Disciplina: Microbiologia Geral Esterilização, Assepsia e Preparo de Meios de Cultura. TÉCNICAS LABORATORIAIS EM MICROBIOLOGIA ESTERILIZAÇÃO E ASSEPSIA PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA * Os estudantes devem estar concentrados nas tarefas que desenvolvem, compreender o equipamento, os reagentes e os materiais biológicos que usam. CONCEITOS ANTI-SEPSIA Inativação ou redução do número de microrganismos presentes em um tecido vivo, com substâncias anti-sépticas. DESINFESTAÇÃO Inativação ou redução do número de microrganismos presentes em um material inanimado, não implicando na eliminação de todos os microrganismos viáveis. Porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto ou superfície de trabalho (eliminação de microrganismos patogênicos). ASSEPSIA Impede a entrada de microrganismos em áreas de trabalho. ESTERILIZAÇÃO eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em um determinado material ou ambiente. SANITIZAÇÃO é o tratamento que leva à diminuição da vida microbiana nos utensílios alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde pública. Processo que promove a completa eliminação ou destruição de todas as formas de microrganismos presentes: vírus, fungos, bactérias, ESTERILIZAÇÃO Finalidade da esterilização: Evitar a contaminação; As técnicas assépticas: minimizam a possibilidade das culturas serem contaminadas por organismos vivos do ambiente e impedem que os organismos, especialmente os patógenos, escapem para o meio protozoários, esporos 1
Assepsia: Todas as condições, gestos e atitudes que tendem a manter o estado de ausência de microrganismos contaminantes no meio em que atuam. Agentes desinfetantes: São tipicamente aplicados em objetos, superfícies Agentes antissépticos: São aplicados em tecidos vivos Agentes desinfetantes: Álcool 70%: superfícies de trabalho e câmara de fluxo laminar, entre outros. Porque não utilizar Álcool absoluto???? Hipoclorito de sódio ou de cálcio: o cloro oxida os componentes celulares Detergentes Fosfato Trissódico Assepsia: Dietilpirocarbonato (DEPC): inibidor RNAses Higienização do Laboratório: É fundamental ter os cuidados de assepsia do laboratório e do material nele utilizado Partículas estranhas podem constitui-se de contaminantes Ocasionando perda de experimentos e, ou, interferência nos resultados Higienização do Laboratório: Bancadas e todas as superfícies devem ser desinfestadas, O piso do laboratório, deve ser limpo diariamente com pano umedecido em solução desinfestante. Durante a higienização do piso NÃO se deve varrer, para evitar a suspensão de partículas no ar, principalmente em ambientes com câmara de fluxo laminar Na entrada do laboratório é recomendável manter um pano umedecido em solução desinfestante para limpar os calçados a) ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO: Para vidrarias. ESTUFA OU FORNO DE PASTEUR Geralmente 180 C por 2 horas; Remove toda umidade do material Deve-se envolver todo o material a ser esterilizado em papel alumínio ou outro tipo, para evitar contaminações posteriores 2
Tabela1.Temperatura e tempo necessários para esterilização de vidrarias em estufa. Temperatura Tempo de exposição (min) 170-180 60 160 120 150 150 140 180 B 121 Durante 1 dia ou 1 noite Figura 1. Estufas para esterilização de vidrarias A esterilização de materiais metálicos pela chama de um bico de Bunsen (Flambagem) (300 a 600 º C) Figura 2 Bico de Bunsen e esquema da chama Figura 3 Bico de Bunsen e transferência asséptica b) ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO: Meios de cultura e outros líquidos como soluções Tampões. Utiliza-se AUTOCLAVE Tabela 2. Tempo requerido para esterilização de líquidos em autoclaves de acordo com o volume. Volume do recipiente Erlenmeyer de 1000 ml Erlenmeyer de 500 ml Erlenmeyer de 250 e 125 ml Minutos de exposição a 120ºC e 1 atm 17 20 15 17 12 15 Tubos de ensaio 12 15 Figura 4. Esquema de autoclave horizontal, Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura; Detalhe do cesto de esterilização. 3
Preparação de materiais e vidrarias para esterilização em autoclave: O acondicionamento correto de materiais e de vidrarias é importante para a esterilização eficiente em autoclave A B Pipetas, placas de Petri, tubos e demais intrumentos devem estar corretamente embalados, para que posterior a esterilização possam ser guardados sem ser contaminados. Figura 5. Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura (A); Detalhe do registro e manômetro (B). Preparação de materiais e vidrarias para esterilização em autoclave: Placas e Pipetas devem ser condicionadas em papel de embrulho ou jornal e identificadas Preparação de materiais e vidrarias para esterilização em autoclave: Placas e Pipetas devem ser condicionadas em papel de embrulho e identificadas Figura 6. Placas de Petri sendo embrulhadas em papel Kraft (A); Pipeta embrulhada em Kraft(B). Figura 7. (A) Pipeta embrulhada em Kraft(B) Placas de Petri sendo embrulhadas em papel Kraft Preparação de materiais e vidrarias para esterilização em autoclave: Tubos de cultura devem possuir um tampão de algodão, cobertos por uma coifa feita com pedaço de papel de embrulho Procedimentos para a esterilização de materiais e vidrarias em autoclave: Figura 8. (A) Tubo de ensaio (B) Tubo de ensaio com boneca Figura 9. Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura (A); Detalhe do nível da água em 1 cm abaixo da cruzeta (B). 4
Procedimentos para a esterilização de materiais e vidrarias em autoclave: Observar o nível de água, que deve estar até 1 cm abaixo da cruzeta; Colocar o cesto da autoclave; Colocar todo o material a ser esterilizado na parte superior do cesto; Fechar a tampa, apertando os manípulos em cruz; Ligar a autoclave na potência máxima e abrir o registro (válvula de escape); Aguardar a saída do vapor por 3 a 5 minutos, fechando o registro posteriormente; Alcançada a temperatura de trabalho (121 C), colocar a chave na posição média, ajustando, quando necessário, os pesos que controlam a quantidade de vapor; Marcar o tempo, que deverá ser de 15 a 30 minutos, dependendo do material; Terminado o tempo de esterilização, desligar a autoclave e deixar que o ponteiro do manômetro atinja a posição zero; Abrir o registro aos poucos e aguardar a saída do vapor da autoclave, de maneira que ele seja escoado completamente; Em seguida, abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais, colocando-os em estufa de secagem. Procedimentos para a esterilização de materiais e vidrarias em autoclave: Não abrir o registro antes que o manômetro atinja a posição zero, para evitar que o material esterilizado fique muito molhado e que os papéis que o envolvem se rasguem; Nunca abandonar o local de esterilização, conferindo sempre a temperatura da autoclave, e evitando a quebra de materiais e o RISCO DE EXPLOSÃO. c) ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO: Para substâncias que não podem ser esterilizadas pelo calor. Utilizam-se filtros apropriados Filtros Milipore (0,45 µ e 0,2 µ), proporcionam bons resultados de esterilização por filtração Filtragem Filtro com poro de 5 m Bactérias retidas no filtro Figura 10: Tipos de Filtros Figura 11: Exemplo de Filtragem d) ESTERILIZAÇÃO POR SUBSTÂNCIA GASOSAS: Óxido de propileno pode ser utilizado para esterilizar placas de Petri de plástico com ou sem meio de cultura Pilhas de placas são acondicionadas em sacos plásticos, adiciona um chumaço de algodão embebido com 3-10 ml de OP por 24 h. Placas devem ser retiradas em condições assépticas e) ESTERILIZAÇÃO DE SOLOS : Utiliza-se Autoclave a 120 C por duas horas por 2 dias consecutivos Após a esterilização o solo deve permancer em repouso por 5-7 dias f) ESTERILIZAÇÃO POR RADIAÇÃO ULTRA VIOLETA Lâmpadas UV eficientes na eliminação ou redução de microrganismos do ar Utilizadas em Câmara asséptica CUIDADO!!! 5
A B Figura 12. Câmara asséptica utilizada nas práticas de isolamento, plaqueamento e repicagem (A); Detalhe do interior da câmara (B). Figura 13: Esquema do Filtro da Câmara de Fluxo Laminar g) ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS: Brometo de metila (solos): liberado até 2015 Desinfestantes: Hipoclorito de Sódio Álcool 70% Detergentes Fosfato Trissódico Dietilpirocarbonato (DEPC): inibidor RNAses Destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos e fornecem os princípios indispensáveis ao seu crescimento. O que são? Materiais nutrientes preparados no laboratório para crescimento de microrganismos Substratos naturais ou artificiais Devem conter as substâncias exigidas para o crescimento e multiplicação Devem atender as exigências de fontes de C, N, energia e sais minerais. Função: Isolamento, cultivo, preservação, estudos morfológicos Há uma variedade de meios de cultura, alguns vendidos comercialmente PREPARO DE Figura 15: Balança semi analítica pesando meio de cultura Figura 14. Frascos de Meio de Cultura comercial tradicionalmente utilizado em técnicas de isolamento de microrganismos 6
PREPARO DE a) Quanto a Consistência: -Líquidos: isolamento, formato, cor e tamanho da colônia formada. -Sólidos: cultivo, formação de gás, odor e alterações no ph produzidas pelas bactérias, preservação. -Semi-sólidos: a diferença entre esses tipos é a quantidade de ágar que é acrescentada ao meio. Figura 16. Meio de Cultura sendo vertido para placa de Petri em condições assépticas. SÓLIDO Meio Líquido Bradyrhizobium sp SEMI -SÓLIDO Derxia sp Figura 17. Exemplos de Meios de Cultura de diferentes consistências Figura 18. Exemplo de Meio de Cultura de consistência líquida *ÁGAR: polissacarídeo que tem muitas propriedades que o tornam um agente solidificante ideal, formado por extrato de algas marinhas, é usado na preparação de meios sólidos; Utilizado em uma concentração em torno de 1,5% (p/v), ou 1,5 g/100ml Funde-se em torno do ponto de ebulição da água (100 C), formando uma solução transparente que permanece no estado líquido em torno de 40 C. b) Quanto a Composição: Naturais: material natural com composição desconhecida Ex: Extrato de Malte, batata, extrato de carne. Sintéticos: composição química conhecida Semi-sintéticos: quando não se conhece a composição de alguns componentes do meio Ex: Batata-dextrose-ágar (BDA) 7
c) Quanto a Especificidade: -Gerais: utilizados por uma ampla gama de microrganismos -Seletivos: Específicos para isolamento, crescimento e multiplicação de determinadas espécies ou Gênero de microrganismos d) Condições de cultivo: Bactérias: ph neutro Fungos: condições ácidas - Os meios, após sua preparação, devem ficar sobre o balcão ou interior da câmara de fluxo laminar até o esfriamento à temperatura ambiente. - quando a quantidade de meios preparados é pequena e de uso imediato, eles devem ser armazenados em geladeira e, preferencialmente, dentro de sacos plásticos para evitar maior desidratação. SOLUÇÕES TAMPONANTES -Vírus: não crescem em meios de cultura Ex: Fitovírus Sobrevivem nas células vivas do Hospedeiro Meio de Cultura: Planta Inoculação: introdução do vírus por meio de microferimentos em presença de Soluções Tamponantes no tecido vegetal do Hospedeiro Figura 19. Inoculação mecânica de vírus de plantas 8