1. INTRODUÇÃO. Apresentação do objeto de estudo

9 1. INTRODUÇÃO Apresentação do objeto de estudo A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal que surge da transformação neoplásica das células progenitoras pluripotentes, resultando em uma granulocitose progressiva. A leucemia mieloide crônica é um protótipo de câncer desencadeado por uma alteração cromossômica específica, a translocação t(9:22) que origina o cromossomo Philadelphia (Ph). Essa translocação resulta na formação de um gene quimérico BCR/ABL, formado pela fusão de dois genes: o gene BCR (do inglês, Breakpoint Cluster Region), localizado no cromossomo 22, com o gene ABL (do inglês, Abelson Oncogene), localizado no cromossomo 9, produzindo um transcrito ativo BCR-ABL, localizado no cromossomo rearranjado Ph (do inglês, Philadelphia.). A leucemia mieloide crônica foi a primeira neoplasia relacionada, consistentemente, com uma anomalia genética adquirida, a qual vem sendo muito bem estudada no seu aspecto molecular. Como todos os cânceres, todas as células leucêmicas são descendentes de uma única célula que perdeu a capacidade de manter o controle normal sobre o ciclo celular. As leucemias são divididas em agudas e crônicas. O grupo das leucemias tanto a aguda quanto a crônica são divididas em mieloblástica e linfocítica, sendo que essa diferenciação é feita na célula de origem de cada grupo. Sob o ponto de vista epidemiológico a leucemia mieloide crônica corresponde de 14% a 20% dos casos de leucemias, com uma incidência anual de 1,6 casos por 100 mil indivíduos. A leucemia mieloide crônica ocorre em todas as faixas etárias, é mais comum em pessoas de meia idade e idoso e é mais freqüente no sexo masculino. A leucemia mieloide crônica distingue-se de outras leucemias pela presença de uma anormalidade genética nas células doentes, como já citado o cromossomo Philadelphia. As alterações que fazem com que esse cromossomo venha a causar a leucemia mieloide crônica têm sido estudadas intensivamente. Em

10 1960, dois médicos que estudavam cromossomos em células cancerígenas notaram que um dos cromossomos em pacientes com leucemia mielóide crônica era mais curto que o mesmo cromossomo em células normais. Eles o denominaram cromossomo Philadelphia, porque o fato foi observado na faculdade de Medicina da Universidade da Pensilvânia. Na leucemia mieloide crônica, a proteína produzida pelo gene BCR-ABL(gen translocado) é uma enzima anormal denominada tirosina quinase. Quando o gene ABL se funde com o gene BCR, o resultado é uma proteína mais alongada que a proteína produzida pelo gene ABL normal. Essa proteína funciona de maneira anormal e leva a uma regulação não funcional do crescimento e da sobrevivência celular. Evidências consideram essa proteína anormal, a causa da conversão leucêmica da célula-tronco hematopoética. Essa proteína mutante é o alvo de tratamentos medicamentosos específicos, que visam bloquear seus efeitos. Tais alterações genômicas podem ser evidenciadas através da técnica da citogenética clássica e molecular. Justificativa Diante da contribuição que a citogenética vem dando ao conhecimento da biologia do câncer, sinto a necessidade de explorar a literatura a fim de verificar de que forma a citogenética vem ganhando espaço no diagnóstico e tratamento da LMC. Problema de Pesquisa A citogenética é o procedimento mais recomendado para diagnosticar a Leucemia Mieloide Crônica e direcionar o tratamento adequado? Objetivo Evidenciar, a partir da literatura, se a técnica de análise citogenética detecta de forma satisfatória a leucemia mieloide crônica e auxilia na orientação terapêutica.

11 Estrutura do trabalho Este trabalho esta organizado da seguinte forma: Primeiro traz um breve levantamento sobre a Leucemia Mieloide Crônica. Em seguida o trabalho traz informações a respeito da análise citogenética, em seguida informações sobre o diagnóstico e tratamento da leucemia mielóide crônica. Estas informações foram organizadas através da realização de um levantamento bibliográfico sobre a leucemia mieloide crônica, citogenética, diagnóstico e tratamento da LMC utilizando referências na língua inglesa e portuguesa.

12 2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1. LEUCEMIA MIELOIDE CRÔNICA A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal, maligna, de células progenitoras do sistema hematopoiético, caracterizado por uma superprodução de células da linhagem granulocítica, especialmente neutrófilos e ocasionalmente monócitos, resultando em acentuada esplenomegalia e elevada leucometria, sem apresentar perda de capacidade de diferenciação (ANUNCIAÇÃO, et al., 2008). A LMC foi à primeira neoplasia humana relacionada a uma alteração cromossômica. Os primeiros casos de leucemia mieloide crônica foram descritos em 1845. Porém somente em 1960 quando Peter C. Nowell, da University of Pennsylvania School of Medicine, e David Hungerford, da Fox Chase Cancer Center s Institute for Cancer Research, estudando células de medula óssea de pacientes com LMC observaram a presença de um pequeno cromossomo denominado Philadelphia (Ph) em 100% dessas células, o que foi considerado um marco para a citogenética tumoral. E é a partir deste momento que é descrito o cromossomo Filadélfia (Ph) como anormalidade genética que caracteriza a LMC. (HAMERSCHLAK, 2008) Em 1983 demonstrou-se que esta aberração citogenética adquirida ocasionada por uma translocação reciproca e equilibrada entre os braços longos dos cromossomos 9q34 e 22q11 justapõe a região BCR no cromossomo 22, ao gene c-abl localizado no cromossomo 9 fig 1, resultando num gene híbrido o BCR- ABL. A justaposição desses dois segmentos resulta na formação de um gene quimérico bcr-abl. A proteína, normalmente produzida pelo geneabl normal (p145), age entre o núcleo e o citoplasma. Sua superexpressão leva à inibição do ciclo celular na fase G1/S. O principal efeito funcional da fusão BCR/ABL parece ser o aumento na atividade tirosina quinase que está envolvida em várias vias de

13 tradução de sinais, alguns dos quais leva a má ativação de alguns oncogene. (HAMERSCHLAK, 2008; MONTENEGRO, et al., 2008). A proteína de fusão BCR/ABL, interfere na apoptose, onde na LMC a morte celular programada é inibida. Assim, as células sobrevivem um tempo maior na circulação maior que o normal, acumulando-se em vários órgãos e tecidos. (HAMERSCHLAK, 2008; MONTENEGRO, et al., 2008). Figura 1. Troca recíproca entre cromossomos 9 e 22. Em seguida verificou-se que o produto deste oncogene (BCR-ABL) era uma proteína de 210 KD, com atividade de tirosina quinase aumentada, passando a traduzir sinais constitutivamente para a proliferação celular (ALMEIDA et al., 2009; ALVARENGA et al., 2010; FUNKE et al., 2010). Em 1990, foi demonstrado em um modelo murino, que a presença do gene híbrido induzia uma doença mieloproliferativa semelhante à LMC vista em humanos, estabelecendo relação de causalidade entre o BCR-ABL e a LMC. Essa translocação resulta em um cromossomo 22 mais encurtado, chamado de cromossomo Filadélfia fig 2. Este foi o primeiro gene descrito causando câncer e, recentemente, foi importante no desenvolvimento da droga imatinibe, primeira medicação com alvo genético. Desde então, a importância da genética no

14 diagnóstico, prognóstico e tratamento das leucemias cresceu (ALVARENGA et al., 2010; CONCHON, 2009; FUNKE et al., 2010). Figura 2. Cromossomo 22 encurtado. As causas que levam a essa alteração são geralmente desconhecidas. Uma pequena proporção de pacientes pode ter a sua doença relacionada à irradiação. Isso ficou relativamente claro em estudos no Japão com sobreviventes da bomba atômica. Verificou-se, que nessa população, havia maior risco de leucemia, assim como de outros tipos de câncer. Praticamente todas as leucemias possuem fatores prognósticos determinados por fatores citogenéticos, mais propriamente mutações adquiridas que, uma vez detectadas, possibilitam a abordagem adequada do paciente (HAMERSCHLAK, N. 2008). Ao diagnóstico, 90% a 95% dos pacientes com LMC apresentam um cariótipo marcador na maioria de suas metáfases em células de medula óssea: o cromossomo Philadelphia (Ph), resultado da translocação envolvendo os cromossomos 9 e 22. O cromossomo Ph não é restrito à LMC, sendo também encontrado em leucemia linfoblástica aguda (LLA); 5% em pacientes infantis e 25% em adultos. Na LMC com cromossomo Ph positivo, a translocação é encontrada em todas as linhagens celulares hematopoiéticas, sendo menos frequente em células B e T (BARBOZA, et al., 2000).

15. Na translocação t(9:22), o gene c-abl associa-se a uma porção do gene BCR no cromossomo 22, denominado BCR (breakpoint cluster region). O ponto de quebra no gene BCR do cromossomo 22 está localizado em uma região de 5.8 kb, chamada de (major breakpoint cluster region M-bcr), que possui 5 exons (b1 a b5) correspondendo aos exons 12 a 16 do gene BCR. Geralmente a quebra no M-bcr ocorre dentro de introns localizados entre os exons b2 (e13) e b3 (e14) ou exons b3 (e14) e b4 (e15), que se juntam ao exon a2 do ABL formando o gene quimérico b2a2 ou b3a2, sendo 75 pares de bases diferentes um do outro. Enquanto parte da extremidade 5 do BCR permanece no cromossomo Ph, formando a seqüência 5 do novo gene híbrido, a seqüência do BCR localizada a 3 do ponto de quebra vai para o cromossomo 9q+ gerando um gene híbrido ABL/BCR que é expresso na maioria dos pacientes com LMC Ph+ ou LLA Ph+. A proteína produzida quando o ponto de quebra se encontra no M-bcr, p210, é característica de LMC, mas pode ser encontrada em LLA Ph+, M-bcr+ em menor porcentagem (BARBOZA, et al 2000). A LMC apresenta geralmente um cursor clínico bifásico ou trifásico, distinto, constituído por piora no quadro clínico e nos exames laboratoriais onde a fase crônica pode durar três a quatro anos. Na ausência de intervenção, a LMC começa tipicamente na fase crônica, e com o avanço de muitos anos progride para uma fase acelerada e finalmente para uma crise blástica. Crise blástica é a fase terminal da LMC e clinicamente se comporta como uma leucemia aguda (CHAUFFAILLE, 2009; MONTENEGRO, et al., 2008). Um dos achados da progressão da fase crônica para a fase de aceleração e crise blástica é a aquisição de uma nova anormalidade cromossômica (adicional ao cromossomo Fildélfia). Em 85% dos pacientes, o diagnóstico é realizado na fase crônica. É bom ressaltar que a doença pode ser controlada com o uso de medicamentos mielossupressores; o que segundo o Instituto Fleury, podem levar

16 à regressão do tamanho do baço e, com isso, melhorar o resultado do hemograma. Porém, na citogenética, ocorrerá a persistência do clone Ph na medula óssea (ALVARENGA, et al 2010; MONTENEGRO, et al 2008). As células alteradas na LMC, ao contrário do que se observa nos casos de leucemia mieloide aguda (LMA), geralmente funcionam adequadamente, permitindo um curso inicial da doença mais brando do que nos casos agudos. O aparecimento de sinais e sintomas na LMC é geralmente insidioso. Muitos pacientes são diagnosticados por acaso em exames clínicos ou de sangue realizados por motivos diversos ou até para check-up. Os pacientes podem referir cansaço, palidez, sudorese, perda de peso e desconforto do lado esquerdo do abdome devido ao aumento do baço. A LMC evolui, na maioria dos pacientes, para uma fase mais turbulenta e com maior dificuldade de controle, chamada fase acelerada. Nesta fase, há um aumento ainda maior do baço e aumento das células imaturas, ou seja, dos blastos (HAMERSCHLAK, 2008). Finalmente, a doença evolui para a chamada fase blástica ou aguda, na qual predominam as células blásticas na medula óssea e no sangue. Em aproximadamente 25% dos pacientes, esta etapa manifesta-se como uma LLA, ao passo que, em 75%, a manifestação é de LMA. O diagnóstico desta doença pode ser feito no exame de sangue e pode ser confirmado pelo estudo da medula óssea. O aspecto das células mostra uma grande proporção de glóbulos brancos maduros em comparação com os imaturos - blastos (HAMERSCHLAK, 2008). Além disso, geralmente podem-se determinar as anormalidades dos cromossomos no material obtido na medula óssea. Técnicas como o teste de FISH ou PCR são mais sensíveis, sendo importantes não só para o diagnóstico e avaliação da resposta ao tratamento, como para diferenciação com outras doenças mieloproliferativas de apresentação semelhante (HAMERSCHLAK, N. 2008).

17 Fase crônica Aproximadamente 85% dos pacientes com LMC estão na fase crônica na época do diagnóstico. Durante esta fase, pacientes são geralmente assintomáticos ou têm somente sintomas leves de fadiga no momento do diagnóstico. A duração da fase crônica é variável e depende do diagnóstico prematuro assim como da terapia usada. Ultimamente, na ausência de um tratamento curativo, a doença evolui para a fase de aceleração. Fase de aceleração O critério de diagnóstico usado para a transição para a fase de aceleração é variado; o mais usado é o colocado pelos investigadores do M.D. Anderson Cancer Center, da Universidade do Texas por Sokal e colaboradores, e pela Organização Mundial de Saúde (OMS). 10 19% mieloblastos no sangue ou na medula óssea; >20% basófilos no sangue ou na medula óssea; Contagem de plaquetas <100.000, sem realção com a terapia; Contagem de plaquetas >1.000.000, não respondendo a terapia; Evolução citogenética com novas anormalidades em adição ao cromossomo Filadélfia; Aumento da esplenomegalia ou da contagem de leucócitos, não respondendo a terapia. O paciente é considerado na fase de aceleração se algum destes critérios acima estiver presente. A fase de aceleração é significativa porque seus sinais representam que a doença está evoluindo para uma transformação para crise blástica. Crise blástica Crise blástica é a fase final da evolução da LMC, e comporta-se como uma leucemia aguda, com rápida progressão e sobrevivência curta. A crise blástica é

18 diagnosticada se algum dos seguintes critérios estiverem presentes no paciente com LMC: >20% mieloblastos ou linfoblastos no sangue ou na medula óssea; Grandes agrupamentos de blastos na medula óssea; Desenvolvimento de cloroma (ou sarcoma-granulocítico), ou seja, coleção sólida de células leucemicas fora da medula óssea. Já sob o ponto de vista epidemiológico, a LMC representa de 15% a 20% de todos os casos de leucemia entre a população ocidental com uma incidência anual de 1 a 2 pessoas por 100 mil indivíduos. Pode ocorrer em todas as faixas etárias, sendo mais freqüente em adultos com idade entre 40 e 60 anos e afeta ambos os sexos, com predominância no sexo masculino. Quanto aos fatores de risco, o mais associado ao surgimento da LMC e até agora documentado é a exposição às radiações ionizantes em altas doses. Agentes químicos, biológicos e a predisposição genética parecem não exercer muita influência no aparecimento dessa doença mieloproliferativa crônica (ALMEIDA, et al., 2009; ANUNCIAÇÃO, et al., 2008). Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) foram estimados para o Brasil, em 2012, 4.570 casos novos de leucemia em homens e 3.940 em mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de 5 casos novos a cada 100 mil homens e 4 a cada 100 mil mulheres (Tabela 1).

19 Estimativas para o ano de 2012 das taxas brutas de incidência por 100 mil habitantes e de número de casos novos por câncer, segundo sexo e localização primária* (TABELA 1) Estimativa dos Casos Novos Localização Primária Neoplasia Maligna Casos Homens Mulheres Estados Capitais Estados Capitais Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Próstata 60.180 62,54 15.660 75,26 - - - - Mama Feminina - - - - 52.680 52,50 18.160 78,02 Colo do Útero - - - - 17.540 17,49 5.050 21,72 Traqueia, Brônquio Pulmão e 17.210 17,90 4.520 21,85 10.110 10,08 3.060 13,31 Cólon e Reto 14.180 14,75 4.860 23,24 15.960 15,94 5.850 25,27 Estômago 12.670 13,20 3.200 15,34 7.420 7,42 2.170 9,47 Cavidade Oral 9.990 10,41 2.760 13,34 4.180 4,18 1.130 4,92 Laringe 6.110 6,31 1.540 7,56 - - - - Bexiga 6.210 6,49 1.900 9,28 2.690 2,71 880 3,72 Esôfago 7.770 8,10 1.500 7,26 2.650 2,67 520 2,27 Ovário - - - - 6.190 6,17 2.220 9,53 Linfoma Hodgkin Glândula Tireoide não Sistema Nervoso Central 5.190 5,40 1.560 7,66 4.450 4,44 1.560 6,85 - - - - 10.590 10,59 3.490 14,97 4.820 5,02 1.190 5,82 4.450 4,46 1.200 5,23 Leucemias 4.570 4,76 1.180 5,81 3.940 3,94 1.180 5,02 Corpo do Útero - - - - 4.520 4,53 1.700 7,39 Pele Melanoma 3.170 3,29 810 4,05 3.060 3,09 790 3,46 Outras Localizações 43.120 44,80 11.100 53,33 38.720 38,61 10.320 44,50 Subtotal 195.190 202,85 51.780 248,60 189.150 188,58 59.280 254,86 Pele Melanoma não 62.680 65,17 14.620 70,39 71.490 71,30 15.900 68,36 Todas as 257.870 267,99 66.400 318,79 260.640 259,86 75.180 323,22 Neoplasias Fonte: Site do INCA * Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10

A leucemia em homens é a quinta neoplasia mais freqüente na região Norte (3/100 mil). Na região Nordeste (4/100 mil), ocupa a oitava posição, na região Centro-Oeste (5/100 mil), a décima e, nas regiões Sul (6/100 mil) e Sudeste (5/100 mil), a 11ª. Para as mulheres, é a sétima mais freqüente na região Norte (3/100 mil) e a décima nas regiões Centro-Oeste (4/100 mil) e Nordeste (3/100 mil), enquanto, nas regiões Sudeste (4/100 mil) e Sul (5/100 mil), é a 12ª e a 13ª mais incidente, respectivamente (Tabela 2) e fig. 3. 20

21 Estimativas para o ano de 2012 das taxas brutas de incidência por 100 mil habitantes e de número de casos novos por câncer, segundo sexo e localização primária* (Tabela 2) Estimativa dos Casos Novos Localização Primária Neoplasia Maligna Homens Mulheres Estados Capitais Estados Capitais Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Próstata 11.550 43,08 2.730 49,17 - - - - Mama Feminina - - - - 8.970 31,90 3.440 53,92 Colo do Útero - - - - 5.050 17,96 1.330 20,63 Traqueia, Brônquio e Pulmão 2.290 8,52 770 14,19 1.600 5,64 580 9,29 Cólon e Reto 1.420 5,31 550 9,84 1.860 6,66 770 12,14 Estômago 2.390 8,99 580 10,50 1.550 5,59 400 6,43 Cavidade Oral 1.640 6,15 530 9,54 910 3,25 210 3,43 Laringe 1.090 4,02 350 6,37 - - - - Bexiga 660 2,48 200 4,03 280 1,08 120 1,73 Esôfago 1.070 3,96 250 4,61 480 1,72 100 1,66 Ovário - - - - 1.250 4,45 470 7,31 Linfoma não Hodgkin 860 3,19 290 5,19 680 2,44 280 4,44 Glândula Tireóide - - - - 1.670 6,01 490 7,73 Sistema Nervoso 860 Central 3,24 240 4,76 790 2,80 270 4,18 Leucemias 970 3,63 240 4,49 870 3,13 280 4,30 Corpo do Útero - - - - 900 3,23 320 4,91 Pele Melanoma 340 1,21 100 1,78 270 1,04 110 1,71 Outras Localizações 6.990 26,03 1.980 35,42 7.050 25,12 1.940 30,57 Subtotal 32.130 119,80 8.810 158,09 34.180 121,51 11.110 174,52 Pele não Melanoma 10.350 38,62 1.910 34,69 11.690 41,57 1.980 31,17 Todas as Neoplasias 42.480 158,39 10.720 192,37 45.870 163,07 13.090 205,63 Fonte: Site do INCA * Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10

22 Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2012 por sexo, exceto pele não melanoma* Figura 3 Localização primária Casos novos Percentual Localização primária Caso s novos Percentual Próstata 11.550 35,9% Mama Feminina 8.970 26,2% Estômago 2.390 7,4% Colo do Útero 5.050 14,8% Traqueia, Brônquio e Pulmão Cavidade Oral 2.290 7,1% Cólon e Reto 1.860 5,4% 1.640 5,1% Cólon e Reto 1.420 4,4% Glândula Tireoide Traqueia, Brônquio e Pulmão 1.670 4,9% 1.600 4,7% Laringe 1.090 3,4% Estômago 1.550 4,5% Esôfago 1.070 3,3% Ovário 1.250 3,7% Leucemias 970 3,0% Cavidade Oral 910 2,7% Sistema Nervoso Central Linfoma não Hodgkin 860 2,7% Corpo do Útero 900 2,6% 860 2,7% Leucemias 870 2,5% Fonte: Site do INCA * Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10 O diagnóstico da LMC pode ser feito por vários métodos, incluindo o exame microscópico do sangue periférico e da medula óssea, análise por citometria de fluxo, citogenética e biologia molecular. Além disso, geralmente pode ser determinado as anormalidades dos cromossomos no material obtido na medula óssea. Técnicas como o teste de FISH ou PCR são mais sensíveis, sendo importantes não só para o diagnóstico e avaliação da resposta ao tratamento, como para diferenciação com outras doenças mieloproliferativas de apresentação semelhante (ANUNCIAÇÃO, et al., 2008; HAMERSCHLAK, 2008).

23 Os aspectos genéticos relevantes no prognóstico da LMC baseiam-se na evolução clonal, isto é, na possibilidade de aparecimento de novos clones, o que geralmente determina a evolução para fase blástica e às mutações determinantes da resistência ao imatinibe (HAMERSCHLAK, N. 2008). Os pacientes com LMC devem ser seguidos com realização do cariótipo até desaparecimento do cromossomo Ph, e então por testes quantitativos moleculares para BCR-ABL por PCR. Recomenda-se a realização do cariótipo, mesmo após sua negativação pelo menos uma vez ao ano, no sentido de detectar precocemente evoluções clonais que podem representar a eminência de uma crise blástica (HAMERSCHLAK, N. 2008). 2. 2. CITOGENÉTICA A citogenética é a parte da genética que estuda os cromossomos, sua função, estrutura, comportamento biológico, patológico e sua hereditariedade. A citogenetica está dividida em citogenética clássica, que envolve a cultura de célula, e a molecular, com uso de técnica e métodos tecnológicos através de DNA. Há também, a citomolecular, a que utiliza sondas específicas. Segundo Carakushansky, as anormalidades cromossômicas ocorrem em 0,4% dos nascidos vivos. Elas estão ligadas a alterações no fenótipo e resultando desequilíbrio das informações genéticas graças a erros advindos da divisão celular (MONTENEGRO, et al., 2008). As aberrações cromossômicas podem ser numéricas ou estruturais, sendo que as primeiras relacionam-se com o número de cromossomos e as outras com alterações estruturais, como translocações recíprocas ou robertsonianas, inversões, duplicações, deleções, entre outras, ocasionadas por quebras cromossômicas. Sempre que as mutações comprometem segmentos relativamente grandes de um cromossomo, sendo permitida sua visualização através de microscópio de luz, elas são denominadas aberrações cromossômicas.

24 A análise citogenética das células malignas representou o início de um dos maiores avanços sobre a natureza biológica das neoplasias, em maior significado no campo da leucenogênese, com sua implicação prognóstica (MONTENEGRO, et al., 2008). A importância em diagnosticar a presença de uma alteração citogenética clonal (grupo de células com a mesma anormalidade), como o Philadelphia (Ph), é a fim de que se possa esclarecer uma situação reacional sobre o estado e a gravidade que se observa na LMC. A análise citogenética é feita nas células hematopoiéticas, preferencialmente, em amostra da Medula Óssea (MO) por estar em completo processo de divisão celular e conter material satisfatório para análise. A célula deve estar na metáfase, fase de divisão celular mitótica em que os cromossomos estão condensados, os centríolos estão em pólos opostos na célula, ficando os cromossomos na região mediana e presos pelos centrômeros. Apesar de que a técnica de citogenética molecular independe de divisão celular, pois esta mais ligada à análise do DNA feito por outra metodologia (MONTENEGRO, et al., 2008). A citogenética molecular compreende as técnicas de hibridação por Fluorescência (FISH), Reação da Cadeia da Polimerase (PCR), Hibridação Genômica Comparativa (CGH) e Cariotipagem Espectral (SKY), dentre outras. No caso da LMC, o melhor é o bandeamento G. Ao se fazer uma análise de, no mínimo, 20 metáfases, fazendo uma varredura na lâmina e analisando as melhores células, a presença de pelo menos quatro cromossomos Ph + pode levar ao diagnóstico positivo para LMC. Qualquer erro no processo de divisão celular pode acarretar em uma mutação celular. As aberrações cromossômicas podem comprometer tanto os cromossomos sexuais como os autossomos. Essas aberrações são decorrentes de erros na divisão celular, que resultam de uma mutação em uma célula germinativa no progenitor ou de mutação somática, como o que ocorre na LMC. A mutação somática ocorre no tecido somático em desenvolvimento que formará uma população de células idênticas (clones). As mutações de câncer

25 ocorrem em uma categoria de genes celulares normais denominados protooncogenes, responsáveis pelo controle positivo da proliferação e regulação da multiplicação e diferenciação celular. Quando as células sofrem um processo de multiplicação celular totalmente descontrolada, o clone derivado do processo é chamado de tumor (MONTENEGRO, et al., 2008). Na LMC, as duas técnicas disponíveis para monitorização da resposta citogenética são o cariótipo medular e o FISH. O cariótipo medular permite quantificar o número de metafases Ph+ e detectar anomalias cromossómicas adicionais (ACA). Esta técnica deve ser realizada no momento do diagnóstico e a cada seis meses até se atingir a resposta citogenética completa (RCitC). Uma vez obtida a RCitC, o cariótipo medular deve ser efectuado a cada um a dois anos para identificar eventual recaída citogenética, evolução clonal e anomalias cromossómicas em células Ph-. Já o FISH é uma técnica mais sensível que o cariótipo medular para a detecção do gene de fusão BCR-ABL1, mas não detecta as anomalias cromossômicas adicionais. Este é um método de grande utilidade diagnóstica quando não é possível obter metáfases. Porém, o seu valor prognóstico na monitorização de LMC não está estabelecido (ALMEIDA, et al., 2009). 2.3. DIAGNÓSTICO Para estabelecer o diagnóstico da LMC deve ser realizada uma avaliação clínica e laboratorial exaustiva, considerando em particular os seguintes parâmetros: a) Medição da esplenomegalia; b) Hemograma completo com contagem diferencial (basófilo, eosinófilos e blastos); c) Mielograma; d) Biopsia Óseea e) Determinação de cariótipo na medula óssea; f) PCR quantitativopara identificar o tipo de transcrito(bcr-abl1);

26 g) RQ PCR quantitativo (permite caracterizar a fase da doença e defini grupo de risco). Estes parâmetros, além de permitirem a caracterização das diferentes fases da doença, são igualmente importantes na definição do grupo de risco a que pertence cada doente risco relativo (RR). No início da doença, os sintomas são, geralmente, insidiosos e o diagnóstico só é feito quando se realiza uma contagem hematopoiética. Isso pode ser feito através de um hemograma que analisa toda presença da linhagem de células hematopoiéticas do sangue que, possivelmente, levará a suspeitar de uma leucemia. Pode haver a presença de anemia, o número exagerado da série branca (leucócitos) e desvio à esquerda das células sanguíneas. O que também chama bastante atenção é o acometimento do baço, fígado e de gânglios linfáticos. Deve-se fazer uma análise citogenética para observar a presença da anormalidade cromossômica (ALMEIDA et al., 2009; CHAUFFAILLE 2009; MONTENEGRO et al., 2008). 2.4. TRATAMENTO Durante mais de uma década, análises citogenéticas têm sido utilizadas como método de monitoramento do tratamento quimioterápico em pacientes com LMC. Os tratamentos comumente empregados na LMC baseiam-se na administração de quimioterápicos leucorredutores, com resposta citogenética modesta (BARBOZA et al., 2000; LIMA, et al., 2008). Ressalta-se que a doença pode ser controlada com o uso de medicamentos mielossupressores, como bissulfato ou hidroxiuréia. Estes, segundo o Instituto leury, podem levar à regressão do tamanho do baço e, com isso, melhorar o resultado do hemograma. Porém, na citogenética, ocorrerá a persistência do clone Ph na medula óssea (MONTENEGRO et al., 2008).

27 O Interferon alfa (INF-á) foi a primeira terapia eficaz para a LMC. Essa licoproteína de origem biológica exibe propriedades antivirais e antiproliferativas. A droga entrou em ensaios clínicos no início de 1980 e continuou a ser o tratamento de escolha para pacientes com LMC, até uma mudança na estratégia terapêutica, após, a chegada do Imatinib. Em LMC, o interferon, com ou sem associação a outras drogas, como a citrabina ou hidroxiuréia, prolonga a sobrevida dos pacientes, principalmente daqueles que respondem citogeneticamente. É capaz de induzir uma resposta citogenética em 35 a 55% dos pacientes, com uma maior sobrevida em combinação com a quimioterapia. Na terapêutica com INF á, o nível da doença diminui, mas a LMC raramente é eliminada por completo (ANUNCIAÇÃO et al., 2008; MONTENEGRO et al., 2008). Nos últimos anos, houve uma revolução no tratamento da LMC. Surgiram os chamados inibidores de tirosino-quinase. O mesilato de imatinibe (MI) foi o primeiro deles a ser aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA), nos EUA, e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), no Brasil para utilização em pacientes portadores de LMC. A droga ideal para o tratamento da LMC deve inibir os produtos de expressão do gene BCR/ABL. O surgimento do inibidor da tirosino-quinase, mesilato de imatinibe, representou um grande progresso, uma vez que induz altas taxas de resposta citogenética e molecular. Esta droga se liga especificamente à proteína quimérica p210 kd, que atua nos clones celulares Ph +. Atualmente, há um consenso universal na utilização do MI como primeira linha. Apesar do transplante de medula óssea (TMO) ser o único tratamento capaz de promover a cura definitiva da doença, a sua indicação foi reduzida consideravelmente como terapêutica de primeira linha após o MI. (ANUNCIAÇÃO et al., 2008; HAMERSCHLAK, 2008; Leucemia Mieloide Crônica 2006; MONTENEGRO et al., 2008). Estudos indicam que pacientes em tratamento com o mesilato de imatinibe apresentam 80% de possibilidade de alcançar remissão completa, sendo seu uso indicado por pelo menos 5 anos. É administrado via oral bem tolerado por indivíduos mais idosos com leucemia mielóide crônica e apresenta uma menor

28 incidência de efeitos colaterais graves. (Leucemia Mieloide Crônica 2006; HAMERSCHLAK,N 2008) O MI (STI571, Glivec) é um inibidor seletivo da atividade da proteina tirosina quinase codificado pelo gene bcr/abl, pois simula a molécula de ATP, e assim, liga-se ao sítio do ATP no domínio SH1 da enzima, impedindo a fosforilação de substratos envolvidos na regulação do ciclo celular. Funciona melhor nas fases mais precoces da doença, diminuindo sua eficiência à medida que a leucemia progride para as fases acelerada e blástica. O mesilato de imatinibe provoca alguns efeitos colaterais, a maioria dos quais pode ser controlada sem necessidade de interrupção da terapia. (ANUNCIAÇÃO et al., 2008; HAMERSCHLAK,N 2008; MONTENEGRO et al., 2008). Outra característica marcante dessa droga é o seu efeito sobre outros domínios de tirosino-quinases celulares. No tratamento da LMC em fase crônica, o Imatinib produz uma resposta sustentável e superior, em comparação ao INF-á. Apesar da sua notável eficácia no tratamento da LMC, a resistência surge em uma minoria dos pacientes após a administração regular da droga. A resistência pode ser adquirida ou intrínseca, respectivamente, por falta de resposta hematológica e citogenética e pela presença de mutações na região que codifica o domínio de tirosino-quinase da proteína quimérica bcr/abl. (ANUNCIAÇÃO et al., 2008; MONTENEGRO et al., 2008). Novos medicamentos, como o Dasatinibe e o Nilotinibe, aprovados pelo FDA dos Estados Unidos, estão sendo usados para superar a refratariedade ou a intolerância de pacientes ao imatinibe, (CHAUFFAILLE 2009; HAMERSCHLAK, 2008; Leucemia Mieloide Crônica 2006). O dasatinibe passou a ser usado pela vantagem de ligar-se a conformações ativas e inativas do domínio ABL, ou seja, trata-se, de um inibidor de duas vias a via SRC e as quinases relacionadas BCR-ABL. Comparado ao mesilato de imatinibe, o dasatinibe é 300 vezes mais potente in vitro contra a proteína BCR/ABL. Os

29 principais efeitos colaterais relatados com o uso desta droga incluem: retenção de fluidos (50%), derrame pleural (22%), diarreia (49%), sangramento (40%), náusea (34%), dor abdominal (25%) e vômito (22%). Neutropenia e trombocitopenia ocorreram em 49% e 48% dos pacientes em fase crônica respectivamente e em cerca de 70% a 80% dos pacientes em fases avançadas (CHAUFFAILLE 2009; FUNKE et al., 2010). O nilotinibe é uma nova amino pirimidina desenhada para ser mais seletiva para a quinase do BCR-ABL que o imatinibe. Toxicidade hematológica grau 3-4 ocorreu em 29% dos pacientes. Os principais efeitos colaterais não hematológicos incluem: rash (28%), náusea (24%), prurido (24%), fadiga (19%), cefaleia (19%) e aumento de enzimas pancreáticas (42,8%). Este último quadro é geralmente reversível com suspensão temporária e ajuste de dose. Também foram observadas hiperglicemia e hipofosfatemia. Pacientes com história prévia de disfunção cardíaca ou coronariana devem ser seguidos com maior cuidado quando em uso de nilotinibe (CHAUFFAILLE 2009; FUNKE et al., 2010). Antes da Era das drogas antitirosina quinase, o Transplante de Medula Óssea (TMO) era a única opção com potencial de cura e era indicado para todos os pacientes elegíveis. Estudos procuravam saber, até que ponto, esta modalidade terapêutica poderia ser útil. Acreditava-se que células-tronco periféricas teriam baixa ou nenhuma presença do cromossomo Ph, e por isso poderiam ser transplantadas. Os resultados de alguns transplantes autólogos consecutivos em diferentes centros de transplante na Europa e América do Norte, entre 1984 e 1992, revelaram que o procedimento induziu resposta citogenética em uma parte dos pacientes, mas a maioria dos sobreviventes apresentou doença residual. O TMO autólogo é capaz de reduzir o clone Ph+ sem fazê-lo desaparecer, e por isso está fora do uso terapêutico. Entretanto, considerar o TMO autólogo como procedimento descartado na Era do MI ainda é temeroso. O papel desse procedimento em LMC ainda é uma incógnita e está restrito, hoje, a pacientes que

30 não respondem ao mesilato de iamtinibe e possuam um doador HLA compatível (ANUNCIAÇÃO et al., 2008). O tratamento da LMC por transplante de medula óssea (TMO) é realizado usando sangue ou medula óssea derivados de células-tronco a partir de um indivíduo HLA-compatível. Quando realizado na fase crônica da doença oferece uma probabilidade de sobrevida de 60 a 80%, livre de leucemia em 5 anos. Se realizado na fase acelerada dessa doença, a sobrevida diminui. O transplante alogênico, quando oferecido a pacientes de baixo risco para o procedimento, é a melhor opção, mas atenderá apenas uma porcentagem pequena de pacientes recém-diagnosticados (cerca de 10%). O restante dos pacientes, de alto risco para o transplante e sem doador aparentado HLA-compatível, deverá ser tratado, continuamente com o MI, ou até que ocorra a resistência primária ao medicamento (recidiva citogenética ou hematológica ao MI, fase acelerada ou crise blástica). Apesar de seu poder de cura, somente 15-30% dos pacientes serão candidatos ao TMO, tendo como principais limitantes a idade e a indisponibilidade de doador compatível. As taxas de recidiva após o TMO variam de 5-30% na fase crônica, e em fases acelerada e blástica podem chegar a 60%. No transplante de célulastronco hematopoéticas, tanto o sangue como a medula são fontes de célulastronco. Essa abordagem requer um doador HLA compatível parente (relacionado) ou não parente (não-relacionado) e é mais sucedida em pacientes mais jovens. A disponibilidade de um doador relacionado HLA compatível, geralmente é um irmão ou uma irmã com mesmo pai e mãe sendo a chance de compatibilidade de 25%. O doador não-relacionado pode ser verificado através de busca no banco de dados do REDOME (Registro Nacional de Doadores de Medula), que inclui também uma busca internacional (ANUNCIAÇÃO et al., 2008; Leucemia Mieloide Crônica 2006).

31 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS Fica claro ao término deste trabalho que a citogenética é uma ferramenta fundamental no diagnóstico e indispensável no tratamento e estabelecimento de fatores prognósticos para a leucemia mieloide crônica. Pois é somente através da análise citogenética que se obtém um diagnóstico completo e conclusivo para que o monitoramento adequado seja realizado. Sendo assim o objetivo de evidenciar se a citogenética é o procedimento mais recomendado para diagnosticar a leucemia mieloide crônica e direcionar o tratamento adequado foi satisfatoriamente alcançado.

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