SELEÇÃO DE MEIOS DE PRODUÇÃO DE LIPASE POR Aspergillus ssp

SELEÇÃO DE MEIOS DE PRODUÇÃO DE LIPASE POR Aspergillus ssp Lima, B.F. (1) ; Correia, M. A. B. (1) ; Santos Cordeiro, C.C. (1) ; Andrade Silva, N. R. (1) ; Sá Muniz, M. C. (1) ; Amorim, H. S. (1) ; Lima, J. M. M. (2) ; Alves da Silva, C.A. (1) brindizeflima@hotmail.com (1) Universidade Católica de Pernambuco UNICAP, Recife PE, Brasil; (2) Universidade Federal de Pernambuco UFPE, Recife PE, Brasil. RESUMO As lipases produzidas por micro-organismos constituem um grupo de enzimas com elevada aplicação biotecnológica. O gênero Aspergillus apresenta um elevado potencial biotecnológico em produzir inúmeras enzimas extracelulares, ácidos orgânicos e outros metabólitos secundários de importância biotecnológica. Foram realizados ensaios de produção de lipase com as amostras de Aspergillus denominadas de SIS 10 e SIS 16, isoladas da Caatinga de Pernambuco, utilizando diferentes meios de produção de lipase, meio 1: Glicose (0,1g/L), MgSO4.7H 2 O (0,2 g/l), K2HPO4 (O,7g/L), extrato de levedura (O,4g/L), óleo de oliva (2,0 v/v), ph 6,5; meio 2: óleo de oliva (30 ml), peptona (70g/L), NaNO 3 (1g/L), KH 2 PO 4 (1 g/l), MgSO 4.7H2O (0,5 g/l), ph7,0; meio 3: NaNO3 (0,05g/L), MgSO 4.7H 2 O (0,05g/L), KCl (0,05g/L), KH 2 PO 4 (0,2g/L), extrato de levedura (0,1g/L), peptona (0,5g/L), óleo de oliva 1%, ph 5,5. Os experimentos foram realizados em shaker orbital, 150 rpm, 28ºC, durante 144 horas. As amostras coletadas foram submetidas à determinação do ph e atividade lipolítica expressa em U/mL. Os resultados obtidos demonstraram que o meio 2 apresentou uma maior atividade lipolítica para as amostras testadas, sendo que a SIS

10 obteve uma atividade de 22,64 U/mL em 120 horas, e a SIS 16 uma atividade de 26,52 U/mL em 144 horas. Palavras-chaves: Produção Enzimática, Enzima, Caatinga. INTRODUÇÃO A biotecnologia é vista como sendo uma forte e confiável tecnologia, relativamente de baixo risco, capaz de ser implementada em larga escala e em grande variedade de setores industriais (ALENCAR, 2011). As enzimas industriais são grandes representantes dos processos biotecnológicos. O setor de produção de enzimas apresenta muitas iniciativas de pesquisa e desenvolvimento, que resulta na produção de diversos novos produtos e no aprimoramento dos processos e desempenho de produtos já existentes no mercado (SANTOS et al. 2013). Atualmente existem quase 4.000 enzimas que são conhecidas, e destas, cerca de apenas 200 estão sendo utilizadas comercialmente. As maiorias das enzimas industriais são de origem microbiana. E vem conquistando uma faixa crescente do mercado, no entanto várias questões ainda estão em aberto, e persiste à busca de conhecimentos mais específicos, tanto em relação à fisiologia dos micro-organismos, como também a estrutura 2

e comportamento catalítico destas enzimas em meio aquoso e orgânico (CAPRA, 2009; PEREIRA; FREITAS, 2012; CAMARGO, 2012). Enzimas são proteínas que apresentam configuração globular, constituídas de estruturas terciárias ou quaternárias, cuja função principal é atuar como catalisador biológico, acelerando a velocidade de diversas reações químicas existentes no organismo, sem, contudo serem modificadas durante o processo, pois possuem elevada especificidade e estão associadas a todos os eventos metabólicos (SOUZA; RABELLO; ASCHERI, 2011). Biocatalisadoras e com propriedades que as tornam altamente requisitadas, são muito ativas e versáteis, realizando uma serie de transformações de modo seletivo e rápido. A grande vantagem é que elas catalisam as transformações moleculares sem a ocorrência de reações paralelas, o que é comum em sínteses químicas isso devido sua especificidade (MOURA et al.,2013). Neste contexto, este trabalho propôs produzir lipase através de amostras de fungos filamentosos identificados como Aspergillus ssp, isoladas da Caatinga de Pernambuco, utilizando meios reportados na literatura como bons produtores de lipase afim de selecionar as melhores condições de produção. 3

MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismos Foram utilizados culturas de fungos filamentosos do gênero Aspergillus, recolhidos e isolados da Caatinga de Pernambuco denominados de SIS 10 e SIS 16 previamente catalogados no Banco de Culturas da Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP), localizado no Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais (NPCIAMB). As culturas foram mantidas em meio Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), com a seguinte composição: dextrose (40 g/l), peptona (10 g/l), ágar (20 g/l), água destilada 1000 ml e ph 5,6. Inóculo A cultura esporulada foi suspensa em solução de Tween 80 VETEC a 0,01%. A contagem do número de esporos e células em suspensão procedendo-se utilizando câmara de Neubauer e microscópio binocular. Foram utilizados volumes de 2 ml da suspensão quantificados no valor de 10 7. Seleção de meios de produção O crescimento ocorreu em Erlenmeyers de 500 ml em shaker orbital a 86 rpm a 28º C, durante 144 horas, com volume útil de 250 ml (% p:v). 4

As amostras de Aspergillus foram testados em 3 meios de produção da enzima reproduzidos por Colen (2006). O Meio 1 possui a seguinte composição: meio 1: Glicose (0,1g/L), MgSO4.7H 2 O (0,2 g/l), K2HPO4 (O,7g/L), extrato de levedura (O,4g/L), óleo de oliva (2,0 v/v), ph 6,5; meio 2: óleo de oliva (30 ml), peptona (70g/L), NaNO 3 (1g/L), KH 2 PO 4 (1 g/l), MgSO 4.7H2O (0,5 g/l), ph7,0; meio 3: NaNO3 (0,05g/L), MgSO 4.7H 2 O (0,05g/L), KCl (0,05g/L), KH 2 PO 4 (0,2g/L), extrato de levedura (0,1g/L), peptona (0,5g/L), óleo de oliva 1%, ph 5,5. Todo o experimento foi realizado em triplicata, e as amostras coletadas no processo incubação foram submetidas à determinação do ph e atividade lipolítica. Determinação da atividade lipolítica A atividade enzimática de lipase foi detectada através da metodologia descrita por Soares et al. (1999). Foi realizada uma reação de uma mistura contendo 5 ml de uma emulsão de óleo de oliva e goma arábica (7%), 2 ml de tampão fosfato de sódio (0,1 M) ph 7,0 e 1 ml do extrato bruto filtrado da lipase produzida na encubação em meio líquido. A mistura foi agitada em shaker orbital a 82 rpm, 37 ºC, durante 10 minutos. A reação foi parada através da adição de 10 ml de uma mistura acetona-etanol-água (1:1:1), que irá liberar os ácidos graxos livres presentes na mistura, e titulado com uma solução de KOH 5

(0,04 N) na presença do indicador fenolftaleína. Os ensaios foram realizados em triplicatas e a atividade enzimática foi determinada através da seguinte relação: uma unidade da atividade lipolítica (U/mL) será definida como a quantidade da enzima bruta que liberou 1 µ/ml de ácido graxo por minuto. Cálculo da atividade enzimática A atividade enzimática de lipase foi calculada através da equação seguinte equação: AE (U/mL) = (Va-Vb) x N x 1000 t x Vc Ode: AE é a atividade lipolítica (U/mL); Va é o volume da amostra titulada (ml); Vb é o volume da amostra utilizado na reação (ml); N é a normalidade da solução de KOH (mol/l); t é o tempo de reação em minutos (SOARES, et al, 1999). 6

RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste estudo foram realizados ensaios para a determinação da produção de lipase em três diferentes meios de produção denominados de meio 1, meio 2 e meio 3 reportados na literatura como produtores de lipase. Verificou-se que o micro-organismos SIS 10 e SIS 16 obtiveram melhor desempenho no meio 2. O SIS 10 obteve uma atividade lipolítica equivalente a 22,64 (U/mL) em 120 horas, em comparação com o SIS 16 que obteve uma produção equivalente a 26,52 (U/mL) em 144 horas. Os meios 1 e 3 não demonstraram valores significativos de produção de lipase com ambos micro-organismos em comparação com o meio 2. No meio 2 houve um decréscimo na atividade lipolítica em 144 horas com o SIS 10. Esta redução na produção pode ser devido à inativação da enzima por proteases extracelulares (SANCHEZ; DEMAIN, 2002; TAVARES et al., 2011). Tabela 1. Atividade lipolítica do SIS 10 em 3 diferentes meios. Tempo (horas) Meio 1 (U/mL) Meio 2 (U/mL) Meio 3 (U/mL) 24 0 6,52 0 48 0 9,84 0 72 0 17,04 0 96 1,04 20,40 0,52 120 0,64 22,64 0 144 0 10,24 0 7

Tabela 2. Atividade lipolítica do SIS 16 em 3 diferentes meios. Tempo (horas) Meio 1 (U/mL) Meio 2 (U/mL) Meio 3 (U/mL) 24 0 7,72 0 48 0 8,8 0 72 0 21,84 0 96 1,44 22,80 0 120 0 17,32 0 144 0 26,52 0 Carvalho e colaboradores (2005) constatou em um meio de cultura contendo extrato de levedura 0,1%, bactepeptona 0,5%, glicose 1%, óleo de oliva 0,5%, Triton 100 e outros minerais atingiu a atividade lipolítica de 18,0 U/mL 30Cº após 72 horas de incubação utilizando Aspergillus niger van Tieghem, comparando-o com Geotrichum candidum Link ex Leman e Penicillium solitum Westling que obteve atividade lipolítica 12,8U/mL e 10,5U/mL respectivamente. Feitosa (2009) cita que na literatura a temperatura de 37ºC e ph de 7,0 foram definidos como ótimos para as lipase. Variações bruscas dos valores de ph indicam consumo dos substratos no meio (TAVARES et al. 2011). Este fato pode ser evidenciados nas Figuras 1 e 2. 8

Figura 1. Representação da variação do ph nos diferentes meios do micro-organismo SIS 10. CONCLUSÃO Figura 2. Representação da variação do ph nos diferentes meios do micro-organismo SIS 16. As cepas de Aspergillus ssp isoladas da Caatinga de Pernambuco denominadas SIS 10 e SIS 16 demonstraram capacidade para produção 9

de lipase. Dentre os meios utilizados, o meio 2 provou ser eficiente na produção enzimática com o micro-organismos testados. REFERÊNCIAS ALENCAR, A.A.. Produção de bacitracina por Bacillus licheniformis UCP1010 utilizando meio alternativo à base de soro de leite. 2011. 60 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Mestrado Desenvolvimento em Processos Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Recife, 2011. CAPRA, Fernando et al. Efeito da umidade, temperatura e suplementação do meio na produção de lipase por Penicillium simplicissimum utilizando torta de soja como substrato. 1 depto. Engenharia de Alimentos, p.01-07, 2009. CAMARGO, Juliana Fronzel De. The Actual State of Biotechnology In Brazil and the World. Cadernos De Direito, v. 02, n. 1, p.148-162, 2012. COLLEN, Gercernir. Isolamento e Seleção de fungos filamentossos produtores de lipase. 2006. 206 f. Dissertação (Doutorado) - Curso de Ciencias de Alimentos, Faculdade de Farmácia da Ufmg, Belo Horizonte, 2006. SOUZA, Valéria França de; REBELLO, Flávia de Floriani Pozza; ASCHERI, José Luis Ramirez. Fitase: aspectos gerais e suas principais aplicações. Revista Acta Tecnológica - Revista Científica, Rio de Janeiro, v. 6, n. 2, p.53-66, 2011. TAVARES, Ladiel Luiz Pedrozo. Produção de lipase por Bacillus licheniformis (UCP 1014) a partir de meios a base de resíduos da indústria de sorvete. 2011. 80 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Processo de Desenvolvimento Ambiental, Departamento de Núcleo de Pesquisas de Ciências Ambientais (NPCIAMB), Universidade Católica de Pernambuco, Recife PE, 2011. MOURA, Luiz Francisco Wemmenson Gonçalves et al. Bioprospecção de atividade lipolítica de fungos anemófilos isolados do centro vocacional tecnológico (cvt) de tauá-ce. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande PB, v. 15, n. 02, p.157-165, 2013. 10

PEREIRA, Aline Ramalho Brandão; FREITAS, Diego Antônio França de. Uso de microorganismos para a biorremediação de ambientes. Educação e Tecnologia Ambiental, Universidade Federal de Lavras Mg, v. 6, n. 6, p.975-1006, 2012. SANTOS, T.c. Dos et al. Aspergellus niger como produtor de enzimas celuloliticas a partir farelo de cacau (theobroma cacao). Arq. Inst. Biol, São Paulo, v. 80, n. 1, p.65-71, mar. 2013. SANCHEZ, S.; DEMAIN, A. L. Metabolic regulation of fermentation processes, Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p. 895-906, 2002. CARVALHO, Patrícia de O. et al. Potencial de biocatálise enantiosseletiva de lipases microbianas. Química nova, campinas sp, v. 28, n. 4, p.614-621, 28 nov. 2005. SOARES, C. M. F.; CASTRO, H. F.; MORAES, F. F.; ZANIN, G. M. Characterization and utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 77-79, 1999. 13 p. FEITOSA, I. G. Produção de enzima lipolíticas utilizando bactéria isolada de solo com histórico de contato com petróleo em fermentação submersa. 102 p., 2009. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Porcessos) Universidade Tiradentes UNIT, Sergipe, 2009. 11