Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS EXPRESSÃO GÊNICA E DIAGNÓSTICOS. APLICAÇÕES DO PCR EM TEMPO REAL Aluna: Fabiana Bombonato Mingossi Orientador: Daniel Scherer de Moura Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
SUMÁRIO 1. Introdução ao PCR convencional 2. PCR convencional vs. PCR em tempo real 3. PCR em tempo real 4. Química da detecção Sybr Green TaqMan Molecular Beacon 5. Aplicações
Introdução ao PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) = reação em cadeia da polimerase; Inventada por Kary Mullis em 1983; Posteriormente, em 1993, foi atribuído a ele o Prêmio Nobel da Química pelo seu trabalho.
PCR - consiste em amplificar cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. É o método para rápida amplificação de seqüências específicas de DNA. Seqüência específica
Componentes da PCR Mg 2+ = cofator da Taq DNA polimerase = termoestável, isolada de Thermus aquaticus Nucleotídeos utilizados para confecção da nova fita dctp dgtp datp dttp Iniciadores = pequenas seq. complementares ao DNA alvo Tampão = mantém o ph ótimo para atividade da enzima.
Qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores. Oligonucleotídeos com 20-24 bases são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade. O pareamento dos iniciadores com a seqüência alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, segundo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick: A = T C = G
Primeiro ciclo da PCR
Após ciclos sucessivos... São utilizados dois iniciadores que delimitam o segmento amplificado.
Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos iniciadores serve como molde para a síntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do número de novas fitas; Depois de terminada a reação, a confirmação é obtida através da eletroforese em gel de agarose: http://www.scanelis.com/webpages.aspx?rid=679
Qual o problema com os géis de agarose? Precisão ruim; Baixa sensibilidade; Baixa resolução; Não-automotizado; Discriminação apenas pelo tamanho; Resultados não são numéricos; Não é confiável quantitativamente.
PCR EM TEMPO REAL - PCR QUANTITATIVO - um dos métodos atuais de aferir o nível de expressão de genes; - técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do n de moléculas produzidas ciclo a ciclo. Por que o PCR em tempo real foi desenvolvido? necessidade de quantificar diferenças na expressão de mrna.
Natureza do PCR em tempo real Quantificação em tempo real (quantidade de DNA teoricamente dobra a cada ciclo) n ciclos 2 N (quantidade de DNA)
CYCLE Número NUMBER de ciclos Quantidade AMOUNT de OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 Quantidade de DNA Quantidade de DNA 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0 5 10 15 20 25 30 35 Número de ciclos de PCR 0 5 10 15 20 25 30 35 Número de ciclos de PCR
Máquinas de PCR em tempo real - Tubos - Placa
Fases do PCR em tempo real: Fase platô Limiar Fase exponencial Linha base Sem molde Ciclo Linha basal: não houve produtos de PCR suficiente para detectar a fluorescência; Fase Exponencial ou Log: a quantidade de produtos de PCR dobra a cada ciclo; Fase platô: não há mais aumento no n de produtos.
Características relevantes do PCR em tempo real: 1. RAPIDEZ - Duração da corrida: 20 min a 2 h; - Resultado obtido no final da reação, não é necessário pós-processamento. 2. ESPECIFICIDADE - Pode ser altamente seqüência-específica.
3. SENSIBILIDADE - Alta sensibilidade para detecção de DNA ou cdna; - Importantes para quantidades limitadas de material; - Detecção baseada pela mensuração da fluorescência emitida pelos agentes intercalantes ou sondas fluorogênicas.
4. QUANTIFICAÇÃO - Característica mais importante. Como utilizar o PCR em tempo real para quantificar a quantidade de DNA ou cdna? Equivalente aos cálculos utilizados no Northen
NORTHERN controle experimento 030, ;4 Gene de controle interno, actina, GAPDH, RPLPO, etc Aumento correto de vezes = 10/2 = 5 Razão do gene alvo (experimento/controle) = diferença de vezes no gene alvo diferença de vezes no gene referência
PADRÕES (Referência) mesmo número de cópias em todas as células; expresso em todas as células; possuir o mínimo de variação nos diferentes processo biológicos. O padrão perfeito não existe!
PADRÕES padrões normalmente utilizados: - GAPDH e beta-actina - MHC I (principal complexo de histocompatibilidade I) - mrnas de certas proteína ribossomais, ex. RPLPO - rrna: 28S ou 18S 28S é mais representativo pois o 18S pode se manter intacto em amostras mesmo com mrna degradado - Múltiplos mrnas
A. Fluoróforos ligados ao DNA B. Sondas de hibridização 4 oligo 3 oligo 2 primers 2 sondas 2 sondas 1 primer C. Sondas de hidrólise D. Molecular beacons E. Scorpions F. Iniciadores Sunrise QUÍMICA DA DETECÇÃO G. Iniciadores LUX Fluoróforo quencher Fluoróforo repórter Fluoróforo receptor Fluoróforo doador Fluoróforo quencher DNA polimerase Bloqueador DNA polimerase Fluoróforo fluorescente emitindo luz
Detecção não-específica utilizando fluoróforo ligado ao DNA - repórteres fluorescentes; - fluoróforo se liga ao DNA fita-dupla; - emissão de fluorescência a cada ciclo; - monitoramento durante fase exponencial; - técnica muito flexível/ reações múltiplas não são possíveis.
SYBR GREEN
Esquema do Sybr Green: A. Desnaturação B. Anelamento C. Extensão
- Fluoróforo não ligado baixa fluorescência - Técnica mais simples e barata - Desvantagem produtos específicos e não específicos geram sinal
Como verificar o que é amplificado? - Gel de agarose: Observar se o tamanho da banda apresenta o mesmo tamanho da seqüência-alvo!
- Curva de melting: Depende da composição de bases (%CG) e tamanho do fragmento; Todos os produtos de PCR para um par de iniciador particular deve ter a mesma temperatura de melting. temperatura
PROBLEMAS: mispriming Dímeros de iniciadores Contaminação temperatura
Detecção específica utilizando sondas específicas ao alvo TaqMan
Estrutura da sonda TaqMan (sondas de hidrólise): Fluoróforo Repórter Fluoróforo quencher Também conhecida por 5 nuclease, pois a geração da fluorescência é dependente da atividade da nuclease 5-3 para clivar o fluoróforo repórter da sonda linear.
Iniciador Nucleotídeos da TaqMan Fita complementar
1 - Desnaturação iniciador repórter sonda quencher 2 - Anelamento do iniciador/ Hibridização da sonda Taq 3 - Extensão
MOLECULAR BEACON
Estrutura do Molecular Beacon (sondas de hairpin ): Nucleotídeos específicos ao produto de PCR alça: 18-30 pb complementares ao alvo tronco: ~5-7 pb e são complentares 5 fluoróforo: fluoresce na presença seq. alvo 3 quencher : impede a emissão de fluorescência na ausência da seq. alvo Fluoróforo repórter Fluoróforo quencher
- Sondas de hibridização de oligonucleotídeos fita simples - Alvo presente híbrido mais longo e estável - Mais específicas do que as sondas lineares - Altamente específico - distingue substituição de um único nucleotídeo Molecular Beacon Alvo Híbrido
Iniciador 1 Produto de PCR Iniciador 2 Detecção do produto de PCR pela molecular beacon Nucleotídeos específicos
- Análises mútiplas - Sondas com fluoróforos de cores diferentes - Ex: Diagnóstico de doenças fúngicas em plantas Detectar diferentes patógenos numa mesma amostra
Determinação do genótipo em um locus particular Homozigoto selvagem Heterozigoto Homizigoto Mutante Fluorescência Ciclo
APLICAÇÕES: 1. Genética de transgênicos 2. Resistência à fungicida 3. Contaminação de alimentos 4. Identificação de organismos geneticamente modificados (OGM) 5. Detecção e quantificação de patógenos
1. Genética de transgênicos Quando novas plantas transgênicas são obtidas, o primeiro e essencial passo é sua caracterização molecular; Inserção de DNA ao acaso no genoma da planta; Múltiplas cópias de transgênicos integradas em 1 ou mais regiões cromossômicas podem resultar em silenciamento gênico.
Avaliação do número de cópias de transgênicos em arroz transformado Yang et al. 2005. Plant Cell Rep 23: 759-763 Como plantas com 1 ou 2 eventos de integração normalmente apresentam alto nível de expressão de gene exógeno, a avaliação do n de cópias de transgênicos Essencial para seleção e cultivo de plantas GM O número de cópias pode influenciar o nível de expressão e estabilidade do gene alvo!
Neste estudo, o PCR em tempo real (TaqMan) foi utilizado para uma detecção rápida e precisa do n de cópias dos genes exógenos GUS e HPT em arroz transformado.
HPT GUS Rearranjo ZCM-1 ZCM-2 ZCM-3 ZCM-13 ZCM-14 ZCM-15 ZCM-16 ZCM-22 ZCM-23 ZCM-25 ZCM-27 ZCM-33 1 4 3 1 1 1 1 2 1 1 4 1 1 4 3 2 2 1 1 4 2-3 1 5 1 Não Não Não Sim Sim Não Não Sim Sim Não Sim Não ZCM-33 ZCM-36 ZCM-40 ZCM-46 ZCM-61 ZCM-65 ZCM-72 ZCM-73 ZCM-78 ZCM-80 ZCM-81 ZCM-87 ZCM-90 1 2 1 1 1 3 5 4 1 3 1 2 1 1 1 2 4 2 3 5 4 2 3 2 2 1 Não Sim Sim Sim Sim Não Não Não Sim Não Sim Não Não
Rearranjos dos genes GUS e HPT 11 amostras mostraram rearranjo (n cópias do GUS n cópias do HPT) durante o processo de integração cromossomal 45,8% rearranjo indicou que rearranjos T-DNA são mais comuns do que se pensa! O RT-PCR obteve sucesso na quantificação de transgênicos, e útil para posterior seleção e cultivo de plantas GM!
2. Resistência à fungicida O sucesso de um fungicida pode ser perdido se o patógeno desenvolver resistência a ele; Para obter o melhor uso dos fungicidas, o estado de resistência das populações de patógenos deve ser conhecido; Testes que avaliam a freqüência de alelos resistentes são de grande importância para o manejo de cultivares.
Quantificação do alelo E198A da beta-tubulina que confere resistência a benzimidazole em Monilinia fructicola utilizando PCR em tempo real. Luo et al. 2007. Pest Manag Sci 63: 1178-1184. Resistência à fungicidas de benzimidazole tem sido detectada em algumas espécies de fungos; Na maioria dos casos, esta resistência tem sido associada com mutações pontuais no gene ß- tubulina; Isto resulta numa alteração da seqüência de aa no sítio de ligação da benzimidazole.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um método rápido e preciso para quantificar o alelo E198A que confere resistência a benzimidazole em populações de M. fructicola; O PCR em tempo real foi desenvolvido utilizando o fluoróforo fluorescente Sbyr Green.
Resultados O PCR em tempo real demonstrou uma potencial e efetiva ferramenta para quantificar a freqüência do alelo E198A; Ele foi capaz de detectar freqüências muito baixas do alelo E198A que os métodos convencionais não conseguem detectar. O PCR em tempo real pode ser usado para detecção precoce de resistência à fungicida, tendo um importante papel na avaliação e manejo desse risco em populações no campo!
3. Contaminação de alimentos Com a introdução de regulamentos de segurança, métodos capazes de quantificar precisamente contaminantes de alimento foram requeridos; Nível tolerável de contaminação: quantificação precisa é de importância crucial companhias de agronegócio!
Aplicação da tecnologia do PCR em tempo real molecular beacon para detectar espécies de Salmonella contaminando frutas e vegetais Liming & Bhagwat, 2004. Int J Food Microbiol 95: 117-187. A incidência de intoxicação alimentar causada por espécies de Salmonella continua sendo um problema; Novos métodos baseados no PCR têm sido usados crescentemente para uma detecção rápida, sensível e específica de patógenos de alimentos.
Detecção de espécies de Salmonella: A fluorescência da sonda MB aumenta com o acúmulo do DNA alvo no final de cada ciclo de amplificação. Unidade de fluorescência relativa (RFU) Ciclo
Avaliação das sondas MB: MB foi capaz de detectar espécies de Salmonella de variedades de produtos frescos com níveis muito baixos de contaminação (1-3 UFC/25g de produto). Conclusão: Este estudo ilustrou pela primeira vez a possibilidade do uso de MB para detecção e/ou fiscalização de Salmonella contaminando frutas e vegetais!
4. Identificação de OGM A detecção de OGM em alimentos, ingredientes e aditivos é necessária por duas razões principais: 1. Os consumidores devem poder decidir se querem ou não consumir alimentos e ingredientes GM, o que levou a adoção de legislação impondo a rotulagem dos alimentos GM; 2. Se existe legislação, é necessário implementar as medidas que garantem que a mesma seja cumprida.
Métodos de detecção para algodão transgênico MON 15985 e MON 88913 pelo PCR Lee et al. 2007. J Agric Food Chem 55: 3351-3357. O algodão é um cultivar muito importante economicamente; Características dos trangênicos estudados: MON 15985: expressa duas proteínas altamente seletivas que são ativas contra insetos lepidópteros; MON 88913: expressa dois genes que permitem o uso do glifosato (ingrediente ativo de alguns herbicidas).
O método de detecção é um elemento essencial para o sistema de rotulagem. Alguns países têm estabelecido limites próprios para rotulagem. Limites de tolerância para contaminação dos alimentos biológicos com OGM: - União européia: 0,9% - Brasil: O,9% - Coréia do Sul: 3% - Japão: 5% Neste estudo, foi relatado a utilização do PCR em tempo real para quantificação do algodão GM, e confirmar sua aplicabilidade para uso rotineiro.
Resultados: Os limites de quantificação foram todos 0,1% Conclusão: O PCR em tempo real pode ser aplicado por sistemas de rotulagem de OGM por todo o mundo! O PCR quantitativo foi validado e confirmado como um método para monitoramento prático para algodão transgênico!
5. Detecção e quantificação de patógenos O método de PCR em tempo real para quantificar o nível de infecção de plantas tem aumentado nos últimos anos, desde o primeiro relato por Böhm et al. (1999); Ele está sendo amplamente utilizado para diagnósticos de doenças e para finalidades aplicadas.
Detecção melhorada do vírus do amarelamento foliar de cana-de-açúcar usando o PCR em tempo real (Taq Man) Korimbocus et al. 2002. J Virol Methods 103: 109-120. A propagação vegetativa de cultivares de cana-de- açúcar pode levar ao desenvolvimento de infecção viral nos clones selecionados Destacando a importância de estoques de cana livre de vírus para propagação e cultivo.
Este artigo descreve o desenvolvimento de um método que oferece melhor sensibilidade e especificidade para detecção do vírus. O PCR em tempo real utilizando a sonda TaqMan foi avaliado e comparado ao método de PCR convencional. Resultados: Maior sensibilidade do PCR em tempo real, detectando quantidades muito menores do vírus (10 5 ) comparado ao PCR convencional (10 3 ).
O uso apropriado do PCR quantitativo pode ajudar a diminuir a incidência do vírus do amarelamento foliar, pela prevenção de sua extensão a níveis muito baixos em materiais de propagação. Conclusão: A detecção de patógenos utilizando TaqMan pode ser aplicado a produção de plantas livres de infecção, e evitar sua extensão através da propagação vegetativa!
Perspectivas: Diagnósticos baseados no DNA estão em enorme crescimento no estudo de plantas; Especificidade e sensibilidade abrirão novas oportunidades para pesquisa sobre interações patógeno-hospedeiro, OGM, diagnósticos présintomáticos, etc; Limitações devido ao alto custo devem ser minimizadas com a utilização rotineira.
Referências: Böhm J, Hahn A, Schubert R, Bahnweg G, Adler N, Nechwatal J, Oehlmann R, Osswald W, 1999. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. J Phytopathol 147: 409-416. Gachon C, Mingam A, Charrier B, 2004. Real time PCR: what relevance to plant studies? J Exp Bot 55:1445-1454. Korimbocus J, Coates D, Barker I, Boonham N, 2002. Improved detection of Sugarcane yellow leaf virus using a real time fluorescent (TaqMan) RT PCR assay. J Virol Methods 103: 109-120. Lee SH, Kim JK, Yi BY, 2007. Detection methods for biotech cotton MON 15985 e MON 88913 by PCR. J Agric Food Chem 55: 3351-3357. Liming SM & Bhagwat AA, 2004. Application of a molecular beacon - real time PCR tecnology to detect Salmonella species contaminating fruits and vegetable. Int J Food Microbiol 95: 177-187.
Luo Y, Ma Z, Michailides TJ, 2007. Quantification of allele E198A in beta-tubulin conferring benzimidazole resistance in Monilinia fructicola using real-time PCR. Pest Manag Sci 63: 1178-1184. McCartney HA, Foster SJ, Fraaije BA, Ward E, 2003. Molecular diagnostics for fungal palnt pathogens. Pest Manag Sci 59: 129-142. Schaad NW, Frederick RD, 2002. Real-time PCR and its application for rapid plant disease diagnostics. J Plant Pathol 24: 250-258. Yang L, Ding J, Zhang C, Jia J, Weng H, Liu W, Zhang D, 2005. Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by realtime quantitative PCR. Plant Cell Rep 23: 759-763. Wong ML & Medrano JF, 2005. Real time PCR for mrna quantitation. BioTechniques 39: 75-85.