c-kit pharmdx Referência K testes para utilização manual Finalidade Para Utilização em Diagnóstico In Vitro.

c-kit pharmdx Referência K1906 25 testes para utilização manual Finalidade Para Utilização em Diagnóstico In Vitro. O ensaio c-kit pharmdx consiste num sistema de kit de imuno-histoquímica (IHC) qualitativa utilizado para identificar a expressão da proteína/antigénio CD117 (proteína c-kit) em tecidos normais e neoplásicos fixados em formol e impregnados em parafina para avaliação histológica. Os anticorpos policlonais de coelho c-kit pharmdx detectam especificamente a proteína c-kit em células que expressam o antigénio CD117. O c-kit pharmdx é indicado para auxiliar nos diagnósticos diferenciais de tumores estromais gastrointestinais (GIST). Após o diagnóstico de GIST, os resultados do c-kit pharmdx podem ser utilizados como auxiliares para a identificação dos doentes elegíveis para o tratamento com Gleevec /Glivec (mesilato de imatinib). Os resultados dos corantes hematoxilina e eosina (H&E) e um painel de anticorpos podem auxiliar no diagnóstico diferencial de GIST. A interpretação tem que ser efectuada por um patologista qualificado, dentro do contexto do historial clínico do doente, dos controlos adequados e através de outros testes de diagnóstico. Nota: Este teste não se destina a ser a única base para realização do diagnóstico de GIST e não se destina a ser a única base para selecção da terapia com Gleevec/Glivec. O resultado dos doentes de GIST negativos para c-kit tratados com Gleevec/Glivec não foi estabelecido. Um resultado negativo não exclui necessariamente o diagnóstico de GIST, nem deve excluir o tratamento com Gleevec/Glivec 1,2,3 Todos os indivíduos incluídos nos ensaios clínicos Novartis Gleevec/Glivec foram seleccionados utilizando um ensaio clínico realizado pelo laboratório Novartis. O reagente de anticorpo policlonal de coelho anti-c-kit primário utilizado no NCTP foi comprado à Dako. O reagente policlonal primário c-kit pharmdx foi submetido ao mesmo método de produção, purificação e controlo de qualidade que o reagente anti-c-kit policlonal do NCTP. Resumo e explicação Introdução O c-kit proto-oncogene, conhecido também por antigénio CD117 ou Receptor do Factor da Célula Germinal, é um receptor transmembranário de tipo III da tirosina cinase, de 145 kd. O gene c-kit codifica o receptor transmembranário da tirosina cinase, com uma estrutura semelhante aos receptores A e B do factor de crescimento derivado de plaqueta, bem como ao receptor do factor 1 estimulador de colónias e pensa-se que desempenha um papel importante na hematopoiese, espermatogenese e melanogenese. A proteína c-kit contém domínios extracelulares com 5 ansas tipo Ig, um domínio transmembranário altamente hidrofóbico e um domínio intracelular com actividade da tirosina cinase dividido por uma inserção de cinase numa região de ligação de ATP e num domínio da fosfotransferase. A activação do receptor é acompanhada pela dimerização do receptor, fosforilação do substrato e autofosforilação, internalização do receptor, activação de cinases proteicas e fosfolipases, e transcrição de proto-oncogenes diferentes. 4 Tem sido demonstrada a importância do receptor da tirosina cinase (c-kit) no crescimento do tumor e na progressão de vários tipos de cancros. 5 As mutações no gene c-kit podem conduzir a fosforilação (activação) independente do ligante do receptor c-kit da tirosina cinase e crê-se que desempenham um papel patogénico central, por exemplo, nos tumores estromais gastrointestinais. 6 Os tumores mesenquimais gastrointestinais são conhecidos pela dificuldade que demonstram em serem diferenciados uns dos outros e diagnosticados. Em 2001, o mesilato de imatinib (Gleevec, Novartis, Basel, Suíça) foi aprovado pela US Food and Drug Administration, para o tratamento de tumores estromais gastrointestinais (GIST). A aprovação teve por base um estudo clínico no qual participaram adultos com GIST, que expressavam a proteína c-kit, conforme demonstrado por imuno-histoquímica (Ensaio Clínico realizado pelo laboratório Novartis) e que foram tratados com mesilato de imatinib. 7 Os casos de GIST (tumores estromais gastrointestinais) são descritos como três categorias morfológicas: célula fusiforme, epitelióide e tipos mistos. Independentemente da morfologia, a maioria dos GIST's expressam a proteína c-kit numa proporção significativa das células tumorais. 8-11 De referir, que uma percentagem pequena de GIST's não expressa a proteína c-kit. Relativamente poucos outros tumores podem ser positivos à proteína c-kit. Estes incluem o melanoma metastásico, angiosarcoma, sarcoma de Ewing, mastocitoma, seminoma e o carcinoma pulmonar de células pequenas. Os GISTs também são normalmente positivos para a caldesmona de peso molecular elevado, são frequentemente positivos para a CD34 (60 80%), e geralmente negativos para a desmina e a proteína S100. 12 Especificidade Os anticorpos policlonais c-kit de coelho foram obtidos através de injecção subcutânea de um péptido de 14 aminoácidos (aa) (posições 963-976 do terminal C' intracelular da proteína c-kit) associados à tiroglobulina. O antissoro foi especificamente purificado através de cromatografia de afinidade com tiol activado AvidGel F e ligação do antigénio. (111768-003) 305757PT_001 p. 1/15

Também se demonstrou que um número pequeno de sarcomas dos tecidos moles são positivos à c-kit. 6 Algumas destas amostras (ex: leiomiosarcoma) foram testadas para demonstração da expressão da c-kit. O estudo envolveu uma comparação entre o ensaio c-kit pharmdx e o Protocolo do Ensaio Clínico da Novartis (NCTP), usado na selecção de doentes para o tratamento com Gleevec durante os ensaios clínicos realizados pela Novartis. Duas amostras, num total de vinte e oito amostras testadas, apresentaram coloração positiva. O resultado foi consistente utilizando os dois protocolos. A imuno-coloração positiva foi totalmente abolida após a absorção do anticorpo primário com um péptido sintético (extremidade C-terminal de 16 aminoácidos da proteína c-kit). Deste modo, o anticorpo primário utilizado no ensaio c-kit pharmdx reagiu especificamente com a proteína c-kit nos dois sarcomas dos tecidos moles que apresentaram coloração positiva. Os estudos internos com c-kit pharmdx demonstraram a expressão da proteína c-kit numa variedade de células normais. Estas células incluem células mioepiteliais e dos ductos da mama, processos das células Purkinje, células em lâmina própria do cólon, epitélio tubular do rim, melanócitos e células mioepiteliais da pele, Células intersticiais de Cajal do intestino delgado e mastócitos. A reactividade citoplásmica nos granulócitos foi provocada pela actividade da peroxidase endógena e foi visível com o Reagente de Controlo Negativo. Reagentes A referência K1906 refere-se a Coloração Manual. Os materiais apresentados são suficientes para 25 testes (25 lâminas de doentes e 10 lâminas de controlo incubadas com reagente de anticorpo primário contra a proteína c-kit e 25 lâminas incubadas com o Reagente de controlo negativo correspondente). O número de testes baseia-se na utilização do protocolo c-kit pharmdx Autostainer (Dispositivo de coloração manual) com os reagentes prontos para utilizar. O kit fornece materiais suficientes para, no máximo, 10 processos de coloração individuais. Materiais fornecidos Quantidade Descrição 1x4 ml IgG Policlonal de Coelho c-kit pharmdx IgG policlonal anti-humano de coelho contra a c-kit num tampão Tris-HCl, com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. 1x4 ml Reagente de Controlo Negativo IgG de Coelho IgG policlonal de coelho com uma concentração maior ou igual à concentração do anti-c-kit positivo, num tampão Tris-HCl, com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. 2x5 lâminas Lâminas de Controlo c-kit pharmdx Cada lâmina contém secções de duas linhas celulares de rato (+) e humanas (-) aglomeradas, fixadas em formol e impregnadas em parafina, que representam níveis moderados de expressão e ausência de expressão da proteína c-kit. As classificações de coloração IHC dos aglomerados de células são 2+ e 0. Princípio do procedimento O kit para IHC c-kit pharmdx contém anticorpos policlonais e lâminas de controlo para completar um procedimento de coloração IHC em amostras fixadas em formol e impregnadas em parafina. Após a incubação com os anticorpos policlonais primários contra a proteína c-kit humana, este kit é optimizado para utilização com um reagente de visualização pronto para utilizar, baseado na tecnologia de dextrano. Este reagente é constituído por moléculas de anticorpo secundário de caprino anti-coelho e moléculas de peroxidase de rábano (horseradish peroxidase) ligadas a uma estrutura base de polímero dextrano comum eliminando, assim, a necessidade de uma aplicação sequencial do anticorpo de ligação e do conjugado de peroxidase. A conversão enzimática do cromogénio posteriormente adicionado resulta na formação de um produto de reacção visível no local do antigénio. Em seguida, é possível aplicar um contrastante e uma lamela na (111768-003) 305757PT_001 p. 2/15

amostra. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio óptico. As lâminas de controlo contêm duas linhas celulares humanas e de ratinho fixadas em formol e impregnadas em parafina, com intensidades de coloração de 2+ e 0, respectivamente, e são fornecidas para controlo de qualidade do desempenho dos reagentes do kit. Materiais necessários, mas não fornecidos O protocolo de IHC c-kit pharmdx foi validado usando os seguintes reagentes Dako: Wash Buffer (referência S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (referência S2003) Target Retrieval Solution (referência S1699 ou S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (referência K4002 ou K4003) DAB+ (referência K3467 ou K3468) Nota: Para garantir resultados de coloração adequados, apenas se devem utilizar estes reagentes com o c-kit pharmdx. Os desvios ao protocolo recomendado não foram validados. Os outros materiais necessários para realizar o protocolo c-kit pharmdx incluem: Hematoxilina, com base alcoólica ou aquosa como, por exemplo, Dako s Hematoxylin (Hematoxilina da Dako) (referência S3301 ou S3302) Lamelas Banho de água, devidamente calibrado e capaz de manter uma temperatura de 95 99 C ou uma panela de pressão, devidamente calibrada e capaz de aquecer a 125 C. Água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) Estufa de secagem, com capacidade para manter 56 60 C Etanol, absoluto e a 95% Microscópio óptico (ampliação de objectiva de 4x 40x) Meio de montagem, tipo Dako s Faramount (referência S3025) ou Dako s Glycergel (referência C0563) ou Dako s Ultramount (referência S1964) Tecidos positivos e negativos para utilizar como controlos do processo (consultar a secção Controlo de qualidade) Lâminas, Fisher s SuperFrost Plus, lâminas revestidas com poli-l-lisina, lâminas carregadas, ou Dako s Silanized Slides (Lâminas Silanizadas da Dako) (referência S3003) (consultar a secção Preparação das Amostras) Frascos ou banhos de coloração Cronómetro (com intervalos de 2 a 30 minutos) Frasco de lavagem Xilol, tolueno ou substitutos de xilol Pipeta de 1 ml Câmara Húmida Nota: Todos os reagentes incluídos ou disponíveis em separado como, por exemplo, o Dako s Wash Buffer (Tampão de lavagem Dako) (referência S3006) são formulados especificamente para utilização com este teste. De forma a que o teste tenha o desempenho especificado, não podem ser feitas substituições. Precauções 1. Para utilizadores profissionais. Para Utilização em Diagnóstico In Vitro. 2. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), um produto químico que é altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificadas como perigosas, as acumulações de NaN 3 podem reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azidas na canalização. 3. Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados relativamente aos reagentes e amostras. 4. Os tempos e as temperaturas de incubação ou métodos diferentes dos especificados podem originar resultados erróneos. 5. Não substituir os anticorpos primários ou os reagentes de controlo negativo por anticorpos primários nem por reagentes de controlo negativo de lotes de fabrico diferentes (os números de lote são indicados nas etiquetas dos frascos) ou por reagentes de outros fabricantes. Isto pode originar resultados erróneos. 6. Os reagentes do kit são diluídos de forma ideal para utilização com os reagentes recomendados. A diluição subsequente não é recomendada e pode originar a perda de coloração do antigénio. O utilizador deve verificar estas alterações. 7. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 8. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações federais, estatais e locais. 9. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível para utilizadores profissionais, mediante pedido. (111768-003) 305757PT_001 p. 3/15

Declarações de risco e segurança DAB Chromogen* Contém: 1-5% Bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraamónio tetracloreto / Símbolo de Perigo: Nocivo R 40 Evidência limitada de efeitos carcinogénicos. R43 Pode causar sensibilização em contacto com a pele. R68 Possibilidade de efeitos irreversíveis. S35 Deitar fora este produto e o seu recipiente com a devida precaução. S 36/37 Usar vestuário de protecção e luvas adequados. Como regra geral, as pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre os procedimentos de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. (em conformidade com a Directiva da União Europeia 94/33/EC). Consultar a Ficha de Dados de Segurança do Material (FDSM) para obter informações adicionais. (*O DAB Chromogen é um material necessário mas não incluído neste kit). Conservação Conservar o c-kit pharmdx entre 2 e 8 C. As lâminas de controlo devem ser igualmente conservadas entre 2 e 8 ºC. Não utilizar o kit após o fim do prazo de validade impresso no exterior da embalagem. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto, por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras de doente. Caso os reagentes sejam conservados noutras condições além das que se encontram especificadas no folheto informativo, o utilizador deve validar tais condições. 13 Declaração de qualidade Preparação das amostras Os reagentes do c-kit pharmdx foram submetidos a um controlo de qualidade por imuno-histoquímica utilizando as seguintes condições: recuperação do alvo numa panela Pascal pressure cooker (referência S2800) programada para 30 segundos a 125 C, arrefe cimento a 90 C, seguido pelo sistema EnVision+ Rabbit, HRP. As amostras de biópsias devem ser manuseadas de forma a preservar os tecidos para a coloração IHC. Devem ser utilizados para todas as amostras métodos padrão de processamento de tecidos. 14 Secções impregnadas em parafina Os tecidos fixados em formol e impregnados em parafina são adequados para utilização. Os agentes de fixação alternativos não foram validados e podem originar resultados erróneos. As amostras da biopsia devem ser divididas em blocos de 3 ou 4 mm de espessura e fixadas durante o período de tempo adequado para o agente de fixação. Os tecidos são depois desidratados e limpos numa série de álcoois e xilol, seguida pela infiltração com parafina derretida. A temperatura da parafina não deve exceder os 60 C. Os blocos de tecido adequadamente fixados e impregnados que expressem a proteína c-kit manter-se-ão indefinidamente antes do 14, 15 seccionamento e da montagem na lâmina, desde que conservados em local fresco (15-25 C). As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 3 5 µm. Após o seccionamento, os tecidos devem ser montados em lâminas Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (referência S3003), lâminas carregadas ou lâminas revestidas com poli-l-lisina e colocados em suportes de secagem. Os suportes de lâminas devem ser colocados sobre papel absorvente, batendo para remover a água retida sob a parafina e no vidro e, em seguida, secos à temperatura ambiente durante uma hora. O suporte de lâminas deve, em seguida, ser colocado numa incubadora a 56 60 C, durante uma ho ra. Qualquer excesso de água remanescente nas lâminas após a remoção da incubadora deve ser retirado batendo ligeiramente com as lâminas sobre papel e secando-as durante mais uma hora na incubadora. Depois de serem retiradas da incubadora, as lâminas devem manter-se à temperatura ambiente até arrefecerem e a parafina endurecer. Para preservar a antigenicidade, as secções de tecido, montadas nas lâminas, devem ser coradas no período de 2 meses após o seccionamento, quando mantidas à temperatura ambiente (20 25 C). Consultar o Manual da Dako: "Métodos de coloração imuno-histoquímica 16 ou as Referências 14 e 15 para mais informações sobre a preparação das amostras. A utilização de tecidos descalcificados não foi validada e, por sua vez, não é recomendada. Devem ser preparadas, na mesma altura, as lâminas necessárias para a avaliação da c-kit e a verificação da presença de tumores. Devem ser preparadas no mínimo 5 lâminas, 1 lâmina para verificar a presença de tumor, 2 lâminas para avaliação da proteína c-kit e 2 duas lâminas de apoio. Preparação dos reagentes Antes da coloração devem ser preparados os seguintes reagentes: Target Retrieval Solution (referência S1699) Preparar uma quantidade suficiente de Target Retrieval Solution (Solução de Recuperação do Alvo), diluindo a Target Retrieval Solution 10x, 1:10 utilizando água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) para as etapas de lavagem. Eliminar a Target Retrieval Solution após a sua utilização. Nota: Quando utilizar Dako s Target Retrieval Solution (Solução de Recuperação do Alvo Dako) (referência S1700) não é necessária diluição. (111768-003) 305757PT_001 p. 4/15

Wash Buffer Solution (referência S3006) Preparar uma quantidade suficiente de Wash Buffer (tampão de lavagem), diluindo o Wash Buffer 10x, 1:10 utilizando água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) para as etapas de lavagem. Conservar a solução não utilizada entre 2 e 8 C por um perío do inferior a 7 dias. Eliminar o tampão, caso este fique turvo. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (referência 3467 ou K3468) Antes de ser utilizada, esta solução deve ser completamente misturada. O desenvolvimento de precipitado na solução não afecta a qualidade da coloração. Para preparar a Solução de substrato-cromogénio DAB+, adicionar 1 gota de Cromogénio líquido DAB+ a um ml de Tampão de substrato DAB+ e misturar. Eliminar a solução não usada. A estabilidade do DAB+ preparado é de aproximadamente 5 dias, se conservado entre 2 e 8 ºC. Nota importante: A cor do Liquid DAB+ Chromogen no frasco pode variar de incolor a castanho-lavanda claro. Tal não afectará o desempenho deste produto. Diluir de acordo com as orientações acima fornecidas. A adição de Liquid DAB+ Chromogen em excesso ao tampão DAB+ Substrate Buffer resultará na deterioração do sinal positivo. Meio de montagem Recomenda-se a utilização de um meio de montagem permanente não aquoso como, por exemplo, o Dako Ultramount (referência S1964). São igualmente adequados meios de montagem aquosa como, por exemplo, o Dako Faramount Mounting Medium, pronto a utilizar (referência S3025) ou Dako Glycergel Mounting Medium (referência C0563). Antes da utilização, liquefazer o Glycergel, aquecendo-o até atingir aproximadamente 40(±5) C. Procedimento para coloração manual Notas do procedimento Antes da utilização, o utilizador deve ler estas instruções com cuidado e familiarizar-se com todos os componentes (consultar Precauções). Antes da imunocoloração, todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20 25 C). Do mesmo modo, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Durante o procedimento de coloração, não permitir a secagem das secções de tecido. As secções de tecido secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica. Para evitar a secagem das lâminas, colocar as mesmas numa câmara de atmosfera húmida. Nota: Os reagentes e instruções fornecidos neste sistema foram concebidos para se obter um desempenho óptimo quando utilizados com os reagentes e materiais utilizados. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos ou discordantes. Desparafinização e rehidratação Antes da coloração, as lâminas de tecido devem ser desparafinizadas, de forma a remover o meio de impregnação, e rehidratadas. Remover totalmente a parafina. A presença de resíduos de meio de impregnação aumentará a coloração não específica. ETAPA 1. Colocar as lâminas num banho de xilol e incubar durante 5 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez. ETAPA 2. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em etanol absoluto durante 3 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez. ETAPA 3. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em etanol a 95% durante 3 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez. ETAPA 4. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em água de qualidade reagente durante 5 (±1) minutos. ETAPA 5. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em Tampão de lavagem. Iniciar o ensaio conforme delineado no Protocolo de coloração. As soluções de xilol e álcool devem ser substituídas após 40 lâminas. Os substitutos do xilol ou tolueno como, por exemplo, o Histoclear podem ser utilizados em vez de xilol. Recuperação do alvo Procedimento recomendado: Banho de Água ETAPA 1. Encher Frascos de Coloração, por exemplo, frascos Coplin, com a Target Retrieval Solution diluída (consultar Preparação do Reagente). Colocar os Frascos de Coloração com Target Retrieval Solution num banho de água. Aquecer o banho de água e a Target Retrieval Solution até 95 99 C (não deixar ferver). Cobrir os frascos com tampas para estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. ETAPA 2. Imergir as secções desparafinizadas à temperatura ambiente na Target Retrieval Solution previamente aquecida nos frascos de coloração. Re-equilibrar a temperatura do banho de água e da Target Retrieval Solution para 95 99 C. Incubar durante 20 (±1) minutos a 95 99 C. (111768-003) 305757PT_001 p. 5/15

ETAPA 3. Retirar o frasco com as lâminas de dentro do banho de água. Deixar as lâminas arrefecer dentro da Target Retrieval Solução durante 20 (±1) minutos, à temperatura ambiente. ETAPA 4. Decantar a Target Retrieval Solution e lavar as secções em Wash Buffer (consultar a Preparação de Reagentes). ETAPA 5. Para um desempenho ideal, ensope as secções em Wash Buffer durante 5 (±1) minutos, após a recuperação do alvo e antes da coloração. Recuperação do alvo Panela de pressão (30 segundos a 125 C) É muito importante manter a consistência no protocolo de recuperação do alvo para garantir a reprodutibilidade dos resultados de coloração. A panela de pressão utilizada deve ter capacidade de alcançar e manter uma temperatura de 125 C e cada processamento na panela de pressão deverá incluir o mesmo volume total de líquido (solução Target Retrieval Solution e água no recipiente da panela de pressão), assim como o mesmo número total de lâminas. O protocolo ideal é descrito em seguida: ETAPA 1. Para cada processo adicionar um volume consistente de água de qualidade reagente ao recipiente da panela de pressão (500 ml ou consultar as instruções do fabricante). ETAPA 2. Encher cada um dos dois recipientes de plástico de coloração resistentes ao calor que irão conter um suporte de 24 lâminas com 250 ml de Target Retrieval Solution preparada (consultar Preparação dos reagentes). ETAPA 3. Imergir as secções desparafinizadas à temperatura ambiente em Target Retrieval Solution, que se encontra nos frascos de coloração. Nota: Para fins de consistência, cada processo na panela de pressão deve conter 48 lâminas, devendo ser utilizadas lâminas vazias para encher os suportes de coloração no caso de existirem menos do que 48 lâminas de amostras para serem processadas; se se pretender processar 24 ou um número inferior de lâminas, de modo a conservar a solução Target Retrieval Solution o segundo recipiente de coloração pode ser cheio com 250 ml de água. ETAPA 4. Colocar os dois recipientes de coloração na panela de pressão e apertar bem a tampa. ETAPA 5. Definir a panela de pressão de modo a se obter um aquecimento de 125 C; incubar as lâminas a 125 C durante 30 segundos. Aguardar 30 minutos par a que a panela de pressão arrefeça, sem deixar sair a pressão, antes de abrir. ETAPA 6. Antes de abrir a panela de pressão, certificar-se de que a pressão foi libertada. Retirar os recipientes de coloração, decantar a Target Retrieval Solution e lavar as secções em Wash Buffer ou água de qualidade reagente. ETAPA 7. Ensopar as secções em Wash Buffer durante 5 (±1) minutos, após a recuperação do alvo e antes da coloração. Nota: A Target Retrieval Solution é concebida para uma única aplicação. Não voltar a utilizá-la. Protocolo de Coloração Manual ETAPA 1. Dual Endogenous Enzyme Block (referência S2003) Remover o excesso de água com pequenas pancadas. Utilizando um pano sem fios, limpar cuidadosamente em redor da amostra para remover qualquer resto de líquido e para manter o reagente na área determinada. Aplicar Dual Endogenous Enzyme Block em quantidade suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo (100 µl)]. Incubar 5 (±1) minutos. Lavar suavemente com Wash Buffer a partir de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente sobre o tecido ou o tecido pode ser lavado da lâmina). Colocar num banho de Wash Buffer recém-preparado durante 5 (±1) minutos. ETAPA 2. Anticorpo Primário ou Reagente de Controlo Negativo Colocar as lâminas numa câmara húmida durante a etapa de Anticorpo Primário/Reagente de Controlo Negativo e incubações de Polímeros Marcados, para evitar a secagem dos tecidos. Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar Anticorpo Primário/Reagente de Controlo Negativo em quantidade suficiente para cobrir a amostra [3 gotas no mínimo (100 µl)]. Incubar 30 (±1) minutos numa câmara de atmosfera húmida. Lavar as lâminas como na etapa 1. ETAPA 3. EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (referência K4002 ou K4003) Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar solução de Polímero Marcado suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo 100 µl). Incubar 30 (±1) minutos numa câmara de atmosfera húmida. Lavar as lâminas como na etapa 1. (111768-003) 305757PT_001 p. 6/15

ETAPA 4. DAB+ Substrate-Chromogen Solution (referência K3467 ou K3468) Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar Solução de Substrato-Cromogénio DAB+ preparada em quantidade suficiente para cobrir a amostra [3 gotas no mínimo (100 µl)]. Incubar 10 (±1) minutos. Lavar suavemente com água de qualidade de reagente a partir de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente sobre o tecido ou o tecido pode ser lavado da lâmina). Recolher os resíduos de DAB+ Substrate-Chromogen Solution para um recipiente para materiais perigosos, para uma eliminação correcta. Colocar num banho de água de qualidade reagente durante 2 a 5 minutos. Prosseguir para Contrastante e Montagem. Contrastante (instruções para a hematoxilina) O produto final colorido da reacção de coloração é insolúvel em água e álcool. Pode ser utilizada a hematoxilina com base alcoólica ou aquosa como, por exemplo, Dako Hematoxylin (Hematoxilina da Dako) (referência S3301, automático; ou S3302, manual). Não utilizar contrastantes regressivos. ETAPA 1. Imergir as lâminas num banho de hematoxilina. Incubar durante 2 a 5 minutos, dependendo da concentração da hematoxilina usada. ETAPA 2. Lavar, com cuidado, num banho de água de qualidade reagente. Assegurar-se de que toda a Hematoxilina residual foi removida. Nota: Recomenda-se vivamente a utilização de Dako s Hematoxylin (Hematoxilina da Dako) (referência S3302). Utilizando uma incubação de 3 minutos, este contrastante produz um produto final de cor púrpura clara/azul que não oculta a imunocoloração específica. Uma contrastação intensa poderá ocultar uma expressão de c-kit/cd117 fraca. ETAPA 3. Lavar, com cuidado, num banho de água de qualidade reagente durante 2 a 5 minutos. Montagem Recomenda-se a utilização de um meio de montagem permanente não aquoso como, por exemplo, o Dako Ultramount (referência S1964). São igualmente adequados meios de montagem aquosa como, por exemplo, o Dako Faramount Mounting Medium, pronto a utilizar (referência S3025) ou Dako Glycergel Mounting Medium (referência C0563). Antes da utilização, liquefazer o Glycergel, aquecendo-o até atingir aproximadamente 40(±5) C. Nota: É recomendável que as lâminas sejam lidas no máximo seis semanas após a coloração. No entanto, poderá ocorrer algum esbatimento, dependendo de vários factores incluindo, mas não se limitando a: contrastação, materiais e métodos de montagem e condições de conservação das lâminas. Para minimizar o esbatimento, conservar as lâminas à temperatura ambiente (20-25 C), em local escuro. Controlo de qualidade Quaisquer desvios dos procedimentos recomendados para a fixação de tecidos, processamento e impregnação no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade significativa nos resultados, sendo necessária a execução regular de controlos internos, em adição às lâminas de controlo Control Slides fornecidas pela Dako. Nos EUA, consultar as orientações do controlo de qualidade do College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Consultar igualmente a CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline 17 e as referências bibliográficas 18 a 21 para mais informações. Lâminas de Controlo c-kit pharmdx (fornecido) Cada uma das lâminas de controlo fornecidas contém duas linhas celulares de rato (+) e humanas (-) aglomeradas, fixadas em formol e impregnadas em parafina, com intensidades de coloração de 2+ e 0. Em cada procedimento de coloração deve ser corada uma lâmina. A avaliação das linhas celulares das lâminas de controlo fornecidas pela Dako indica a validade do processo de coloração. Estas lâminas não deverão ser utilizadas para auxiliar a interpretação dos resultados dos doentes. Tecido de controlo positivo Os controlos devem consistir em amostras de autópsia/biopsia/cirúrgicas frescas fixadas, processadas e impregnadas logo que possível, da mesma forma que a(s) amostra(s) do doente. Os controlos de tecido positivo são indicadores de tecidos correctamente preparados e de técnicas de coloração correctas. Em cada processo de coloração deve ser incluído um controlo de tecido positivo para cada conjunto de condições de teste. Os tecidos utilizados para os controlos de tecido positivos devem exibir uma coloração positiva fraca, de forma a que seja possível detectar alterações subtis na sensibilidade do anticorpo primário. As lâminas de controlo fornecidas com este sistema ou as amostras processadas de forma diferente em relação à(s) amostra(s) dos doentes validam apenas o desempenho do reagente e não confirmam a preparação dos tecidos. Os controlos de tecidos positivos conhecidos devem ser utilizados apenas para monitorização do desempenho correcto dos tecidos processados e dos reagentes de teste, NÃO para auxiliar na formulação de um diagnóstico específico das amostras dos doentes. Caso os controlos de tecidos positivos não demonstrem uma coloração positiva apropriada, devem considerar-se inválidos os resultados obtidos com as amostras de teste. (111768-003) 305757PT_001 p. 7/15

Entre os tipos de células normais que podem ser utilizados como um controlo c-kit positivo fraco, encontram-se melanócitos epidérmicos basais e células mioepiteliais glandulares da pele, bem como células epiteliais e mioepiteliais da mama. As células mastócitas e neuronais (Células intersticiais de Cajal) presentes no intestino constituem controlos internos fortes. Tecido de controlo negativo Utilizar um controlo de tecido negativo (conhecido como sendo negativo para a proteína c-kit) fixado, processado e impregnado de forma semelhante à(s) amostra(s) dos doentes com cada processo de coloração para confirmar a especificidade do anticorpo primário e fornecer uma indicação da coloração de fundo específica. A variedade de diferentes tipos de células presentes na maior parte das secções de tecido oferece locais de controlo negativo interno (tal deve ser confirmado pelo utilizador). Caso ocorra coloração específica no tecido de controlo negativo, devem considerar-se inválidos os resultados obtidos com as amostras dos doentes. Os elementos de tecidos que podem ser utilizados como controlos negativos incluem os miócitos cardíacos. As células acinosas pancreáticas são também negativas para a c-kit, ao passo que o epitélio do canal biliar e pancreático apresenta uma coloração positiva. Reagente de Controlo Negativo Não-Específico Utilizar o Negative Control Reagent fornecido, em vez do anticorpo primário, com uma secção de cada uma das amostras dos doentes para avaliar a coloração não específica e permitir uma melhor interpretação da coloração específica do local do antigénio. O período de incubação do Negative Control Reagent deve corresponder ao do anticorpo primário. Quando forem utilizados painéis de anticorpos numa série de secções de tecido, as áreas de coloração negativa de uma lâmina poderão servir de controlos de ligação negativos/não específicos em relação a outros antissoros. Verificação do ensaio Antes da utilização inicial de um sistema de coloração num procedimento de diagnóstico, o utilizador deve verificar a especificidade do anticorpo, testando-o numa série de tecidos internos com características de desempenho IHC conhecidas, representando tecidos positivos e negativos conhecidos. Consultar os procedimentos de controlo de Qualidade previamente delineados nesta secção do folheto informativo do produto e os requisitos de controlo de Qualidade do Programa de Certificação do CAP e/ou a CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 17 Estes procedimentos de controlo de qualidade devem ser repetidos para cada novo lote de anticorpo, ou sempre que houver alterações nos parâmetros do ensaio. Os Tumores Estromais Gastrointestinais (GIST) com intensidades de coloração conhecidas para a proteína c-kit e os tecidos negativos são adequados para verificação do ensaio. Tabela 1: O objectivo do controlo de qualidade diário Tecido: Fixado e processado tal como uma amostra de doente Lâmina de controlo fornecida pela Dako. Controlo positivo: Tecidos ou células que contenham o antigénio alvo a ser detectado (podem situar-se em tecidos do doente). O controlo ideal é um tecido com coloração positiva fraca para ser mais sensível ao anticorpo ou à degradação do antigénio. Controlo negativo: Tecidos ou células que se esperam que sejam negativos (podem situar-se nos tecidos do doente ou nos tecidos de controlo positivo). Anticorpo específico e sistema de detecção Controla apenas o procedimento de coloração. (A avaliação das linhas celulares das lâminas de controlo fornecidas pela Dako indica a validade do processo de coloração). Controla todas as etapas da análise. Valida os reagentes e procedimentos utilizados para a coloração da proteína c-kit. Detecção de reactividade cruzada não intencional com anticorpos a células/componentes celulares. Fundo: Anticorpo não específico (Rabbit Negative Control Reagent) Detecção de coloração de fundo não específica. Detecção de coloração de fundo não específica. Tecido do doente. Detecção de coloração específica. Detecção de coloração de fundo não específica. (111768-003) 305757PT_001 p. 8/15

Interpretação do procedimento de coloração A avaliação da lâmina deve ser efectuada por um patologista, utilizando um microscópio óptico. Todas as avaliações devem ser realizadas na região tumoral da amostra. Para avaliação e interpretação da coloração imuno-histoquímica é apropriada uma amplificação com objectiva de 10x ou 20x. Utilizar células intactas para a interpretação dos resultados de coloração; as células necróticas ou degeneradas apresentam, normalmente, uma coloração não específica. 14,17 Em cada kit c-kit pharmdx estão incluídas linhas celulares de coloração positiva e negativa para validar o desempenho do ensaio. Uma coloração adequada das linhas celulares demonstra que o ensaio c-kit pharmdx está a funcionar correctamente e que o protocolo foi realizado de forma adequada. A ausência de coloração da linha celular de controlo HT-29 (0) e uma coloração citoplásmica ou perinuclear castanha clara na linha celular de controlo P815 (2+) indicam que o processo de coloração é válido. Os desvios da intensidade de coloração ideal da linha celular de controlo positivo (demasiado fraca ou demasiado forte) poderão dar resultados falso negativos ou falso positivos, o que indica que o teste deve ser repetido. Deverá realizar-se a avaliação do controlo de tecido positivo. A coloração fraca das células mioepiteliais da pele indica que os reagentes estão a funcionar adequadamente. Caso os controlos de tecidos positivos não demonstrem uma coloração positiva, devem considerar-se inválidos quaisquer resultados obtidos com as amostras de teste. Os controlos de tecidos negativos deverão ser examinados após os controlos de tecidos positivos para verificar a marcação específica do antigénio pelo anticorpo primário. A ausência de uma marcação específica nos controlos de tecidos negativos confirma a ausência da reactividade cruzada do anticorpo às células/componentes celulares. Caso ocorra coloração específica nos controlos de tecidos negativos, devem considerar-se inválidos os resultados obtidos com a amostra do doente. No caso de ocorrer coloração não específica, esta apresenta normalmente uma aparência difusa. Também se pode observar coloração esporádica do tecido conjuntivo em secções de tecido excessivamente fixado em formol. Utilizar células intactas para a interpretação dos resultados da coloração. As células necróticas ou degeneradas apresentam, normalmente, uma coloração não específica. 18 Examine as amostras do doente por último. A intensidade da coloração positiva deverá ser avaliada no contexto de indícios de coloração de fundo não específica com os controlos de reagente negativos. A interpretação da expressão da proteína c-kit/cd117 deve ser feita dentro do contexto morfológico e clínico geral do tumor. Existem três categorias morfológicas de GIST: de célula fusiforme (70%), epitelióide (20%) ou tipos mistos. 22 Independentemente da morfologia, a maioria dos GIST's expressam a proteína c-kit numa proporção significativa das células tumorais. A imuno-coloração homogénea com c-kit pharmdx é inicialmente observada no citoplasma, com ou sem um padrão Golgi/perinuclear (tipo ponto), e nas membranas celulares, com coloração circunferencial completa ou incompleta. Alguns casos demonstram um padrão de coloração heterogéneo (uma mistura de citoplásmico e/ou membranoso forte ou fraco. Foi igualmente observada uma coloração nos espaços extracelulares. Os resultados do teste c-kit pharmdx devem ser apresentados como positivos ou negativos, utilizando a coloração citoplásmica e da membrana como estrutura de avaliação (Tabela 2). A positividade para a expressão da proteína c-kit é definida como qualquer coloração da membrana e/ou citoplásmica específica, nas células tumorais. A positividade focal ou coloração em menos de 10% das células tumurais deve ser interpretada com cuidado. 23 Tal como acontece com qualquer teste imuno-histoquímico, um resultado negativo significa que o antigénio não foi detectado, o que não significa que o antigénio estava ausente nas células/tecidos estudados. De referir, também, que uma pequena percentagem de GIST's não expressam a proteína c-kit. Pelo que, a ausência de coloração da proteína c-kit não exclui necessariamente o diagnóstico de GIST (tumor estromal gastrointestinal). Tabela 2: Resultados da Coloração c-kit pharmdx Comunicar o resultado ao Definição médico responsável pelo tratamento Negativo para a proteína c-kit Ausência de coloração nas células tumurais. A coloração positiva é definida como qualquer coloração IHC do citoplasma das células tumurais e/ou das membranas acima do nível de fundo. Positivo para a proteína c-kit Intensidade da coloração: 1+, 2+ ou 3+ Caso seja necessário, utilizar um painel de anticorpos para ajudar a identificar as reacções falsas-negativas. Quando a coloração é positivamente focal, devem ser considerados testes adicionais para confirmar o diagnóstico de GIST. Os testes genéticos, bem como os padrões de coloração especificados na Tabela 3, ajudam na diferenciação de GIST e outros sarcomas mensenquimais. Consulte a secção "Sumário e Explicações" e "Limitações e Características de Desempenho" para obter informação específica sobre a imunoreactividade. (111768-003) 305757PT_001 p. 9/15

c-kit CD34 Tabela 3. Diagrama imuno-histoquímico para o diagnóstico diferencial dos tumores da célula fusiforme do SMA Actina do músculo liso S-100 Desmina tracto gastrointestinal. 5 Tumor estromal 95% 60-70% 30-40% 5% 2% gastrointestinal (GIST) Tumor do músculo liso - 10-15% + Raro + Schwannoma - Usualmente - + - Fibromatose Disputado* Raro + - Raro * A maioria dos autores, mas não todos, indicam que a fibromatose é negativa para c-kit. Consoante a duração da incubação e a potência da hematoxilina utilizada, a contrastação irá resultar numa coloração azul pálido a escuro dos núcleos das células. Uma contrastação excessiva poderá comprometer a interpretação dos resultados. Limitações Limitações gerais A IHC é um processo de diagnóstico com várias etapas que requer uma formação especializada na selecção dos reagentes apropriados; selecções de tecidos, fixação e processamento; preparação da lâmina de IHC e interpretação dos resultados da coloração. A coloração de tecidos depende do manuseamento e processamento dos tecidos antes da coloração. A fixação, congelação, descongelação, lavagem, secagem, aquecimento e seccionamento incorrectos ou a contaminação com outros tecidos ou fluidos poderá produzir artefactos, aprisionamento de anticorpos ou resultados falsos negativos. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou a sua ausência deve ser avaliada no contexto da apresentação clínica, morfologia e outros critérios histopatológicos. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou a sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos e controlos adequados, bem como outros testes de diagnóstico. A interpretação da preparação corada é responsabilidade de um patologista qualificado que esteja familiarizado com anticorpos, reagentes e métodos utilizados. A coloração deve ser efectuada por um laboratório licenciado certificado sob a supervisão de um patologista responsável pelo exame das lâminas coradas e garantia da adequação dos controlos positivos e negativos. Este produto não se destina à citometria de fluxo. As características de desempenho não foram determinadas para citometria de fluxo. Os tecidos de pessoas infectadas pelo vírus da hepatite B que contenham o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) podem exibir coloração não específica com a peroxidase de rábano. 24 Os reagentes podem demonstrar reacções inesperadas em tecidos não testados previamente. A possibilidade de reacções inesperadas, mesmo em grupos de tecidos testados, não pode ser completamente eliminada devido à variabilidade biológica da expressão de antigénios em neoplasmas ou noutros tecidos patológicos. 20 Contactar a assistência técnica da Dako para comunicar as reacções inesperadas documentadas. Limitações específicas do produto Uma pequena percentagem de GIST's não expressa a proteína c-kit. Pelo que, a ausência de coloração c-kit não exclui o diagnóstico de GIST (tumor estromal gastrointestinal). Podem observar-se resultados falsospositivos devido à ligação não imunológica de proteínas ou a produtos de reacção do substrato. Poderão ser também causados pela actividade da pseudoperoxidase (eritrócitos) e actividade da peroxidase endógena (citocromo C). 19 Para resultados óptimos e reprodutíveis, a proteína c-kit requer a recuperação do alvo quando os tecidos forem fixados (tampão de formol neutro) por rotina e impregnados em parafina. A Dako recomenda a utilização de c-kit pharmdx num Dako Autostainer ou Autostainer Plus. A utilização de c- Kit pharmdx em plataformas automatizadas alternativas não foi validada e pode originar resultados erróneos. As linhas celulares de controlo coradas apenas devem ser utilizadas para validação do processo de coloração e não para classificar a reacção da coloração nas secções de tecido. As amostras preservadas, por processamento de rotina, em tampão de formol neutro são adequadas para a realização de testes com o c-kit pharmdx. Não foram validados tecidos fixados em agentes de fixação alternativos. (111768-003) 305757PT_001 p. 10/15

Características de Desempenho Especificidade A reactividade do reagente de anticorpo c-kit foi testada contra linhas celulares que expressam a proteína c-kit. Na análise "Western blotting" de um lisado da linha celular SY do carcinoma pulmonar de célula pequena, que expressa c-kit mrna em excesso, o reagente de anticorpo marcou a banda de 145 kd correspondente à proteína c-kit. A banda marcada é bastante larga, entre 120 e 155 kd. Foi também marcada uma banda adicional de 100 kd. 25 Além disso, quando se empregou um segundo anticorpo anti-c-kit, foi igualmente marcada uma banda de proteínas de 100 kd. Esta marcação foi abolida quando o reagente de anticorpo foi incubado com o antigénio péptido c-kit sintético utilizado para imunização. 26 Em estudos adicionais, o reagente de anticorpo c-kit foi testado utilizando a análise Western blotting para reactividade cruzada às proteínas que partilham a homologia estrutural, tais como o receptor do factor de crescimento derivado de plaqueta (PDGFRa), o receptor de factor de estimulação de colónias macrófagas (c-fms) e tirosina cinase 3 to tipo FMS (FLT-3). Não foi observada reactividade cruzada com estas proteínas homólogas. Além disso, em análise Western blotting, o reagente de anticorpo da Dako não reagiu com um lisado da linha celular HS do adenocarcinoma, que não expressa o gene c-kit. 25 Estudos de comparação Realizou-se imuno-coloração utilizando o ensaio c-kit pharmdx em sarcomas fixados em formol e impregnados em parafina e em várias matrizes de tecidos (MTAs), contendo uma selecção de sarcomas que incluem a expressão da proteína c-kit positiva e negativa. Foram testados os mesmos tecidos utilizando o ensaio c-kit pharmdx, após terem sido usados os dois métodos recomendados de recuperação do epítopo induzida por calor (HIER). Utilizaram-se como fontes de calor o banho de água (95 99 C) durante 20 mi nutos e a panela de pressão (121 C) durante 5 minutos de aquecimento, ambas seguidas por 20 minutos de arrefecimento. As restantes etapas do procedimento de coloração foram idênticas. Estes ensaios foram comparados em simultâneo com a simulação de um ensaio do Protocolo do Ensaio Clínico da Novartis (NCTP) que foi usado previamente para seleccionar doentes para o ensaio clínico que obteve a aprovação da FDA para a utilização de Gleevec/Glivec com os doentes a que lhes foi diagnosticado GIST. O NCTP utilizou uma concentração 2X mais elevada de anticorpo Dako primary polyclonal contra o c-kit (A4502) (o mesmo reagente utilizado no c-kit pharmdx) e ausência de HIER. Os resultados da comparação em simultâneo entre o NCTP e o ensaio c-kit pharmdx utilizando uma panela de pressão como fonte de calor, são descritos na Tabela 4. Observaram-se resultados idênticos (semelhança geral = 98,7%) quando se utilizou um banho de água como fonte de calor. A percentagem de semelhanças positivas e negativas foram semelhantes nas duas comparações. Tabela 4. Tabela 2x2 do protocolo c-kit pharmdx, que compara os resultados dos testes da panela de pressão com os resultados do teste "NCTP" c-kit pharmdx - Resultado do teste TR da panela de pressão Comparação NCTP Resultados dos testes dos ensaios Positiva Negativo Total n (%) n (%) Positiva 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negativo 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Total 189 120 309 Percentagem de semelhança positiva = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (95% do CI exacto: 97,1% - 100%) Percentagem de semelhança negativa = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (95% do CI exacto: 92,9% - 99,5%) Semelhança geral = (188+117)/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (95% do CI exacto: 96,7% - 99,7%) Um sub-conjunto de três amostras (35 casos) apresentou tecidos obtidos de doentes que participaram no ensaio clínico Novartis Gleevec. Destes doentes, 21 foram tratados com Gleevec (58,3%). Quando as mesmas amostras foram retestadas com o NCTP simulado e o c-kit pharmdx, 20 foram classificadas como positivas com os três procedimentos, enquanto 1 amostra foi classificada como negativa. Entre os 147 doentes tratados com Gleevec no ensaio clínico Novartis Gleevec foi referido que 54% responderam parcialmente ao tratamento e que em 28% a doença estabilizou. 7 Para um subconjunto de 259 amostras apresentadas na Tabela 4, o resultado do teste c-kit foi determinado na altura em que as amostras foram colocadas nos MTA's. Trinta e cinco dos casos foram inscritos nos ensaios clínicos Gleevec (n=35), e os restantes foram testados nos mesmos laboratórios que tinham participado nos ensaios Gleevec. Os resultados das 179 amostras (o total foi inferior a 259 devido à perda de amostra da falta de tumor nas MTA's) estão apresentados na Tabela 5, abaixo. Estas amostras demonstraram uma semelhança geral ao estado do c-kit original de 94,9% (95% do CI exacto: 90,7% - 97,7%). (111768-003) 305757PT_001 p. 11/15

Tabela 5: Tabela 2x2 dos resultados do teste da panela de pressão comparados com o resultado do teste original Estado c-kit do tecido original Resultado do teste da panela de pressão Positivo n Negativo n Total n (%) Positivo 136 3 139 (78%) Negativo 6 34 40 (22%) Total 142 37 179 Percentagem de semelhança negativa = 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (95% do CI exacto: 91,0% - 98,4%) Percentagem de semelhança negativa = 34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (95% do CI exacto: 78,1% - 98,3%) Semelhança geral = (136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (95% do CI exacto: 90,7% - 97,7%) Reprodutibilidade Reprodutibilidade inter-ensaio (Coloração manual) A reprodutibilidade inter ensaios foi testada por três laboratórios e por dois técnicos em cada um dos laboratórios, durante 3 dias, com 5 amostras diferentes (4 amostras positivas e 1 negativa em cada laboratório). Nos 30 tecidos testados, a intensidade de coloração variou até +/- um grau de intensidade de coloração com as seguintes excepções: Nos locais 1 e 3, uma lâmina (cada) variou em dois graus de intensidade. Isto foi um resultado da rotura do tecido nos locais 1. A excelente reprodutibilidade geral (100%) foi vista em resultados positivos versus resultados negativos. Reprodutilibilidade entre laboratórios (coloração manual e automática utilizando o Dako Autostainer) Realizou-se a coloração imuno-histoquímica com 30 amostras, seleccionadas aleatoriamente e ocultadas, de vários níveis de expressão de c-kit (10 negativas e 20 positivas) em três laboratórios geograficamente separados. As lâminas foram enviadas para cada um dos laboratórios de teste, para coloração manual e automatizada e foram posteriormente avaliadas por um patologista. Em dois dos locais, a determinação positiva/negativa da expressão da proteína c-kit foi perfeita (100%) nos laboratórios e entre laboratórios em procedimentos de teste manuais e automatizados. No local 2, as lâminas duplicadas de dois tecidos, designadas antes do estudo como sendo negativas, foram, na verdade, positivas. As análises de seguimento revelaram que uma pequena área (aproximadamente 20% das células tumorais) apresentaram uma coloração positiva. Esta secção de tumor não foi observada nas amostras testadas nos outros laboratórios. Reprodutibilidade intra-ensaio (Coloração manual) Em cada um dos locais do estudo foram incluídas 5 lâminas de uma mesma amostra positiva no conjunto de 30 amostras coradas manualmente. Foi avaliada a intensidade da coloração e a percentagem da coloração do tumor. O resultado do tecido permaneceu positivo em cada local do estudo, e a intensidade de coloração manteve-se dentro de uma variação de +/- 1 grau de intensidade. Imunoreactividade Na Tabela 6 é apresentado um resumo da imunoreactividade do c-kit pharmdx no painel de tecidos normais recomendado. Todos os tecidos foram fixados em formol e impregnados em parafina. As instruções fornecidas e os reagentes recomendados neste folheto informativo foram utilizados para realizar 30 testes em tecidos normais no DAKO Autostainer Tabela 6: Avaliação da coloração de tecidos normais com c-kit pharmdx * Tipo de tecido (nº testados) Supra-renal (3) Medula óssea (3) Mama (3) Encéfalo/cerebelo (3) Encéfalo/cérebro (3) Colo uterino (3) Cólon (3) Esófago (3) Coração (3) Rim (3) Fígado (3) Pulmão (3) Células mesoteliais (3) Ovários (3) Padrão de Coloração Mastócitos raros (2+): citoplásmicos Células epiteliais (3+): Membranares e citoplásmicas Células mioepiteliais (1+): citoplásmicos Processos das células Purkinje (1+): citoplásmicos Mastócitos submucosais (2+): e lâmina própria (2+) citoplásmica Mastócitos submucosais (2+): citoplásmicos Epitélio tubular (2+): citoplásmicos Mastócitos e macrófagos (2+): citoplásmicos (111768-003) 305757PT_001 p. 12/15

Pâncreas (3) Paratiróide (3) Nervos periféricos (3) Hipófise (3) Próstata (3) Glândula salivar (3) Músculo-esquelético (3) Pele (3) Intestino delgado (3) Baço (3) Estômago (3) Testículos (3) Timo (3) Tiróide (3) Amígdalas (3) Células epiteliais raras dos ductos grandes (3+): Mastócitos (2+): citoplásmicos Mastócitos em tecido mole (2+): citoplásmicos Mastócitos (2+): citoplásmicos Melanócitos epidérmicos basais (1+): citoplásmicos Células mioepiteliais glandulares (1+): citoplásmicos Células neuronais (1+): citoplásmicos Mastócitos (2+): citoplásmicos Mastócitos (2+): citoplásmicos Mastócitos em lâmina própria (2+): citoplásmicos Útero (3) *A maioria dos tecidos testados apresentou uma coloração positiva dos fibroblastos no tecido do estroma (1+, fibroso), bem como mastócitos e macrófagos. Foi observada ocasionalmente a coloração de eosinófilos induzida pela peroxidase endógena. Os estudos internos com c-kit pharmdx demonstraram a expressão da proteína c-kit numa variedade de células normais. Estas células incluem células mioepiteliais e dos ductos da mama, processos das células Purkinje, células em lâmina própria do cólon, epitélio tubular do rim, melanócitos e células mioepiteliais da pele, Células intersticiais de Cajal do intestino delgado e mastócitos. A reactividade citoplásmica nos granulócitos foi provocada pela actividade da peroxidase endógena e foi visível com o Reagente de Controlo Negativo. Resolução de problemas Tabela 7: Resolução de problemas Problema Causa provável Acção sugerida 1. lâmina está a ser corada. 1a. Os reagentes não estão a ser utilizados na ordem correcta. 1b. Azida de sódio em banho de tampão de lavagem. 1a. Rever a aplicação dos reagentes. 1b. Utilizar tampão de lavagem, sem azida, preparado recentemente. 2. Coloração fraca das lâminas. 3. Coloração de fundo excessiva das lâminas. 2a. Tempos de incubação de reagentes inadequados. 2b. Foi utilizado um método de fixação inapropriado. 2c. Recuperação inadequada do alvo com Target Retrieval Solution. 3a. A parafina não foi completamente removida. 3b. Foram utilizados aditivos com amido na montagem das secções nas lâminas. 3c. As lâminas não foram totalmente lavadas. 3d. As secções secaram durante o procedimento de coloração. 3e. Ligação não específica dos reagentes à secção de tecido. 2a. Rever as instruções do procedimento de coloração. 2b. Certificar-se de que o tecido do doente não foi fixado em excesso ou que está a ser utilizado um agente de fixação aprovado. 2c. Verificar se o banho de água a panela de pressão está a funcionar correctamente e se o procedimento de recuperação de alvo foi seguido de forma adequada. (Temperaturas baixas e/ou um tempo inadequado irão resultar numa coloração fraca.) 3a. Utilizar soluções de limpeza recém-preparadas e cumprir o procedimento descrito na secção Desparafinização e rehidratação. 3b. Evitar utilizar quaisquer aditivos para aderência das secções às lâminas de vidro. Muitos destes aditivos são imunoreactivos. 3c. Utilizar soluções recém-preparadas nos banhos de tampão e nos frascos de lavagem. 3d. Utilizar uma câmara húmida para incubações de 30 minutos. 3e. Verificar se a amostra foi correctamente fixada e/ou se existe necrose. (111768-003) 305757PT_001 p. 13/15

4. Os tecidos separam-se das lâminas. 5. Coloração específica excessivamente forte. 6. Coloração fraca da linha celular 2+ da lâmina de controlo. 4a. Utilização de lâminas incorrectas. 5a. Foi utilizado um método de fixação inapropriado. 5b. Os tempos de incubação dos reagentes foram demasiado longos. 5c. Foi utilizado um tampão de lavagem inadequado. 5d. Utilização inadequada da câmara húmida. 6a. Recuperação de alvo inadequada. 6b. Tempos de incubação de reagentes inadequados. 4a. Utilizar lâminas carregadas (Fisher s SuperFrost Plus), ou silanizadas, como as Dako s Silanized Slides (referência S3003). 5a. Certificar-se de que são utilizados apenas métodos e agentes de fixação aprovados. 5b. Rever as instruções do Procedimento de coloração. 5c. Utilizar apenas o tampão de lavagem que é recomendado para uso com o kit. 5d. Utilizar uma câmara húmida para incubações de 30 minutos. 6a. Verificar se o procedimento de recuperação de alvo foi efectuado correctamente. 6b. Rever as instruções do Procedimento de coloração. 6c. Degradação da lâmina de controlo. 6c. Verificar o prazo de validade e as condições de conservação do kit impressos na etiqueta da embalagem. Nota: Consultar também a secção Resolução de problemas no Manual da Dako: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, o Atlas of Immunohistology 21 ou Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 18 Contactar a Assistência Técnica da Dako para comunicar casos de coloração invulgares. Referências 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: 708-710, 2003 2. Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S., Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: 4297-300, 1999 3. Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): 889-894 2004 4. Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; 1882 5. Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26:486 6. Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117:188. 7. Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7:472. 8. Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33:5 459 9. Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33:466. 10. Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33:669. 11. Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54:96. 12. Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5:1259. 13. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 14. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001. 17. CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for (111768-003) 305757PT_001 p. 14/15

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