Contagem Padrão em Placas Profa. Leila Larisa Medeiros Marques
1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padrão de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis. Aplica-se a amostras de matérias-primas, água e alimentos. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em ágar padrão para contagem seguida de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar padrão para contagem (PCA); Solução salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
2) Meio de Cultura 2.1) Ágar Padrão para Contagem (PCA): a) Composição: Triptona Extrato de Levedura Glicose Ágar Água destilada 5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml Dissolver os componentes em água destilada. O ph final deste meio deve ser 7,0 ± 0,2 Aquecer até completa dissolução Esterilizar em autoclave a 121 o C/15 min. Observações: na forma desidratada, proceder conforme instruções do fabricante.
Ágar padrão para contagem (PCA) desidratado Pesar o ágar padrão para contagem de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução do ágar. Verificar a necessidade de ajuste de ph, conforme norma específica do laboratório. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Esterilizar a 121 ± 1ºC por 15 minutos. Identificar e armazenar adequadamente.
2.2) Solução Diluente: Solução salina peptonada 0,1% (Diluente): Pesar separadamente os seguintes componentes: Cloreto de sódio - 8,5 g Peptona - 1,0 g Água destilada/deionizada - 1000 ml ph 7,0 ± 0,2 Transferir para recipiente adequado. Agitar com auxílio de bastão de vidro até dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de ph, conforme norma específica do laboratório. Distribuir de forma a garantir o volume desejado após a autoclavação. Identificar e datar. Autoclavar a 121 ± 1ºC por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
Obs. MEIOS DE CULTURA: Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes fabricantes podem apresentar pequenas diferenças em suas composições. Observar atentamente a quantidade necessária de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilização em cada caso. Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulação, comparando-a com aquela indicada neste manual. Às vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substância. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-se à peptona de caseína obtida por digestão tríptica ou pancreática.
Grupo de risco de componentes de meio de cultura (Instrução Normativa 62 de 2003): N = nocivo; I = irritante; T = tóxico; H = hidropoluente; P = perigoso para o meio ambiente; C = corrosivo; O = oxidante; F = inflamável; E = explosivo; M = mutagênico; Co = comburente.
3. Metodologia e Técnicas de Análise 3.1. Técnica de análise: a) Retirar assepticamente 25g ou 25 ml da amostra e preparar diluições sucessivas; b) Pipetar alíquotas de 1 ml de cada diluição para placas de Petri (100 x 20 mm) esterilizadas, fazendo de cada diluição placas em duplicata; c) Adicionar a cada placa 15 a 20 ml de ágar padrão para contagem, previamente fundido e resfriado à temperatura de 44 a 46 o C; d) Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de oito (cerca de 10 vezes) e deixar a temperatura ambiente até a completa solidificação do ágar; e) Após a solidificação, incubar as placas em posição invertida a 35-37 o C/48 horas. Obs.: Leitura: - Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colônias; - Amostras de água: Placas que contenham entre 30 e 300 colônias.
Diluições Seriadas: AMOSTRA DE ALIMENTO 225 ML DE DILUENTE (ÁGUA PEPTONADA) Homogeneizar Diluição 10-1 ou 1/10 ou 0,10 1 ml 1 ml 1 ml Diluição 10-2 ou 1/100 ou 0,010 As diluições seriadas devem ser realizadas para a partir delas se fazer a inoculação nos meios de cultura; É feita pelo menos uma inoculação de cada diluição 9 ml diluente Diluição 10-3 ou 1/1000 ou 0,0010 9 ml diluente Diluição 10-4 ou 1/10000 ou 0,00010 Com o alimento diluído, fica mais fácil encontrar uma placa ideal para se fazer a contagem de microrganismos
Inoculação: semeadura pour plate A partir das diluições seriadas: 10-1 10-2 10-4 10-3 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml MEIO MEIO MEIO MEIO Após inoculação, inverter as placas e incubar em estufa ESTUFA 37 o C 24/48 h
Passos da Técnica de Semeadura da Amostra em Profundidade
3.2. Resultado: Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem, somente as placas da mesma diluição que apresentarem de 25 a 250 colônias ou 30 a 300, conforme amostra; Multiplicar a média aritmética das mesmas pelo respectivo fator de diluição e expressar o resultado em Unidades Formadoras de Colônia /1,0 g de amostra (UFC/g) Exemplo: Placa 10-1 : Acima de 1000 UFC (unidades formadoras de colônia) Placa 10-2 : 250 UFC Placa 10-3 : 23 UFC Placa 10-4 : 0 UFC A melhor placa para se obter o resultado desta contagem é a placa da diluição 10-2. Resultado: 250 x 10 2 = 250 x 100 = 25.000 UFC/g ou ml Expressar o resultado sempre em exponencial: 2,5 x 10 4 UFC/g de alimento.
4) Significado nos Alimentos Esta contagem detecta em um alimento, o número de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas presentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada; A contagem padrão em placas (CPP) tem sido usada como indicador da qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéia sobre seu tempo útil de conservação.
Sua presença em grande número indica: Matérias-primas excessivamente contaminadas; Limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas; Higiene inadequada na produção; Condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas circunstâncias. OBS 1.: Estudar a aula de microrganismos indicadoresmesófilos!!!!!!!!!! OBS2.: Para expressão dos resultados, consultar a IN62, 2003 (anexo IV- procedimento para contagem de colônias).