que eventualmente detecta espécies raras, não contabilizadas por meios tradicionais); na determinação da variabilidade genética dos estoques de reservatórios e, em estágios mais avançados, podem ser usados para a identificação de genes de interesse econômico - QTLs - (ex, diretamente ligados ao tamanho do peixe) para guiar os tradicionais métodos de melhoramento animal por meio de seleção de cruzamentos de matrizes, Com a aplicação dessa tecnologia é possível determinar, por exemplo, o perfil genético de um plantel que será utilizado em atividade de peixamento e, posteriormente, obter uma estimativa numérica do sucesso da atividade no ambiente através da análise genética de populações utilizando os marcadores desenvolvidos, Isso permite uma quantificação econômica dos gastos da operação de peixamento, uma otimização deste processo e uma maximização dos resultados dessas operações, Uma das classes de marcadores moleculares mais difundidas nos estudos de variabilidade genética populacional aplicada à gestão da pesca e aqüicultura são chamados marcadores genéticos de DNA microssatélites (ou simplesmente microssatélites), A análise de microssatélites viabiliza, por exemplo, os exames de paternidade por DNA e investigação forense-criminalística em seres humanos, Esses marcadores têm sido amplamente utilizados nas ciências agrárias e biológicas na última década e constituem o estado da arte na análise e gerenciamento ambiental, Os marcadores de microssatélites, no entanto, necessitam ser isolados em cada espécie de interesse, ou triados a partir de trabalhos desenvolvidos em espécies próximas (ainda pouco descritos para peixes brasileiros), Esse trabalho é tecnicamente elaborado e intensivo, mas seu desenvolvimento é imperativo para um melhor entendimento da biologia das espécies-chave, de grande importância para os ecossistemas aquáticos, e com potencial de uso em programas de peixamentos desenvolvidos pelas estações de pisciculturas associadas às atividades de UHEs, O desenvolvimento desta tecnologia para peixes de importância regional tem o potencial de favorecer as atividades de pesca (artesanal, comercial e esportiva) nos rios e reservatórios de UHEs, favorecendo os meios de vida de populações ribeirinhas e colônias de pescadores e beneficiar a sociedade como um todo, em função de práticas ambientais responsáveis e corretas, Espécies de piracema como o dourado, a piapara e a piracanjuba são candidatas apropriadas para o isolamento de microssatélites dado seu potencial para atividades de pisciculturas, peixamentos de reservatórios de UHEs e visto sua importância na atividade pesqueira nas principais bacias de Minas Gerais, Estas espécies ainda carecem de estudos específicos de desenvolvimento de marcadores do tipo microssatélites, 8.2. Aplicação no setor elétrico Aplicação de marcadores de DNA microssatélites no manejo da ictiofauna de reservatórios de UHEs e pisciculturas em diferentes empresas de energia elétrica: determinação da necessidade de MTPs; seleção de matrizes de plantéis de piscicultura; escolha de plantéis de peixamento; determinação de unidades prioritárias de manejo ambiental (cardumes, populações, espécies, bacia, localidade, etc.); determinação da variabilidade genética de estoques de reservatórios; identificação de genes de interesse econômico (ex. diretamente ligados ao tamanho do peixe) para guiar os métodos tradicionais de melhoramento animal por meio de seleção de cruzamentos de matrizes; determinação do perfil genético de plantel de peixamento; obtenção de estimativa numérica do sucesso da atividade 20

21 ambientais; quantificação econômica dos gastos da operação de peixamento e otimização do processo e otimização de resultados dessas operações Verificação de funcionalidade A funcionalidade dos marcadores tem sido testada de forma empírica, em ensaios laboratoriais de e análise de material genético de amostras de populações de peixes de estoques de pisciculturas, atestando o sucesso (validação) do procedimento de isolamento e caracterização de loci microssatélite nas espécies de interesse. Marcadores para piracanjuba (os primeiros descritos de forma espécie-específica) já foram validados em um número significativo de marcadores (pelo menos 29), assim como marcadores para a espécie dourado (resultados em preparação e não apresentados). O procedimento NGS se mostrou extremamente eficiente e a taxa de resultados positivos, diante dos métodos de seleção bioinformáticas desenvolvidos pela equipe do projeto, foi bem acima do esperado. Por exemplo, em alguns organismos a taxa de microssatélites polimórficos no genoma pode ser inferior à 2%, sendo que temos encontrado uma taxa maior do que 50% e marcadores polimórficos após a seleção baseada em expectativas teóricas. O processo de validação envolve a de muitos indivíduos de peixes, a verificação de polimorfismos e do comportamento mendeliano dos marcadores, conforme verificado pelas expectativas do Equilíbrio de Hardy-Weinberg, permitindo o uso de ferramentas certificadas e de comprovada eficiência para o acesso direto a informações genéticas, de peixes, plantéis e espécies de piracema. Exemplos da aplicação populacional concreta dos resultados do projeto podem ser verificados na Figura 1 (acima na seção 5), onde é revelado o perfil genético de múltiplos peixes em um único ensaio de PCR, seguido de eletroforese. 9. RELEVÂNCIA 9.1. Relevância A conservação da ictiofauna nativa das bacias exploradas pelo seu potencial hidroelétrico é uma questão-chave para as geradoras de energia hidroelétrica e para a sociedade como um todo. Peixes desempenham um papel socioambiental importante e constituem um sistema frágil e sensível a mudanças impostas pela ação antrópica. Neste sentido, ações positivas são de grande importância para a preservação de recursos naturais. O projeto ofereceu uma oportunidade ímpar para a consolidação do Grupo de Pesquisas em Recursos Genéticos da UFSJ, permitiu a aquisição de material permanente para o laboratório, permitiu o treinamento de pessoal especializado na área de genética aplicada a ictiofauna além de ter fomentado a interação e a pesquisa com a universidade. Os resultados alcançados são de grande relevância e qualidade, permitindo aos participantes alcançarem produtos (publicações e comunicações) de perfil internacional, antes restritos apenas a grupos de ponta. Para a CEMIG, o projeto viabilizou o desenvolvimento de um extenso painel de novos marcadores microssatélites prontamente aplicáveis ao gerenciamento ambiental da ictiofauna afetada por UHEs e para produção de peixes visando a estocagem de rios e reservatórios. A possibilidade de uso de uma tecnologia de ponta como método, para alcance dos objetivos permitiu a inserção dos parceiros na vanguarda do uso de ferramentas moleculares para resolução de problemas práticos relacionados à gestão de UHEs e aplicação de medidas mitigatórias. Os resultados alcançados e têm o potencial de se desdobrarem em múltiplas ações concretas, bem como novos horizontes de pesquisa para capacitação de pessoal e desenvolvimento de protocolos de intervenções informadas e racionais sobre os sistemas de produção hidrelétrica e gerenciamento ambiental. Os painéis de microssatélites aqui apresentados irão alavancar tanto o poder de mitigação e o aumento da eficiência de ações de produção e estocagem de peixes de piracema, além de inaugurarem uma nova fase nas pesquisas genéticas básica e aplicadas nestas espécies, viabilizando, por exemplo, inéditos programas de melhoramento genético assistido por marcadores. A existência de níveis saudáveis de variabilidade genética para os peixes afetados por operações de UHE é essencial para a manutenção a médio e longo prazo dos cardumes nos rios. Além disso, o conhecimento sobre a estrutura genética populacional dos peixes pode trazer preciosas informações para guiar as coletas de matrizes e a escolha dos locais de peixamento e pontos para a transposição de peixes. Os marcadores aqui desenvolvidos poderão ser utilizados por outras companhias energéticas do país onde as espécies-alvo (ou espécies próximas) ocorrem. Os marcadores poderão, ainda, ser explorados para seu potencial tecnológico, visando a proteção de produtos ou processos para a produção comercial destas espécies. 21

22 9.2. Produção técnico-científica A seguir, a Tabela 6 apresenta as principais produções técnico científicas do projeto de P&D. Tabela 6: Produção do projeto de P&D. Ano Produto Título Autores Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico EVALUATION OF THE USEFULNESS OF A JACKKNIFE ESTIMATOR OF THE ALLELIC DIVERSITY IN POPULATION GENETICS THROUGH THE USE OF COMPUTER SIMULATIONS. HETEROLOGOUS AMPLIFICATION OPTIMIZATION FROM BRYCON HILARII MICROSATELLITES IN BRYCON ORBIGNYANUS. DESIGN OF A SET OF 'BEST GUESS' OLIGONUCLEOTIDE PROBES FOR THE GIANT EXTRACELLULAR HEMOGLOBIN OF GLOSSOSCOLEX PAULISTUS (HBGP) (OLIGOCHAETA, GLOSSOSCOLECIDAE): BIOINFORMATICAL ANALYSIS IN COMPARISON WITH LUMBRICUS TERRESTRIS HEMOGLOBIN (HBLT). IN: 58 CONGRESSO BRASILEIRO DE GENÉTICA, 2012, FOZ DO IGUAÇU. 58 CONGRESSO NACIONAL DE GENÉTICA, V. 1. P Érico Macedo Polo, Marcos Mendonça Passine, Gabriel de Menezes Yazbeck Gabriel de M. Yazbeck, Marcos Antônio da Silva, Érico Macedo Polo, Bárbara Rodrigues Nascimento, Rosiane de Paula Santos, Fausto Moreira da Silva Carmo Rosiane de Paula Santos, Érico Macedo Polo, Leonardo Marmo Moreira, Gabriel de Menezes Yazbeck Evento/ Revista/ Instituição 58 Congresso Brasileiro de Genética 58 Congresso Brasileiro de Genética 58 Congresso Brasileiro de Genética Nacional /Interna cional Nacional Nacional Nacional Contato autor principal ( ) gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br 22

23 2013 Resumo/ Informe técnico ABORDAGEM BAYESIANA DA ANÁLISE DO EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG EM PEIXES DA BACIA DO RIO GRANDE. IN: XII ENCONTRO MINEIRO DE ESTATÍSTICA, 2013, UBERLÂNDIA. Rosiane de Paula Santos, Marcos Antônio da Silva, Mariana Resende, Carla Regina Guimarães Brighenti, Gabriel de Menezes Yazbeck XII Encontro Mineiro de Estatística MGEST 2013 Nacional ufsj.edu. br Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico 2013 Patente 2013 Capítulo de livro IMPLEMENTATION OF A DNA BANK FOR THE FRESHWATER FISH FROM THE HIGH GRANDE RIVER BASIN. NEW HETEROLOGOUS MICROSATELLITE AMPLIFICATIONS IN BRYCON ORBIGNYANUS (ACTINOPTERYGII: CHARACIDAE), FOR THE USE IN POPULATION GENETICS MANAGEMENT, STUDIES AND SURVEYS. PROCESSO E KIT DE IDENTIFICAÇAO MOLECULAR, VIA PCR, DE MATERIAL BIOLÓGICO PROVENIENTE DE PIRACANJUBA (BRYCON ORBIGNYANUS). Estudos de diversidade e estrutura genética de populações de peixes neotropicais. Lucas Oliveira Costa, Rosiane de Paula Santos, Marcos Antônio da Silva, Fausto Moreira da Silva Carmo, Gabriel de Menezes Yazbeck Marcos Antônio da Silva, Fausto Moreira da Silva Carmo, Bárbara Rodrigues Nascimento, Érico Macedo Polo, Gabriel de Menezes Yazbeck Gabriel de Menezes Yazbeck, Fausto Moreira da Silva Carmo, Marcos Antônio da Silva Gabriel de Menezes Yazbeck, Tatiana Barroca 59 Congresso Brasileiro de Genética 59 Congresso Brasileiro de Genética Instituto Nacional de Propriedade Industrial A Genética dos Peixes Neotropicais Charleston: Amazon (ISBN: ) Nacional Nacional Nacional Nacional gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br 23

24 2013 Capítulo de livro APLICAÇÃO DE RECURSOS BIOINFORMÁTICOS PARA ANÁLISE DE DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE PEIXES NEOTROPICAIS Gabriel de Menezes Yazbeck A genética dos peixes neotropicais. 1ed. Charleston: Amazon (ISBN: ) Nacional gabriel@ ufsj.edu. br 2013 Resumo/ Informe técnico NOVEL HETEROLOGOUS AMPLIFICATION IN SALMINUS BRASILIENSIS FROM SALMINUS HILARII MICROSATELLITES. Bárbara Rodrigues Nascimento, Fausto Moreira da Silva Carmo, Marcos Antônio da Silva, Gabriel de Menezes Yazbeck 59 Congresso Brasileiro de Genética Nacional gabriel@ ufsj.edu. br 2014 Artigo Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico BIOINFORMATICAL DEVELOPMENT OF OLIGONUCLEOTIDES FOR THE D CHAIN GENE OF THE GIANT EXTRACELLULAR HEMOGLOBIN OF GLOSSOSCOLEX PAULISTUS. Towards the first complete mitochondrial genome of Leporinus obtusidens (Characiformes: Anostomidae), a recently redescribed piracema fish species. Tens of thousands of new microsatellite PAL revealed by NGS in three important piracema fish species: Salminus brasiliensis, Brycon orbignyanus and Leporinus obtusidens (Actinopterygii: Characiformes). Short sequence repeat cross-amplifications in Leporinus obtusidens (Characiformes: Anostomidae), tools for aquiculture and conservation in the High Grande River. Érico Macedo Polo, Rosiane de Paula Santos, Leonardo Marmo Moreira, Gabriel de Menezes Yazbeck RIBEIRO, J. M. ; OLIVEIRA, R. S. ; CARVALHO, M. B. ; CARMO, F. M. S. ; YAZBECK, G. M. CARMO, F. M. S. ; OLIVEIRA, R. S. ; RIBEIRO, J. M. ; VIANA, P. M. F. ; CARVALHO, M. B. ; YAZBECK, G. M. TEIXEIRA, Z. O. ; NASCIMENTO, B. R. ; CARVALHO, L. C. ; CARMO, F. M. S. ; YAZBECK, G. M. Internationa l Journal of Bioscience, Biochemistr y and Bioinformati cs (IJBBB, ISSN: ) 60º Congresso Brasileiro de Genética, Águas de Lindóia. 60º Congresso Brasileiro de Genética, Águas de Lindóia. 60º Congresso Brasileiro de Genética, Águas de Lindóia. Internaci onal Nacional Nacional Nacional gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br 24

25 2014 Resumo/ Informe técnico DNA barcodes of freshwater fish from a DNA bank from the High Grande River Basin SILVEIRA, K. R. ; RIBEIRO, J. M. ; SANTOS, R. P. ; CARMO, F. M. S. ; YAZBECK, G. M. 60º Congresso Brasileiro de Genética, Águas de Lindóia. Nacional gabriel@ ufsj.edu. br Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico Resumo/ Informe técnico Potentially amplifiable loci selection for polymorphic microsatellite markers generated from highthroughput DNA sequencing Bioinformatic characterization of intergenomic polymorphisms in SSR isolated by NGS for three Neotropical migratory fish Lack of population genetic structure among migratory fish physically segregated by dams in the Upper Grande River, Minas Gerais YAZBECK, G.M., OLIVEIRA, RIBEIRO, J.M., R.S.; VIANA, P.M.F.; CARMO, F.S.M E CARVALHO, M.B. CAPUTO, L.I.; RIBEIRO, J.M.; OLIVEIRA, R.S., CARVALHO, M.B. E YAZBECK, G.M. CARMO, F.M.S., VIANA, P.M.F.; SILVEIRA, K.R., CARVALHO, L.C. e YAZBECK, G.M. 3rd Internationa l Society for Computatio nal Biology Latin America X- Meeting on Bioinformati cs with BSB and SoiBio II Internationa l Symposium in Ecology and Evolution II Internationa l Symposium in Ecology and Evolution Internaci onal Internaci onal Internaci onal gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br gabriel@ ufsj.edu. br 2014 Artigo First complete mitochondrial genome for any anostomid fish: Leporinus piavussu, a recently described piracema species YAZBECK, G.M.; OLIVEIRA, R.S.; RIBEIRO, J.M.; CARMO, F.S.M e CARVALHO, M.B. Mitochondrial DNA Internaci onal gabriel@ ufsj.edu. br O trabalho EVALUATION OF THE USEFULNESS OF A JACKKNIFE ESTIMATOR OF THE ALLELIC DIVERSITY IN POPULATION GENETICS THROUGH THE USE OF COMPUTER SIMULATIONS foi agraciado pelo prêmio de 1 Lugar em Evolução, Genética e Melhoramento Animal, categoria Iniciação Científica (apresentação oral) do 58 Congresso Brasileiro de Genética, concedido ao bolsista CEMIG Érico Macedo Polo, Sociedade Brasileira de Genética. Os trabalhos de bioinformática DESIGN OF A SET OF 'BEST GUESS' OLIGONUCLEOTIDE PROBES FOR THE GIANT EXTRACELLULAR HEMOGLOBIN OF GLOSSOSCOLEX PAULISTUS (HBGP) (OLIGOCHAETA, GLOSSOSCOLECIDAE): BIOINFORMATICAL ANALYSIS IN COMPARISON WITH LUMBRICUS TERRESTRIS HEMOGLOBIN (HBLT) e BIOINFORMATICAL DEVELOPMENT OF OLIGONUCLEOTIDES FOR THE D CHAIN GENE OF THE GIANT EXTRACELLULAR HEMOGLOBIN OF GLOSSOSCOLEX PAULISTUS envolveram bolsistas do projeto, além de outros alunos e professor da UFSJ, e foi considerado um spin off uma vez que o método empregado nestas comunicações científicas poderia ser aplicado nos dados do projeto. 25

26 São esperados novos artigos neste e nos próximos anos dois anos ( ), com resultados oriundos direta ou indiretamente do projeto. A maioria trata da formalização, em forma de artigo, de comunicações apresentadas nos congressos. Novas comunicações para o Congresso Brasileiro de Genética deverão ser submetidas ainda em Capacitação profissional O projeto beneficiou diretamente sete pesquisadores juniores (graduandos) em atividade de Iniciação Científica, com bolsas do projeto. Além disso, uma estudante de graduação e uma do ensino médio foram agraciadas com bolsas da UFSJ, dentro do programa Primeiros Passos na Ciência. Dois bolsistas defenderam Trabalhos de Conclusão de Curso (TCCs ou monografias) sobre o tema na UFSJ (2013 e 2014) e mais duas bolsistas de mestrado (bolsa da UFSJ) são esperadas para defenderem dissertações de mestrado em 2016 e 2017 no Programa de Pós Graduação em Biotecnologia (PPGBiotec-UFSJ). Um doutor foi treinado em atividade de pesquisa de pós-doutoramento (Fausto M.S. Carmo), no âmbito do PPGBiotec-UFSJ. TCC 1: Marcos Antônio da Silva. Amplificações Heterólogas de Loci Microssatélites em Brycon orbignyanus (Characiformes: Characidae): Ferramentas uso no Monitoramento e Manejo Genético de Estoques Selvagens e de Piscicultura Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Zootecnia) - Universidade Federal de São João Del-Rei. Orientador: Gabriel de Menezes Yazbeck. TCC 2: Érico Macedo Polo. Avaliação da utilidade de um estimador jackknife da riqueza alélica em genética de populações por meio de simulações computacionais Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de São João Del-Rei. Orientador: Gabriel de Menezes Yazbeck. A formação de pessoal especializado em genética aplicada de peixes é de extrema importância para suprir o mercado com mão-de-obra qualificada e preparada para desafios específicos do setor de conservação e monitoramento ambiental ligado à temática da produção hidrelétrica. Neste sentido, consideramos o projeto muito bem sucedido Apoio à infraestrutura O Laboratório de Recursos Genéticos da UFSJ, situado no Campus Tancredo de Almeida Neves, foi implementado com recursos parcialmente fornecidos pelo presente projeto. O Laboratório possuía estrutura e equipamentos para trabalhos na área de biologia molecular e foi complementado com os itens adquiridos com recursos do projeto, conforme listado na Tabela 7. Tabela 7: Material permanente obtido com recursos do projeto. Qtd.=Quantidade. Equipamento Justificativa Qtd. Microondas em inox com prato giratório 30L - 110V Refrigerador 450L (~230L/130 congelador) Congelador horizontal padrão (não frost-free) ~520L - 110V Preparo de géis Conservação de amostras e reagentes Conservação de amostras e reagentes Tanque para nitrogênio líquido 20L Conservação de amostras e reagentes 1 Balança semi-analítica (até 500 g +/- 0,001) - 110V Preparo de soluções Banho-Maria para bancada, 4L até Condução de reações e tratamento térmico

27 60º C Banho-Maria e Gelo de Bancada a Condução de reações e tratamento térmico Seco (c/ blocos térmicos) - 110V 1 Agitador tipo vortex para tubos e Preparo de soluções microtubos - 110V - de 0 a 3000rpm 1 Agitador magnético com Preparo de soluções aquecimento, superfície de cerâmica 1-110V Peagâmetro (medidor de ph) para Preparo de soluções bancada 1 Tanque para água bi-destilada de Preparo de soluções polipropileno 50L com visor de nível 1 Sistema de purificação de água (Ultra Preparo de soluções pura I 72 L/h) 1 Sistema de eletroforese vertical para Separação de fragmentos de DNA acrilamida, gel de 20x20cm 2 Sistema de eletroforese horizontal gel Separação de fragmentos de DNA agarose, gel de 23x14cm 1 Sistema de eletroforese horizontal gel Separação de fragmentos de DNA agarose, ~10x10cm 1 Sistema de eletroforese vertical gel Separação de fragmentos de DNA acrilamida, gel 10x10cm 1 Fonte de Eletroforese 4000 V Separação de fragmentos de DNA 1 Fonte de Eletroforese 600 V Separação de fragmentos de DNA 1 Sistema de fotodocumentação Documentação de resultados 1 Termociclador gradiente de Condução de reações e tratamento térmico temperatura 1 Centrifuga refrigerada Condução de reações e tratamento térmico 1 Centrifuga spin Extração de DNA 1 Micropipetas multicanais (oito Preparo de soluções e reações canais) de volume variável (1 a 10 / 5 3 a 50 / 30 a 300 µl) Jogos de Micropipetas monocanais Preparo de soluções e reações de volume variável (3 pipetas cada jogo entre 0,5 e µl) com prateleiras e caixas de ponteiras 3 Pipeta repetidora (1) e conjuntos de Preparo de soluções e reações adaptadoras para seringas (2) de 10 a 1 27

28 5000 µl Instrumental de dissecação (bisturis, Extração de DNA pinças, etc) de metal inoxidável 1 Purificador de água por osmose Preparo de soluções e reações reversa 1 Autoclave vertical de bancada 23L Preparo e esterilização de material 1 Livro Molecular Cloning (Sambrook Manual de protocolos em laboratório de biologia et al.) - 3 volumes molecular Registro da propriedade YAZBECK, G. M.; CARMO, F. M. S.; SILVA, M.A. PROCESSO E KIT DE IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, VIA PCR, DE MATERIAL BIOLÓGICO PROVENIENTE DE PIRACANJUBA (Brycon orbignyanus). 2013, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: BR ,data de depósito: 11/09/2013, Instituição de registro: INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial. Instituições financiadoras: CEMIG, ANEEL, UFSJ. A tecnologia trata de um processo, composição e concretização em um kit para identificação molecular de material ictiológico (ovos, alevinos, amostra de água ambiental, filé de peixe, escamas, etc.) oriundo de B. orbignyanus. A tecnologia, no entanto, necessita de desenvolvimento e refinamento Descrição da relevância do impacto socioambiental O projeto possui grande relevância diante dos impactos e restrições socioambientais de sistemas de energia elétrica. As possibilidades socioambientais do projeto são diretas, uma vez que a ação propôs o desenvolvimento de tecnologias capazes de aumentar eficiência ambiental, mitigando e minimizando impactos, através da produção e estocagem de peixes, com maior grau de informação e capacidade de aferimento de eficiência. Isso levará a impactos ambientais positivos e, potencialmente, desenvolvimento de nova atividade socioeconômicas baseadas na pesca, produção e tecnologia. 10. RECURSOS EMPREGADOS Ao término do projeto foram usados recursos da CEMIG para o financiamento de bolsas de IC para pesquisadores juniores e de pós-doutorando (recursos humanos), compra de material permanente (equipamentos para laboratório de biologia molecular), compra de material de consumo (sobretudo reagentes, kits para biologia molecular e material de escritório), além de passagens e diárias (para apresentação de resultados do projeto), despesas com terceiros (para a execução do Sequenciamento de DNA de Nova-Geração) e despesas administrativas para gestão financeira do projeto (FAUF). A Tabela 8, a seguir, sumariza estes gastos. 28

29 Tabela 8: Recursos empregados pela CEMIG no projeto de P&D. RH=Recursos Humanos RUBRICAS Autorizado Gasto Devolução para CEMIG RH- Bolsa IC , ,00 0,00 RH- Bolsa Pós-Doc ,77* ,01 518,76 Viagens e Diárias 7.734, ,81 622,09 Mat. Consumo , ,05 151,59 Mat. Permanente , ,68 0,00 Serviços Terceiros , ,00 519,6 Desp. Administrativa , ,55 0,00 *O valor da Bolsa de Pós-Doc é de R$ ,00 (repassado pela CEMIG) + R$ 4.926,77 (devolvido pela FAUF ao convênio a título de valor pago de INSS/patronal. 11. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO (Mínimo de 2,000 caracteres + gráficos de cronograma) Cronograma físico previsto x Cronograma físico realizado O cronograma inicial previsto projetava as atividades para entre 04 de abril de 2011 até 04 de abril de Foi aditado um prazo até dia 04 de abril de A Tabela 9 mostra o cronograma previsto versus realizado. Tabela 9. Cronograma do projeto de pesquisa e desenvolvimento, previsto e realizado. Etapa Previsto Realizado Produção de biblioteca genômica de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de iniciadores descritos para espécies próximas Produção e triagem de biblioteca genômica de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de iniciadores descritos para espécies próximas, fase 1 Mês / ano Valor Mês / ano Valor 04/ ,63 07/ ,63 Produção e triagem de biblioteca genômica de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de iniciadores descritos para espécies próximas, fase 2 Produção e triagem de biblioteca genômica de dourado, piracanjuba e piapara, fase 3/ Teste de iniciadores descritos para espécies próximas + workshop 08/ ,52 05/ ,52 12/ ,64 01/ ,64 29

30 Caracterização de microssatelites - de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de ,52 05/ ,28 iniciadores descritos para espécies próximas, fase 1 Caracterização de microssatelites - de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de 08/ ,53 09/ ,81 iniciadores descritos para espécies próximas, fase 2 Caracterização de microssatelites - de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de 12/ ,74 02/ ,70 iniciadores descritos para espécies próximas, fase 3 + workshop Caracterização de microssatelites - de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de 04/ ,53 05/ ,57 iniciadores descritos para espécies próximas, fase 4 Caracterização de microssatelites - de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de 08/ ,52 07/ ,32 iniciadores descritos para espécies próximas, fase 5 Caracterização de microssatelites - de dourado, piracanjuba e piapara/ Teste de 12/ ,74 12/ ,91 iniciadores descritos para espécies próximas, fase 6 Workshop/inário com apresentação final de resultados 04/ / Total , , Justificativas para os desvios de cronograma O aditivo de prazo para término do projeto se deve a múltiplos fatores, como a articulação e seleção da equipe interna da UFSJ, atraso na compra de material permanente, dificuldade para encontro seleção de pós-doutorando com perfil adequado para a pesquisa, atrasos no cronograma físico de entrega de produtos e, principalmente, pelo volume e a natureza inédita de dados gerados no procedimento de NGS, que motivou a articulação de um grupo de estudos para o domínio dos conceitos e técnicas para análise e uso de dados de sequenciamento de DNA de nova-geração Consideramos que o aditivo foi essencial para o alcance dos resultados do projeto de pesquisa e desenvolvimento Ajustes realizados 30

31 Foi realizado um aditivo de 12 meses ao convênio para o término satisfatório das atividades, diante do volume e qualidade dos dados gerados no projeto de pesquisa e desenvolvimento e para compensar a demora inicial na seleção de um pós-doutorando com perfil adequado para a equipe Entregáveis do projeto com datas de conclusão Entregas: 1) Relatório técnico com revisão da literatura e lista de itens permanentes e de consumo necessários à execução do projeto : 13/07/2011 2) Relatório técnico com teste e padronização de marcadores microssatélites isolados em outras espécies próximas I 03/05/2012 3) Relatório técnico com teste e padronização de marcadores microssatélites isolados em outras espécies próximas II + Workshop 02/01/ /08/2013 4) Relatório técnico com teste e padronização de marcadores microssatélites isolados em outras espécies próximas III 02/05/2013 5) Relatório técnico com resultados dos procedimentos de padronização de PCR com os marcadores desenvolvidos no projeto até então para dourado, piracanjuba e piapara I 02/08/2013 6) Relatório técnico com resultados dos procedimentos de padronização de PCR com os marcadores desenvolvidos no projeto até então para dourado, piracanjuba e piapara II + Workshop 03/02/ e 07/02/2014 7) Relatório técnico com resultados dos procedimentos de padronização de PCR com os marcadores desenvolvidos no projeto até então para dourado, piracanjuba e piapara III 03/04/2014 8) Relatório técnico com resultados dos procedimentos de padronização de PCR com os marcadores desenvolvidos no projeto até então para dourado, piracanjuba e piapara IV 03/07/2014 9) Relatório técnico com resultados dos procedimentos de padronização de PCR com os marcadores desenvolvidos no projeto até então para dourado, piracanjuba e piapara V + Workshop 03/11/ e 27/03/2015 Datas das oficinas (workshops): 31 de agosto de 2013; 06 e 07 de fevereiro de 2014; e 26 e 27 de março de 2015 (UFSJ). 31

32 12. TRANSFERÊNCIA E DIFUSÃO TECNOLÓGICA DOS RESULTADOS DO PROJETO Os trabalhos produzidos, como resumos, foram publicados e apresentados em eventos nacionais de Genética (10 resumos e pôsteres, no total), inclusive rendendo um prêmio por melhor trabalho de Iniciação Científica na categoria Genética, Evolução e Melhoramento Animal em 2012, ao bolsista Érico Macedo Polo. Além destes, 01 trabalho foi publicado em evento regional de estatística e 03 comunicações (resumo e apresentação de pôster) foram feitas em dois eventos internacionais distintos (ver Tabela 5). Dois artigos científicos internacionais foram publicados, assim como 02 capítulos de livro. Um privilégio de invenção foi depositado junto ao INPI. Foram realizadas três oficinas técnicas e de capacitação e divulgação dos conhecimentos gerados no projeto. A primeira ocorreu dia 31 de agosto 2013, em São João del-rei (UFSJ), em caráter reduzido, com participação apenas da equipe do projeto. Nesta ocasião foram apresentadas palestras sobre marcadores moleculares, extração e eletroforese de DNA, ecologia molecular, programa peixe vivo e sistemática das espécies de interesse no projeto. Os apresentadores foram o coordenador, a aluna Bárbara R. Nascimento, o Prof. Andrey L.F. Castro, a técnica da CEMIG Miriam A. Castro e o aluno Marcos A. Silva. Já no ano seguinte, entre os dias 06 e 07 de fevereiro de 2014 foi realizadas a II Oficina sobre Peixes, Rios, Piscicultura e Marcadores Moleculares, na UFSJ, aberta ao público interno e externo à universidade, contando com diversos especialistas do estado e com adesão de cerca de 90 participantes, incluindo visita técnica à estação ambiental de Itutinga, MG. Foram feitas palestras sobre DNA e marcadores moleculares em peixes, sobre transposição de peixes, ecologia de peixes do rio Grande, Ações da CEMIG na área de peixes e larvicultura de peixes carnívoros, Os apresentadores foram o coordenador, o biólogo Raoni Rosa (UFMG), o biólogo Thiago Albuquerque (UFMG), a técnica da CEMIG Míriam A. de Castro e o Prof. Ronald K. Luz (UFMG). Em 2015, entre os dias 26 e 27 de março, foi realizado o I inário de Aquicultura Sustentável das Vertentes & III Oficina sobre Peixes, Rios, Piscicultura e Marcadores Moleculares, na UFSJ, contando com especialistas de Minas Gerais e com a adesão de mais de 150 pessoas. Foram proferidas palestras sobre peixes migratórios do rio Grande, ações do ministério da pesca e aquicultura em MG, peixes ornamentais, licenciamento ambiental, produção de rações, medidas de peixamentos, telemetria de peixes para estudos migratórios, métodos moleculares de identificação do pescado e DNA ambiental e os resultados do presente projeto. Dentre os participantes, destacamos o Prof. Paulo dos Santos Pompeu (UFLA), o biólogo Carlos Bernardo Mascarenhas-Alves (UFMG), o técnico da CEMIG João M. Lopes e o Prof. Daniel Cardoso Carvalho (PUC-MG). 13. RAZOABILIDADE DE CUSTOS Valores do projeto Os custos do projeto se justificam dado o gasto em recursos humanos e os custosos reagentes para biologia molecular. O volume de resultados gerados, porém, é sintoma do avanço tecnológico na genética moderna e o advento de NGS. Isso otimizou os gastos do projeto aumentando sua eficiência. Em função da contratação de serviço especializado de NGS, houve pedido de mudança de valores das rubricas, conforme mostrado na Tabela

33 Tabela 10: Valores do projeto de P&D. Valor RUBRICAS Aprovado RH- Bolsa I.C ,00 RH- Bolsa Pós-Doc ,00 Modificações 2.880,00 (Repasse Mat. Permanente) 4926,77 (Devolução conta convênio) ATUALIZADO , ,77 Viagens e Diárias 7.734,90 0, ,90 Mat. Consumo , , ,64 Mat. Permanente , , ,68 Serviços Terceiros 0, , ,60 Desp. Administrativa ,55 0, , Estudo de viabilidade econômica Apesar do custo tradicionalmente elevado para a caracterização de novos marcadores moleculares (reagentes de laboratório importados, necessidade de técnicos especializados, utilização de infraestrutura específica, etc.), uma vez desenvolvidos os mesmos podem ser utilizados com um custo bastante reduzido por indivíduo analisado (menos de R$ 10,00/peixe), o que viabiliza sua aplicação em projetos de monitoramento/manejo ambiental e de pisciculturas de larga escala e de longo prazo. Um sumário das metodologias tradicionais disponíveis para o desenvolvimento de marcadores moleculares microssatélites foi revisado em Zane et al. (2002), No entanto, nos últimos anos, uma nova classe de tecnologias, os métodos NGS (Metzker, 2010) viabilizaram o desenvolvimento rápido e economicamente acessível de marcadores moleculares (e.g. Castoe et al., 2012). A plataforma NGS utilizada no projeto, HiSeq 2000 (Illunina) tem a melhor relação custo-benefício do mercado (Liu et al., 2012). Os benefícios econômicos advindos da utilização desta nova tecnologia compensa em várias ordens de magnitude o investimento inicial de pesquisa e desenvolvimento (ex. mitigação de catástrofes ambientais, recuperação de áreas atingidas por grande mortandade de peixes, melhor planejamento e maior eficiência dos programas de peixamento, maior sustentabilidade da pesca regional, etc.). Em relação às atividades de pisciculturas e de peixamento, há a expectativa de grande impacto econômico positivo (redução e otimização de custos), bem como benefícios técnicos dessas atividades (maior eficiência de operação), Por exemplo, uma piscicultura de grande porte, onde os custos totais podem atingir até R$ /anuais, ou em uma operação de peixamento médio que pode custar cerca de R$ , deverá haver uma redução dos custos de produção de peixes e um aumento do sucesso das atividades, através da seleção e uso adequado de estoques mais propícios e vigorosos, implicando em maior eficiência, melhor relação custo-benefício dessas atividades. Portanto, se os marcadores moleculares implicarem em um aumento de 25% da eficiência das atividades de uma grande piscicultura, o valor investido no projeto (cerca de R$ ,00) será recuperado em pouco mais de um ano. A crescente demanda da sociedade por uma exploração mais racional e parcimoniosa dos recursos naturais requer o desenvolvimento e aplicação de novas tecnologias que sejam capazes de fazer frente aos desafios da gestão ambiental, para que a conservação seja mais eficiente e que sejam evitadas situações de degradação e incidência de passivos ambientais (multas). 14. BIBLIOGRAFIA AGATA, Kiyokazu; ALASAAD, Samer; et al. MOLECULAR ECOLOGY RESOURCES PRIMER DEVELOPMENT CONSORTIUM Permanent genetic resources added to Molecular Ecology Resources Database 1 December January Molecular Ecology Resources, v. 11, n. 3, p , BARROSO, R. M.; HILSDORF, A. W. S.; MOREIRA, H. L. M.; et al. Identification and 33

34 characterization of microsatellites loci in Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiforme, Characidae, Bryconiae). Molecular Ecology Notes, v. 3, n. 2, p , BRANDSTRÖM, Mikael; ELLEGREN, Hans. Genome-wide analysis of microsatellite polymorphism in chicken circumventing the ascertainment bias. Genome Research, v. 18, n. 6, p , BRITSKI, Heraldo A.; BIRINDELLI, José Luís O.; GARAVELLO, Julio Cesar. A new species of Leporinus (Agassiz, 1829) from the upper Rio Paraná basin (Characiformes, Anostomidae) with redescription of L. elongatus (Valenciennes, 1850) and L. obtusidens (Valenciennes, 1837). Papéis Avulsos de Zoologia (São Paulo), v. 52, n. 37, p , CASTOE, Todd A.; POOLE, Alexander W.; DE KONING, A. P. Jason; et al. Rapid microsatellite identification from Illumina paired-end genomic sequencing in two birds and a snake. PloS One, v. 7, n. 2, p. e30953, LAZAR, Istvan. GelAnalyzer.com - Welcome. < >. Acesso em: 19/maio/2015. LIU, Lin; LI, Yinhu; LI, Siliang; et al. Comparison of next-generation sequencing systems. Journal of Biomedicine & Biotechnology, v. 2012, p , LUO, Ruibang; LIU, Binghang; XIE, Yinlong; et al. SOAPdenovo2: an empirically improved memoryefficient short-read de novo assembler. GigaScience, v. 1, n. 1, p. 18, METZKER, Michael L. Sequencing technologies - the next generation. Nature Reviews. Genetics, v. 11, n. 1, p , MORELLI, Karina A.; REVALDAVES, Eloisa; OLIVEIRA, Claudio; et al. Isolation and characterization of eight microsatellite loci in Leporinus macrocephalus (Characiformes: Anostomidae) and cross-species amplification. Molecular Ecology Notes, v. 7, n. 1, p , ROUSSET, François. genepop 007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux. Molecular Ecology Resources, v. 8, n. 1, p , RUEDA, E. C.; AMAVET, P.; BRANCOLINI, F.; et al. Isolation and characterization of eight polymorphic microsatellite markers for the migratory characiform fish, Salminus brasiliensis. Journal of Fish Biology, v. 79, n. 5, p , 2011a. RUEDA, Eva C.; SOMMER, Julie; SCARABOTTI, Pablo; et al. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in the migratory freshwater fish Prochilodus lineatus (Characiformes: Prochilodontidae). Conservation Genetics Resources, v. 3, n. 4, p , 2011b. SANCHES, Alexandra; GALETTI, Pedro Manoel. Microsatellites loci isolated in the freshwater fish Brycon hilarii. Molecular Ecology Notes, v. 6, n. 4, p , SILVA, Juliana Viana; HILSDORF, Alexandre Wagner Silva. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from Salminus hilarii (Characiformes: Characidae). Conservation Genetics Resources, v. 3, n. 3, p , TEMNYKH, Svetlana; DECLERCK, Genevieve; LUKASHOVA, Angelika; et al. Computational and Experimental Analysis of Microsatellites in Rice (Oryza sativa L.): Frequency, Length Variation, Transposon Associations, and Genetic Marker Potential. Genome Research, v. 11, n. 8, p , UNTERGASSER, Andreas; CUTCUTACHE, Ioana; KORESSAAR, Triinu; et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research, v. 40, n. 15, p. e115,

35 YAZBECK, Gabriel de Menezes; OLIVEIRA, Rafael Sachetto; RIBEIRO, José Mauro; et al. First complete mitochondrial genome for any anostomid fish: Leporinus piavussu, a recently described piracema species. Mitochondrial DNA, p. 1 2, YAZBECK, G M; KALAPOTHAKIS, E. Isolation and characterization of microsatellite DNA in the piracema fish Prochilodus lineatus (Characiformes). Genetics and molecular research: GMR, v. 6, n. 4, p , ZANE, L.; BARGELLONI, L.; PATARNELLO, T. Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology, v. 11, n. 1, p. 1 16, ANEXOS Anexo I Lista de primers selecionados com maior probabilidade de polimorfismo, para teste nas espécies do projeto. Anexo II Lista da produção científica do projeto. Anexo III Disco compacto óptico digital (CD) contendo painel de microssatélites. Mídia digital contendo o arquivo eletrônico de planilhas para Excel de título Microsats_UFSJ_Salminus_Leporinus_Brycon_Prochilodus.xlsx. Listas de loci microssatélites encontrados com a busca NGS para quatro espécies de peixes. As sequências de primers estão destacadas em cores, cada aba contém uma espécie diferente. Gerente do Projeto Coordenador da Equipe de Pesquisa Nome: João de Magalhães Lopes Nome: Gabriel de Menezes Yazbeck Assinaturas 35

36 Anexo I Lista de primers selecionados com maior probabilidade de polimorfismo, para teste nas espécies do projeto. Tabela AI-1 Pares de primers para loci potencialmente amplificáveis em Brycon orbignyanus: Nome Motif Tipo Primer F (5-3 ) Primer R (5-3 ) Borb01 ATCT Tetra tctgtctatctatctgcctatctgttga aggaggcatagtggtagcatgtag Borb02 AAGG Tetra gcctaggaagtgacatacaacagga tcttcttccttcctttcattcttcc Borb03 AGAT Tetra tagacctcaacgatagacagccag gcctaaggcctataacaaaatatctgtc Borb04 ATAG Tetra ttgtgaactatgattccaactgtatgtc ggcctcataaccctttcctaactt Borb05 CCA Tri tttttgtcttagtgagattgcccc aaaaacacaccaccacaagggt Borb06 ATT Tri aggtgggtcttcaattattagcaa gcaacaataaacacaacaataatgctac Borb07 ATA Tri tcagtgctctgtgtgcatttttatt aaggaagtttaatgttgccaaacg Borb08 ATT Tri aggaagcggagaaatgtgtattga gggaacatgataaaagtgctgcat Borb09 AAT Tri tttaactccttcagtctgcacagc gtgcgcctacaaataaacagaaca Borb10 ATT Tri taaacaactgacaaaagcttcggg aaacacacaggccttattcccttt Borb11 ATT Tri tcaccaaccaacagaaaacacaat catctgaggcctgtttggtcttat Borb12 ATT Tri cagatgttattacacgttttgttgcac tgtgagtgtttgtgagtgtttgtga Borb13 ATT Tri acatatggtcatattgcccacacc tgctccaacataatacacaaaatgatg Borb14 ATC Tri tcccaaaataatgactcagcagaa tagcctctctcacagaacaatgga Borb15 ATT Tri cgtagcctcattgtgtagcatagc gccatcactacagtcttttaaccca Borb16 AAT Tri gcacgaaccaatactaggaaatgc tgtaacaaagaaacacactgtcagctc Borb17 ATA Tri tcaaaaagcaaaaagtttaaaacatg atgtggaataaagggcaagacaaa Borb18 ATT Tri aaaggcacagtagcaaaagtctgttt aacgtctcgtgagtgtcatctgag Borb19 AG Di aactgacctgctttgatgtgttca tctcactctccctttctcactctca Borb20 AG Di tgttttgaaacaggaatgcaattaaa ttctccttttcttctccttccctaa Borb21 CA Di agaggcggagaggagatctaagaa gttgccaaggagacagcagagt Borb22 CA Di tctccacatagctttcccatgatt agatgaacagctgtggagcagagt Borb23 AC Di cagaagcagtaagtggatgaagca actcattccagaagactgaccctg Borb24 AC Di gaaagcttactgttggtcagaggg gctccagtaacttgtacatttgcg Borb25 AC Di cagcagtgattgagtagtcatggg cctgctctccacagagggttatta Borb26 CA Di agctgtgtgcgtctggctatc acttattgtttccattcataatgctgag Borb27 AC Di gagtgaagtttgctgataaacacaga ttcctcctacctcctaaaaacaca Borb28 CA Di ccctccttttcttccttgctttat gcttttgattacaggagcatggat 36

37 Borb29 AC Di cactgtatgcggagcaatttactg tgtacacctacagttgtgtttgtgttg Borb30 CA Di cactgcatatgtccaaactgaactt gctctgtgttccagacaggatct Borb31 AC Di gcctggagacttcagtaacctctg tgattttattggtgctgatcttgc Borb32 CA Di tcttgattactgaaccaatgccaa aagttgaaaagaccctaggggaaa Borb33 AC Di ccaaccagctgagtcagtcagta gctctatggctctatgttctaacgc Borb34 AC Di agcccaacacagcaacagaaa ctttcagccctactcccacg Borb35 AG Di gggcgttaaaacgtaaaactcagtc ctttacgtctctcactcacttgcg Borb36 AG Di ggaaagagaaaaggggagaagaca catgccctctttctaggtgagttc Borb37 CA Di gtgtgtattcatgtttggaggtgc gcacctgcttggtttttggtact Borb38 CA Di actgacagacagagcactcacactc aagtagcttgtctggttgcaaagg Borb39 AC Di cataatcgctccagtgcttactca ttagaacaaatacgcttggctcaac Borb40 AT Di atctcataagtggcacattcaggg gcaccagcctaaccaattctcata Borb41 CA Di acctccctgtctggattttaggaa gtccctgagcacctgtaaacaca Borb42 AG Di acgcaacaaatgaaacaaaggatt tggcccttctctatcatattcctg Borb43 AC Di agagaaacggcccttcaggat aagcttttctccaaacgtccctat Borb44 AG Di ccaacaacgactccatttacacac attcatggattctcttctcctccc Borb45 AG Di gcctgagagcagagagacagagag cccatgggtggatttacattgata Borb46 CA Di atgcgtaaccctgatctagcaatg tgtcaaaatgtgtgcctttctatgtt Borb47 AC Di tgctggtaggaaatcacattctgt attttacacctcttggccatttct Borb48 AC Di actgagagcaacattgaaaaggct atctcgcttggaaagaactctcg Borb49 AC Di aatagtcggacaggtcagctccta aggagccagtagtggcactttaac Borb50 AG Di gagaaaaagagagaaacagcacgc ttacagttcactactgctgccgtc 37

38 Tabela AI-2 - Pares de primers para loci potencialmente amplificáveis em Leporinus piavussu, Nome Motif Tipo Primer F (5-3 ) Primer R (5-3 ) Lpi01 GCACAC Hexa acgtgcaatcaacacttatttcca Catacgatttccaacgctcttttc Lpi02 GGTTAG Hexa taggttagggttaggggttagggg actgtggtgaccaacctaagcct Lpi03 AGATA Tetra ttaactggacaggcctagaattatg cctttgggataaataaaatgaaataaaa Lpi04 TCTA Tetra tctgtctgtctgtctctctgtttatctg ggctgtgggaaaaagcagttag Lpi05 AGAT Tetra tcgtcgtcagaaaagcagacatag catagcaatctatttgtctgtccagc Lpi06 TCTA Tetra tgtctgtctgtttatgtgtctgtctg tgcttatatcaagagctttaagacgg Lpi07 CTAT Tetra gcttctctacattaccttgtagctct cagatggatagacagataacgggg Lpi08 AATT Tetra tgctcttcagcagggagactattt aaccgatgcttggagtgtatgttt Lpi09 TTTA Tetra atatgtttcagtatgctgaggggg cacacatgagtgcaccagacttta Lpi10 ATT Tri gtaatggcgctaaatacatggctc cctgtccagatgacattcttgattt Lpi11 TAT Tri tgcaggtgtaaataagcaatgtga tgagagtaacaatggttaatggtgg Lpi12 ATT Tri aagttcgtttgatctgaaagtgcc agccaagctcacacaacaacaata Lpi13 AAT Tri cacattgggctgcattctttgtat accacatataaggtcctgtggctg Lpi14 TTA Tri tagcagtgttgtgggtattgtgct tttaacttgcctgacaaccctttg Lpi15 TTA Tri tcacttggctttattctctcagacg agctcagggcagctgtatatgact Lpi16 TTA Tri cttaagaacgtgcaggccaaag ctattccagtcagtggagcatcaa Lpi17 AAT Tri aatcgaattcctacaattccccc tcacctccagaactgaaatggaag Lpi18 CCT Tri tttgcacattcaactccaatgttt ttcacagccatacacatacttgcc Lpi19 AAT Tri ggttgaaaaactgatcatccagac gctacttagtcagctgtcataccca Lpi20 TAC Tri caggccaatacacaggactacta tgtaatgccctgattaaccatatttt Lpi21 TTG Tri gtggcccacagttcctagtatgtc ctggcactacagacacaatgtcg Lpi22 TTA Tri ctgtccacacaaatagcgctgtag aacagtcaacaacaacctcagcaa Lpi23 CTT Tri atcaggtgagggcaaagtaatga ggactaaaatgtgacgtcttaaccct Lpi24 AGT Tri aatcccgttatctaatcactcattgtt gcttttacactgtttactggcatca Lpi25 ACA Tri atacaattagccttctgatgggga ttatggtttcctttagcaagaaagtg Lpi26 GAA Tri tggattaaggttaggcaatgagga cccatgttattgtcatcagaagca Lpi27 ACA Tri aaaacaagcaagaacagttccca gcttctgaagggttgactgttagc Lpi28 CTA Tri acagctagcagtcagacgttggta gttactggacacctcttgtgcttg Lpi29 GAT Tri gagcttcagtttggttctctgagc ttatctgcagaatccctgatctcc Lpi30 GCT Tri actgatgcgtaggtgcttagtggt aagaacagagctggattctagcca Lpi31 AAT Tri tgtgtttagaatatccgttcagacca tcactctcacttcaaaacaggcac 38

39 Lpi32 TAT Tri taattgctgcaagaccacactgtc ccagcctggactatagcctttatca Lpi33 TAT Tri gagcgagtagacaaattaagccc tgatcggtattgacaaaatggaga Lpi34 TTC Tri ttctttgtcaacttctgtttctttcttt aaacaacaggggagacacataaaaa Lpi35 TGT Tri tcacctaatggactaggagatccg gtcctgctggacctactttcattt Lpi36 TTC Tri tcgtatttatttcggccagatcat tgatgaagaacaaattggaaaactga Lpi37 TTC Tri agttaaacttccgacaaggaaggg tctgacaactttgacaggtttgga Lpi38 GAA Tri gtgccctcctctgactttcaatta tgatctcctcttcattctcttcacc Lpi39 ACT Tri ggctggtcttcccactatcca cctcgtcttgagcagtggtgt Lpi40 TTC Tri gcatgcatgttcttcttttgcttc tattgactgagcaatcctgaggagg Lpi41 AAG Tri aggccacagttttagacacatgct aacagcagcataaatggttggttt Lpi42 AGC Tri ccacctgttgaaatgtccaagtatc cgtgacctaaaactgctgtatgga Lpi43 TCT Tri aaacagctacctgaaaacactttg caattttcagaaaggaaaggagca Lpi44 AAT Tri ttaatgtagaccatttaaacaacga gggagctgctatgaatgaagagta Lpi45 GT Di agcagacttacagtgaagcacag actactgcagctggaggaatgata Lpi46 TC Di cctcactgttctctgtcttccctt tcagttcctgtgctgagagaaaga Lpi47 CA Di ctaaaatgctgctccagtacaccc aaatgcagaacaggaaatgtgtga Lpi48 TC Di cagacaaaaactgatagcaacca gaggaaatgcctcaggagctaaat Lpi49 TC Di tctctccatgtctcctcactctttc ggcctagattagctttccttcagc Lpi50 AG Di acagaatgcaagacagcaaggct tcttcctccttctttcttaccccc Lpi51 CA Di ctttggccttgacctttcatacac tcaaattcccctcatgaagctagta 39

40 Tabela AI-3 - Pares de primers para loci potencialmente amplificáveis em Salminus brasiliensis Nome Motif Tipo Primer F (5-3 ) Primer R (5-3 ) Sbra01 GCACAC Hexa acgtgcaatcaacacttatttcca catacgatttccaacgctcttttc Sbra02 GGTTAG Hexa taggttagggttaggggttagggg actgtggtgaccaacctaagcct Sbra03 AGATA Penta ttaactggacaggcctagaattatgt Cctttgggataaataaaatgaaataaa Sbra04 TCTA Tetra tctgtctgtctgtctctctgtttatctg ggctgtgggaaaaagcagttag Sbra05 AGAT Tetra tcgtcgtcagaaaagcagacatag catagcaatctatttgtctgtccagc Sbra06 TCTA Tetra tgtctgtctgtttatgtgtctgtctg tgcttatatcaagagctttaagacgg Sbra07 CTAT Tetra gcttctctacattaccttgtagctctgc cagatggatagacagataacgggg Sbra08 AATT Tetra tgctcttcagcagggagactattt aaccgatgcttggagtgtatgttt Sbra09 ATT Tri gtaatggcgctaaatacatggctc cctgtccagatgacattcttgattt Sbra10 TAT Tri tgcaggtgtaaataagcaatgtga tgagagtaacaatggttaatggtgg Sbra11 ATT Tri aagttcgtttgatctgaaagtgcc agccaagctcacacaacaacaata Sbra12 AAT Tri cacattgggctgcattctttgtat accacatataaggtcctgtggctg Sbra13 TTA Tri tagcagtgttgtgggtattgtgct tttaacttgcctgacaaccctttg Sbra14 TTA Tri tcacttggctttattctctcagacg agctcagggcagctgtatatgact Sbra15 TTA Tri cttaagaacgtgcaggccaaag ctattccagtcagtggagcatcaa Sbra16 AAT Tri aatcgaattcctacaattccccc tcacctccagaactgaaatggaag Sbra17 CCT Tri tttgcacattcaactccaatgttt ttcacagccatacacatacttgcc Sbra18 AAT Tri ggttgaaaaactgatcatccagac gctacttagtcagctgtcataccca Sbra19 TAC Tri caggccaatacacaggactactaca tgtaatgccctgattaaccatatttt Sbra20 TTG Tri gtggcccacagttcctagtatgtc ctggcactacagacacaatgtcg Sbra21 TTA Tri ctgtccacacaaatagcgctgtag aacagtcaacaacaacctcagcaa Sbra22 CTT Tri atcaggtgagggcaaagtaatgag ggactaaaatgtgacgtcttaaccct Sbra23 AGT Tri aatcccgttatctaatcactcattgtt gcttttacactgtttactggcatca Sbra24 ACA Tri atacaattagccttctgatgggga ttatggtttcctttagcaagaaagtg Sbra25 GAA Tri tggattaaggttaggcaatgagga cccatgttattgtcatcagaagca Sbra26 ACA Tri aaaacaagcaagaacagttcccag gcttctgaagggttgactgttagc Sbra27 CTA Tri acagctagcagtcagacgttggta gttactggacacctcttgtgcttg Sbra28 GAT Tri gagcttcagtttggttctctgagc ttatctgcagaatccctgatctcc Sbra29 GCT Tri actgatgcgtaggtgcttagtggt aagaacagagctggattctagcca Sbra30 AAT Tri tgtgtttagaatatccgttcagacca tcactctcacttcaaaacaggcac Sbra31 TAT Tri taattgctgcaagaccacactgtc ccagcctggactatagcctttatca 40

41 Sbra32 TAT Tri gagcgagtagacaaattaagcccc tgatcggtattgacaaaatggaga Sbra33 TTC Tri ttctttgtcaacttctgtttctttcttt aaacaacaggggagacacataaaaa Sbra34 TGT Tri tcacctaatggactaggagatccg gtcctgctggacctactttcattt Sbra35 TTC Tri tcgtatttatttcggccagatcat tgatgaagaacaaattggaaaactga Sbra36 TTC Tri agttaaacttccgacaaggaaggg tctgacaactttgacaggtttgga Sbra37 GAA Tri gtgccctcctctgactttcaatta tgatctcctcttcattctcttcacc Sbra38 ACT Tri ggctggtcttcccactatcca cctcgtcttgagcagtggtgt Sbra39 TTC Tri gcatgcatgttcttcttttgcttc tattgactgagcaatcctgaggagg Sbra40 AAG Tri aggccacagttttagacacatgct aacagcagcataaatggttggttt Sbra41 AGC Tri ccacctgttgaaatgtccaagtatc cgtgacctaaaactgctgtatgga Sbra42 TCT Tri aaacagctacctgaaaacactttgc caattttcagaaaggaaaggagca Sbra43 AAT Tri ttaatgtagaccatttaaacaacgac gggagctgctatgaatgaagagta Sbra44 GCT Tri ctcctgttgaaaggacagagcagt agcatcagcatcagcagcag Sbra45 GT Di agcagacttacagtgaagcacagc actactgcagctggaggaatgata Sbra46 TC Di cctcactgttctctgtcttccctt tcagttcctgtgctgagagaaaga Sbra47 CA Di ctaaaatgctgctccagtacaccc aaatgcagaacaggaaatgtgtga Sbra48 TC Di cagacaaaaactgatagcaaccac gaggaaatgcctcaggagctaaat Sbra49 TC Di tctctccatgtctcctcactctttc ggcctagattagctttccttcagc Sbra50 AG Di acagaatgcaagacagcaaggct tcttcctccttctttcttaccccc Sbra51 CA Di ctttggccttgacctttcatacac tcaaattcccctcatgaagctagta Sbra52 GA Di cagctacagcagcaaagagaaagc cttccgtggacttactgcaagagt 41

42 ANEXO II Lista da produção científica do projeto. Resumos e publicações oriundas direta ou indiretamente do projeto: Trabalho premiado com o 1º lugar na categoria Iniciação Científica pela comissão avaliadora do 58 Congresso Brasileiro de Genética, da Sociedade Brasileira de Genética. 42

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