POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE Myrcia ovata Cambessedes FRENTE A BACTÉRIAS PATOGÊNICAS DE ALIMENTOS I.C. Jesus 1, A.F. Blank 2, L.C.L.A. Santana 1* 1- Departamento de Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, s/n CEP: 49100-000 São Cristóvão SE Brasil, Telefone: (79) 2105-7420 *E-mail: (aquinoluciana@hotmail.com) 2-Departamento de Agronomia Universidade Federal de Sergipe CEP: 49100-000 São Cristóvão SE Brasil. RESUMO Os óleos essenciais são considerados de grande interesse para as indústrias alimentícias e farmacêuticas desde que o uso de aditivos naturais ganhou importância como tendência na substituição dos conservantes sintéticos artificiais. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano de óleos essenciais extraídos da planta Myrcia ovata Cambessedes frente a 8 bactérias patogênicas de alimentos. A atividade antimicrobiana dos óleos foi testada in vitro através da técnica de difusão em discos e os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) foram também determinados.os óleos essenciais apresentaram halos de inibição entre diâmetros 7,0 e 30,0 mm, valores de CIM entre 0,78 e 400 µl/ml e valores de CBM entre 3,13 a >400 µl/ml. As bactérias P. aeruginosa e B. subtilis foram as mais sensíveis aos óleos, especialmente ao MYRO-157. Os óleos essenciais de Myrcia ovata Cambessedes demonstraram potencial para aplicações futuras como antimicrobianos naturais em alimentos. ABSTRACT- Essential oils are considered of great interest to the pharmaceutical and food industries, since the use of natural additives has gained importance as a trend in the replacement of artificial synthetic preservatives. In this context, this study aimed to evaluate the antimicrobial potential of essential oils extracted from Myrcia ovata Cambessedes plants against 8 foodborne bacteria. The in vitro antimicrobial activity of the oils was tested by disk diffusion test and the values of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were also determined. The essential oils showed diameters of inhibition zone ranged from 7.0 and 30.0mm, MIC values between 0.78 and 400 µl/ml and MBC values ranging from 3.13 to> 400 µl/ml. Bacteria P. aeruginosa and B. subtilis were the more sensitive to oils, especially to MYRO-157. The essential oils of Myrcia ovata Cambessedes showed potential for future applications as natural antimicrobials in food. PALAVRAS-CHAVE: antimicrobiano natural; controle de qualidade; óleo essencial. KEYWORDS: antimicrobial natural; quality control; essential oil. 1. INTRODUÇÃO No Brasil, a investigação sobre produtos naturais com atividade antimicrobiana aumentou significativamente nos últimos anos. Óleos essenciais de plantas há muito tempo têm servido de base para diversas aplicações na medicina popular, entre elas, a produção de antissépticos tópicos. Os óleos essenciais são caracterizados por um forte odor e constituídos por complexas misturas de substâncias voláteis, geralmente lipofílicas cujos componentes incluem hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, ácidos orgânicos fixos, entre outros, em diferentes concentrações. (Bakkali et al., 2008; Burt, 2004). Em geral, a atividade antimicrobiana de óleos essenciais está
associada a presença de compostos como o carvacrol, o timol e o eugenol (fenóis). Logo após os fenóis, em ordem decrescente de funcionalidade, situam-se os álcoois monoterpênicos (Exs: linalol, geraniol, terpineol e mentol), aldeídos (Exs: citral, geranial, citronelal e cuminal), cetonas (Exs: verbenona, tujona, mentona e carvona) e ésteres, (Exs: estragol e aneto) (Novacosk e Torres, 2006). As doenças veiculadas por alimentos (DVA s) ganharam destaque desde que o homem começou a elaborar seu próprio alimento. Estas, podem ser causadas pela ingestão de micro-organismos viáveis (infecção) ou de toxinas, por eles, produzidas (intoxicação) em quantidades suficientes para o desenvolvimento de quadro patológico. Como consequência, um dos grandes problemas da indústria de alimentos, além de garantir a qualidade microbiológica dos alimentos, é aumentar a vida de prateleira dos mesmos, já que a maior parte dos alimentos são de origem vegetal ou animal e se deterioram com facilidade (Jay, 2005). Aliado a isto, tem sido crescente a exigência dos consumidores pelo consumo de produtos naturais. Neste contexto, o potencial uso de óleos essenciais como antimicrobianos naturais tem sido foco de várias pesquisas nos últimos anos. Particularmente, o óleo essencial de Myrcia ovata Cambessedes (Cambess.) tem demonstrado ação larvicida contra o Aedes aegypti (Furtado et al., 2005; Lima et al., 2011), atividade anti-inflamatória (Santos et al., 2014) e antimicrobiana frente a micro-organismos tais como: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia e Candida parapsilosis (Candido et al., 2010). A M. ovata Cambess., popularmente conhecida como laranjinha do mato, é um arbusto de cerca de 8 m de altura, que pertence a Família Myrtaceae, apresenta cerca de 140 Gêneros, e aproximadamente 3000 espécies. O gênero Myrcia corresponde a cerca de 14,6% de todas as espécies vegetais conhecidas desta família. Distribuída principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, as espécies de Myrtaceae são amplamente encontradas no Brasil, sendo uma das famílias de árvores dominantes na Mata Atlântica. Algumas espécies de Myrcia são utilizadas na medicina popular, suas folhas são comumente usadas como chá para o tratamento de doenças gástricas, gastrite e diarréia (Lucas et al., 2011). Contudo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antibacteriano de 7 óleos essenciais de plantas de M. ovata Cambess. oriundas do estado de Sergipe frente a 8 bactérias patogênicas de alimentos. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Óleos essenciais Os óleos essenciais (MYRO-154, MYRO-155, MYRO-156, MYRO-157, MYRO-158, MYRO-159 e MYRO-173) foram doados pelo Laboratório de Fitotecnia do Departamento de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de Sergipe (UFS). As plantas de Myrcia ovata Cambess. foram coletadas em diferentes localizações no município de Japaratuba-SE e os óleos foram extraídos por hidrodestilação utilizando aparelho do tipo Clevenger conforme descrito por Sampaio et al. (2016). 2.2 Micro-organismos As bactérias Pseudomonas aeruginosa (INCQS 00025), Staphylococcus aureus (INCQS 00014), Bacillus cereus (INCQS 00003), Bacillus subtilis (INCQS 00002), Serratia marcescens (INCQS 00131), Escherichia coli (INCQS 00032), Enterococcus faecalis (ATCC 51299) e Salmonella enteritidis (INCQS 00258) foram adquiridas da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz, Manguinhos, Rio de Janeiro). As estirpes foram armazenadas em caldo de infusão de cérebro coração (BHI) e solução de glicerol a 20% à -80ºC em Ultrafreezer.
2.3 Técnica de difusão em discos O potencial antimicrobiano dos óleos essenciais frente às bactérias patogênicas foi avaliado pela técnica de difusão em disco segundo protocolo descrito pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012). Suspensões bacterianas foram preparadas em caldo Muller- Hinton correspondendo a 0,5 da escala de McFarland. As bactérias foram semeadas em ágar mullerhinton e discos de 6 mm de diâmetro contendo cada óleo essencial foi colocado em cada placa contendo o micro-organismo. Os testes foram realizados em triplicata e as placas foram incubadas a 35ºC ± 2 durante 24 h. Após a incubação os halos de inibição foram medidos e os resultados expressos em milímetros. A sensibilidade das bactérias aos óleos foi classificada pelo diâmetro dos halos de inibição como segue: não sensível, para diâmetros inferiores a 8 mm; sensível para diâmetros de 9-14 mm; muito sensível para diâmetros de 15-19 mm; e extremamente sensível para diâmetros maiores de 20 mm (Djenane et al., 2011). 2.4 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) A CIM dos óleos essenciais foi determinada em placas de microtitulação, estéreis contendo 96 poços com fundo em formato U conforme metodologia preconizada pelo NCCLS (2012). O meio de cultura utilizado foi o caldo Muller-Hinton e agente emulsificante, Tween 80 a 1%. As microplacas foram incubadas a 35ºC ± 2 durante 24 h. Os experimentos foram realizados em triplicata. Dos poços onde não houve crescimento microbiano visível foram retirados 100 μl de amostras e semeados em placas de Petri contendo Agar Mueller-Hinton. As placas foram incubadas à temperatura de 35ºC ± 2 durante 24h. A CBM foi aquela onde se observou ausência de crescimento de colônias bacterianas nas placas. 2.5 Análise estatística Os halos de inibição foram expressos em média ± desvio padrão através da análise de variância usando o programa Assistat 7.7 beta. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os óleos essenciais apresentaram halos de inibição entre diâmetros 7,0 e 30,0 mm (Tabela 1). O S. aureus foi extremamente sensível ao MYRO-154 e de sensível a muito sensível aos demais óleos. B. cereus e E. faecalis foram de sensíveis a muito sensíveis aos óleos. A P. aeruginosa e o B. subtilis foram os mais sensíveis ao óleo MYRO-157 onde obteve-se halo de inibição de 30,0 mm. E. coli e S. enteritidis foram os menos sensíveis, enquanto que a S. marcescens não foi sensível a nenhum dos óleos testados. Candido et al. (2010), utilizaram o óleo essencial de M. ovata proveniente do Ceará e também verificaram o potencial antimicrobiano frente a E. faecalis, E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Porém particularmente a P. aeruginosa demonstrou maior sensibilidade aos óleos testados no presente estudo. De forma geral, as bactérias gram-positivas foram mais sensíveis aos óleos do que as gram-negativas. Segundo Burt (2004), isto se deve ao fato das bactérias gram-negativas serem menos susceptíveis a ação de antimicrobianos devido a presença da membrana externa, a qual restringe a difusão de grupos hidrofóbicos através da camada lipopolissarídica. Na Tabela 2 estão demonstradas as concentrações inibitórias mínimas e as concentrações bactericidas mínimas de cada óleo frente às oito bactérias testadas. Os óleos MYRO-154 e MYRO-156
apresentaram o menor valor de CIM (0,78 µl/ml) para as bactérias B. cereus e E. faecalis, respectivamente e os óleos MYRO-154 e MYRO-159 para P. aeruginosa. Os valores de CBM variaram de 3,13 a >400 µlml, sendo o menor valor obtido para o MYRO-154 frente ao B. cereus. Candido et. al (2010) obtiveram valores de CIM e CBM superiores aos obtidos neste trabalho frente a E. faecalis, E. coli e P. aeruginosa (31, 1000 µg/ml e >1000 µg/ml, respectivamente). Tabela 1: Diâmetros dos halos de inibição dos óleos essenciais da Myrcia ovata Cambess. frente à bactérias patogênicas de alimentos. Halos de inibição (mm) Óleos essenciais (MYRO) Bactérias 154 155 156 157 158 159 173 S. aureus 28,5±1,2 13,0±1,5 16,0±1,0 20,0±2,0 11,5±0,5 12,5±0,5 11,0±0,0 B. cereus 13,5±0,5 10,0±0,8 13,0±0,8 20,0±0,0 16,5±0,9 15,0±1,4 17,0±1,0 B. subtilis 25,0±2,0 16,0±0,0 17,0±2,0 30,0±2,5 13,5±0,5 17,5±1,5 16,5±0,7 E. faecalis 20,0±0,0 8,5±0,5 13,0±0,8 17,0±2,0 8,5±0,5 7,5±0,5 12,5±0,7 P. aeruginosa 11,0±0,0 16,5±0,5 16,5±1,2 30,0±0,9 13,0±0,5 15,5±0,5 19,0±1,4 S. marcensces 8,0±0,2 7,0±0,0 8,0±0,4 7,6±0,2 7,0±0,0 7,0±0,2 7,5±0,5 E. coli 10,5±1,2 10,0±0,0 8,0±0,0 9,5±0,5 8,5±0,5 8,6±0,5 8,0±0,0 S. enteritidis 13,0±0,8 9,5±1,2 9,6±0,5 10,5±0,5 8,0±0,0 8,5 ±0,5 7,5±0,5 h Tabela 2: Concentrações inibitórias mínimas (CIM) e concentrações bactericidas mínimas (CBM) (µl/ml) dos óleos essenciais de Myrcia ovata Cambess. frente à bactérias patogênicas de alimentos. Bactérias MYRO 1 2 3 4 5 6 7 8 154 155 156 157 158 159 173 CIM 3,13 0,78 1,56 400 0,78 50 12,5 12,5 CBM 6,25 3,13 400 >400 25 200 50 100 CIM 50 50 6,25 400 50 200 200 200 CBM 200 50 25 >400 100 >400 >400 >400 CIM 25 50 50 0,78 3,13 50 100 12,5 CBM 25 200 400 400 >400 400 400 >400 CIM 12,5 12,5 6,25 200 6,25 200 200 25 CBM 50 50 12,5 100 >400 >400 >400 >400 CIM 25 50 12,5 400 12,5 400 100 50 CBM 200 25 100 >400 100 400 >400 >400 CIM 6,25 25 25 3,13 0,78 25 12,5 6,25 CBM >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 CIM 50 25 12,5 200 3,13 400 100 25 CBM 50 100 25 >400 >400 >400 >400 100 1= S. aureus; 2= B. cereus; 3=B. subtilis; 4= E. faecalis; 5= P. aeruginosa; 6= S. marcensces;7=e. coli; 8= S. enteritidis
4. CONCLUSÕES Os óleos essenciais da planta Myrcia ovata Cambess. apresentaram excelente potencial para a inibição de 8 bactérias patogênicas de alimentos, desde que estas variaram de sensíveis a extremamente sensíveis aos óleos testados. Particularmente a P. aeruginosa e o B. subtilis foram as bactérias mais sensíveis, especialmente ao MYRO-157. A utilização destes óleos como antimicrobianos naturais representa uma interessante alternativa como substituição aos aditivos químicos em alimentos. Estudos futuros são necessários para aplicação dos mesmos em sistemas de alimentos. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., & Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils A review. Food and Chemical Toxicology, 46, 446 475. Burt, S.A. (2004) Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods- a review. International Journal of Food Microbiology, 94, 223-253. Candido, C.S., Portella, C.S.A., Laranjeira, B.J., Silva, S.S., Arriaga, A.M.C., Santiago, G.M.P., Gomes, G.A., Almeida, P.C., & Carvalho, C.B.M. (2010). Effects of Myrcia ovata Cambess. Essential oil on planktonic growth of Gastrointestinal microorganisms and biofilm formation of Enterococcus faecalis. Brazilian Journal of Microbiology, 41, 621-627. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2012) Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard: eleventh edition, M02-11. Wayne, PA: CLSI. Djenane, D., Yangüela, J., Montañés, L., Djerbal, M., & Roncalés, P. (2011). Antimicrobial activity of Pistacia lentiscus and Satureja montana essential oils against Listeria monocytogenes CECT 935 using laboratory media: efficacy and synergistic potential in minced beef. Food Control, 22, 1046-1053 Furtado, R.F, Lima, M.G.A., Neto, M.A., Bezerra, J.N.S., & Silva, M.G.V. (2005). Atividade larvicida de óleos essenciais contra Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae). Neotropical Entomology, 34, 843-847. Jay, J.M. (2005). Microbiologia de alimentos. Porto Alegre: ARTMED. Lima, M. A. A., Oliveira, F.F.M., Gomes, G.A., Lavor, P.L., Santiago, G.M.P., Nagao-Dias, A.T., Arriaga, A.M.C., Lemos, T.L.G., & Carvalho, M.G. (2011). Evaluation of larvicidal activity of the essential oils of plants species from Brazil against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). African Journal of Biotechnology, 10(55), 11716-11720. Lucas, E.J., Matsumoto, K., Harris, S.A., Lughadha, E.M.N., Benardini, B., & Chase, M.W. (2011). Phylogenetics, morphology, and evolution of the large genus Myrcia s.l. (Myrtaceae). International Journal of Plant Sciences, 172, 915 934. Novacosk, R., & Torres R.S.L.A. (2006). Atividade antimicrobiana sinérgica entre óleos essenciais de lavanda (Lavandula offi cinalis), melaleuca (Melaleuca alternifolia), cedro (Juniperus virginiana), tomilho (Thymus vulgaris) e cravo (Eugenia caryophyllata). Revista Analytica, 21, 36-39. Sampaio, T.S., Nizio, D.A.C., White, L.A.S., Melo, J.O., Almeida, C.S., Alves, M.F., Gagliardi, P.R., Arrigoni-Blank, M.F., Junior, A.W., Sobral, M.E.G, & Blank, A.F. (2016). Chemical diversity of a wild population of Myrcia ovata Cambessedes and antifungal activity against Fusarium solani. Industrial Crops and Products, 86,196 209. Santos, G.C.M., Gomes, G.A., Gonçalves, G.M., Sousa, L.M., Santiago, G.M.P., Carvalho, M.G., &Marinho, B.G. (2014). Essential Oil from Myrcia ovata: Chemical Composition, Antinociceptive and Anti-Inflammatory Properties in Mice. Planta Medica, 80, 1588 1596.