CINtec PLUS Kit. Instruções de utilização

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1 Instruções de utilização CINtec PLUS Kit O CINtec PLUS Kit é um ensaio imunocitoquímico para a detecção qualitativa simultânea das proteínas p16 INK4a e Ki-67 em preparações citológicas do colo do útero. Destina-se a ser utilizado como auxiliar na identificação de mulheres com lesões intra-epiteliais do colo do útero de elevado grau numa população de rastreio e nos sub-grupos de doentes que obtiveram um resultado da citologia do Papanicolau de ASCUS (células escamosas atípicas de significado indeterminado) ou LSIL (lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau) ou em doentes com resultados positivos no teste de HPV de alto risco. Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D Mannheim Germany entre 2 e 8 C

2 Índice I. Nome do produto... 2 II. Aplicação... 2 III. Resumo e explicação do dispositivo... 2 Contexto... 2 Significado clínico... 3 Princípios do procedimento... 5 IV. Reagentes... 6 Materiais fornecidos... 6 Armazenamento... 8 Materiais e reagentes necessários mas não fornecidos... 8 Equipamento necessário... 9 V. Advertências e precauções... 9 Aviso... 9 Atenção VI. Procedimentos Preparações de amostras citológicas Tratamento de recuperação do epítopo induzida por calor de amostras antes da coloração Procedimentos de coloração de lâminas Preparação de reagentes Solução de recuperação do epítopo Tampão de lavagem Soluções de substrato-cromogénio (DAB e Fast Red) Contrastante Meio de montagem Procedimento de coloração Rehidratação de amostras Recuperação do epítopo Protocolos de coloração Protocolo de coloração para Instrumentos Autostainer (Dako, LabVision) Protocolo de coloração para o Sistema Shandon Coverplate Aplicar o contrastante com hematoxilina Montagem VII. Controlo de qualidade Controlo positivo Controlo negativo Verificação do ensaio VIII. Interpretação dos resultados IX. Limitações X. Características de desempenho XI. Resolução de problemas XII. Símbolos XIII. Fabricante XIV. Estado da revisão XV. Aviso legal Anexo 1: Referências Anexo 2: Tabelas REF / PT Rev 2.2

3 I. Nome do produto CINtec PLUS Kit II. Aplicação Para utilizar no diagnóstico in vitro. O CINtec PLUS Kit é um ensaio imunocitoquímico para a detecção qualitativa simultânea das proteínas p16 INK4a e Ki-67 em preparações citológicas do colo do útero. Destina-se a ser utilizado como auxiliar na identificação de mulheres com lesões intra-epiteliais do colo do útero de elevado grau numa população de rastreio e nos sub-grupos de doentes que obtiveram um resultado da citologia do Papanicolau de ASCUS (células escamosas atípicas de significado indeterminado) ou LSIL (lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau) ou em doentes com resultados positivos no teste de HPV de alto risco. O kit destina-se a ser utilizado em laboratórios de citologia médica. A interpretação dos resultados dos testes deve ser apenas realizada por um profissional certificado juntamente com o historial clínico do doente e testes de diagnóstico adicionais que tenham sido realizados. III. Resumo e explicação do dispositivo Contexto Nas células eucariotas, o controlo da progressão do ciclo de divisão celular é efectuado por um padrão complexo de expressões controladas e modificações pós-translacionais (por ex., fosforilação) das proteínas que regulam o ciclo celular. A proteína p16 INK4a desempenha um papel principal no mecanismo de regulação do ciclo das células eucariotas. Faz parte do controlo mediado pela proteína retinoblastoma (prb) da transição da fase G1-S-phase transition e desencadeia a interrupção do ciclo celular durante os processos de diferenciação celulares. Por conseguinte, a p16 INK4a proporciona um efeito antiproliferativo quando expresso durante a progressão do ciclo celular. Nas células epiteliais diferenciadas no final, a expressão da proteína p16 INK4a é diminuída para níveis normalmente não detectáveis pela [revisto em 31;35] Ki-67 é uma proteína associada à proliferação que podo núcleo de células proliferantes. Análises detalhadas do ciclo celular revelaram que o antigénio Ki-67 está presente a níveis detectáveis em todas as fases, bem como na mitose, enquanto as células quiescentes ou de repouso na fase G 0 não expressam o antigénio [revisto em 3;26]. Uma vez que as células que desencadeiam a sobre-expressão do p16 INK4a só podem proliferar activamente depois do seu mecanismo de controlo do ciclo celular ter sido reduzido, a expressão do marcador de proliferação Ki-67 e do p16 INK4a na mesma célula devem excluir-se mutuamente sob condições fisiológicas normais. Por conseguinte, a expressão concomitante de Ki-67 e p16 INK4a em determinadas células pode ser utilizada como um indicador da desregulação do controlo do ciclo celular nas respectivas células. REF / PT Rev 2.2

4 Na neoplasia do colo do útero, o p16 INK4a mostrou ser alvo de uma sobreexpressão acentuada resultante da inactivação funcional da prb mediada pela oncoproteína E7 de tipos de papilomavírus humano de elevado risco (HR-HPV) [13;22]. Uma vez que a oncoproteína E7 é necessária para estabelecer e manter um fenótipo maligno em lesões pré-cancerígenas e cancerígenas associadas ao HPV, a sobre-expressão do p16 INK4a está directamente ligada à actividade oncogénica dos vários tipos de HR-HPV e, consequentemente, foi proposta como sendo um marcador secundário para transformar infecções por HPV [revisto em 6;31;35]. Inúmeros estudos analisaram e demonstraram a utilidade clínica da imunocoloração do p16 INK4a na histologia [2;6;7;11-14;17;18;20-22;32] e citologia [4-6; 8-10;13;15;17;19;20;25;29;30;33;34;37] do colo do útero. A interpretação conjunta da coloração das lâminas para o p16 INK4a utilizando o Kit de Histologia CINtec (Roche mtm laboratories AG) mostrou, em vários estudos, aumentar significativamente a fiabilidade inter-observador, bem como a precisão de diagnóstico para a detecção de lesões CIN2 e de grau superior [2;11;14]. Além disso, as lesões CIN1 positivas quanto ao p16 INK4a podem ter uma probabilidade mais elevada de progressão para lesões de grau elevado, quando comparadas com as lesões CIN1 que apresentaram resultados negativos para o p16 INK4a [7;18]. Na citologia do colo do útero, a imuno-coloração para o p16 INK4a mostrou ser uma ferramenta útil para a triagem eficaz de casos de citologia do Papanicolau categorizados como Células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US) ou Lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), com níveis de sensibilidade para a detecção de lesões CIN2 e superiores subjacentes similares aos níveis do teste de HPV, oferecendo uma especificidade significativamente superior [5;9;10;15;19;25;29;30;33;34;37]. Além disso, a citologia de p16 INK4a foi proposta como sendo um marcador secundário útil para a triagem de mulheres com resultados positivos para o HR-HPV no rastreio do cancro do colo do útero [4]. Praticamente todas as lesões intra-epiteliais do colo do útero de grau elevado (ou seja, lesões CIN2 ou 3 e superiores) mostraram uma sobre-expressão do p16 INK4a [2;6;11;13;17;20;32]. Uma vez que uma proporção elevada de células epiteliais nas lesões CIN apresentam também actividade proliferativa, a detecção de células epiteliais do colo do útero que expressem simultaneamente p16 INK4a e Ki-67 pode ser utilizada com um indicador do estado da célula transformada. Assim, uma abordagem com base na avaliação de amostras citológicas do colo do útero no que diz respeito à presença de células epiteliais individuais do colo do útero com um resultado de coloração dupla positivo para p16 INK4a e Ki-67 pode oferecer níveis elevados de sensibilidade e especificação quanto à presença de doença pré-cancerígena e cancerígena. Significado clínico A interpretação de preparações de lâminas de citologia do colo do útero com imuno-coloração para a detecção simultânea da expressão da proteína reguladora do ciclo p16 INK4a e do marcador de proliferação Ki-67 mostrou ser útil na identificação de mulheres com neoplasia intra-epitelial do colo do útero de elevado grau (HGCIN) com sensibilidade e especificidade elevadas quando utilizada numa população de rastreio como auxiliar do teste de citologia de Papanicolau de rotina, no subgrupo de doentes cujos resultados da citologia Pap indicaram ASC- US ou LSIL ou REF / PT Rev 2.2

5 no subgrupo de doentes com resultados da citologia Pap negativos, mas com resultados positivos ao teste de HPV. É um grande desafio de saúde pública identificar eficazmente mulheres numa população de rastreio de rotina do cancro do colo do útero com HGCIN. Devido à baixa prevalência de lesões pré-cancerígenas de alto grau (normalmente menos de 1% das mulheres numa população de rastreio assintomática), a disponibilidade dos testes e procedimentos que identificam mulheres com HGCIN estabelecido com elevada sensibilidade e especificidade é de grande importância [24]. Ao longo das últimas décadas, a citologia de Pap para a detecção de anomalias morfológicas mostrou conseguir reduzir eficazmente a morbilidade e mortalidade associadas ao cancro do colo do útero nos país que implementaram protocolos de rastreio do cancro do útero. No entanto, apesar do seu sucesso a nível global, existe uma sensibilidade insatisfatoriamente baixa para uma única citologia Pap (normalmente na gama dos 50-70% [16], que requer intervalos de rastreio curtos para compensar a sensibilidade relativamente baixa de um único resultado de citologia. Ao mesmo tempo, a especificidade da citologia de Pap mostrou ser relativamente alta, embora possa variar substancialmente com base nas mesmas características da população de rastreio individual, incluindo idade, prevalência de HPV, diferenças nas metodologias do Papanicolau (esfregaços convencionais vs. citologia com base em fluidos), tecnologias utilizadas (ou seja, interpretação manual vs. citologia/imagiologia assistida por computador) e dependendo da experiência individual dos vários profissionais que efectuam a análise. O teste de HPV foi proposto como sendo uma potencial abordagem para melhorar o rastreio actual do cancro do colo do útero baseado na citologia de Pap e das suas lesões precursoras [24]. Embora tenha sido demonstrado que o teste de HPV oferece uma sensibilidade elevada para a identificação de mulheres com HGCIN, a prevalência elevada de infecções principalmente transitórias com tipos de HPV de alto risco resulta em nível gerais de baixa especificidade. Uma vez que a prevalência do HPV varia com a idade, o teste de HPV só foi proposto para um potencial co-teste juntamente com a citologia de Pap em mulheres com idade igual ou superior a 30 anos. [1] Para além de definir a abordagem ideal para implementar eficazmente tecnologias de rastreio primárias e algoritmos, existem áreas de interesse adicionais no rastreio do cancro do colo do útero onde existem tecnologias que podem ser melhoradas para optimizar a precisão da identificação de HGCIN ou onde não existem quaisquer ferramentas actualmente disponíveis. A triagem de resultados de citologia de Pap equívocos (ASC-US, células escamosas atípicas de significado indeterminado) ou ligeiramente anormais (LSIL, lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau) pertence a esta categoria, bem como o tratamento de mulheres com idade igual ou superior a 30 anos com resultados de rastreio de abordagens de coteste Pap/HPV categorizados como Negativos para Lesões intra-epiteliais e malignidade (NILM) no Pap, mas com resultados positivos para HPV de alto risco. No que diz respeito à triagem de anomalias citológicas ASC-US, uma estratégia de triagem que incluiu a detecção de HPV e a população com ASC-US demonstrou ser sensível para a detecção de HGCIN subjacente. No entanto, a especificidade é claramente menos ideal e mostrou ser dependente da idade [27;36]. Além disso, uma vez que a grande maioria dos casos LSIL demonstraram ser positivos para tipos de HPV de alto risco [23], a triagem de resultados de citologia de PAP com resultados LSIL positivos com o HPV seria bastante ineficaz. REF / PT Rev 2.2

6 Uma vez que os serviços de colposcopia são limitados e o custo desses serviços e do tratamento subsequente de lesões de baixo grau são consideravelmente altos, existe um interesse contínuo na disponibilidade de um teste de triagem para mulheres com ASC-US e LSIL com características de desempenho melhoradas, especialmente no que diz respeito ao nível de especificidade fornecido. A introdução de um teste de biomarcadores com elevada sensibilidade e especificidade capaz de identificar doentes com doença do colo do útero de grau elevado seria vantajoso no tratamento de mulheres com anomias citológicas equívocas e de baixo grau. Um teste desta natureza teria o potencial de 1) melhor estratificar os doentes com resultados de citologia de Pap de ASC.US e 2) poderia abrir a oportunidade de efectuar uma triagem eficaz dos resultados de citologia de Pap de LSIL. À semelhança da situação da triagem de resultados de citologia de Pap LSIL, não existem actualmente quaisquer ferramentas disponíveis para efectuar uma triagem adicional de resultados de rastreio negativos na citologia de Pap, mas positivos para HPV de alto risco. Com cerca de 5-7% dos resultados de co-teste Pap/HPV, isto representa um grupo crescente de casos que exigiriam uma colposcopia de seguimento completa para aproveitar o maior potencial da taxa de detecção do teste de HPV em relação ao teste de citologia de Pap. No entanto, uma vez que ainda se prevê que a taxa de doença subjacente de alto grau neste grupo de resultados de teste de rastreio seja relativamente baixa, a disponibilidade de uma ferramenta de triagem eficaz seria muito importante para tratar eficazmente mulheres com resultados positivos no teste de HPV que não são correspondidos por resultados de citologia de Pap anormais. Princípios do procedimento O Kit CINtec PLUS contém um conjunto de reagentes para a detecção imunocitoquímica dos antigénios p16 INK4a e Ki-67. O kit foi concebido para realizar um procedimentos de coloração imunocitoquímica de duas fases em amostras citológicas obtidas a partir do colo do útero. Para a detecção dos antigénios, é utilizado um anticorpo monoclonal de ratinho primário, clone E6H4, direccionado contra a proteína humana p16 INK4a e um anticorpo monoclonal de coelho primário, clone AC3, direccionado contra a proteína humana Ki-67. São utilizados reagentes de visualização prontos a utilizar que contêm (i) um reagente de polímeros conjugado com peroxidase de rábano e fragmentos Fab de anticorpos anti-ratinho de caprino e (ii) um reagente de polímeros conjugado com fosfatase alcalina e fragmentos de Fab de anticorpos anti-coelho de caprino. Os reagentes de visualização foram sujeitos a uma absorção na fase sólida para eliminar a reactividade cruzada com imunoglobulinas humanas. As reacções de cromogénio baseiam-se na conversão de um cromogénio DAB mediada pela peroxidase de rábano e na conversão de cromogénio Fast Red mediada pela fosfatase alcalina em produtos de reacção visível nos respectivos locais do antigénio. Após a adição de um contraste, deverá ser aplicado um protocolo de montagem de duas fases: numa primeira fase, deve ser utilizada uma solução aquosa de montagem das amostras utilizando um meio aquoso de montagem fornecido com o kit. Subsequentemente, as lâminas podem ser cobertas por uma lamela utilizando, por exemplo, um meio de montagem permanente. Os resultados podem ser avaliados através de uma análise microscópica óptica. REF / PT Rev 2.2

7 IV. Reagentes Materiais fornecidos Os materiais listados abaixo são fornecidos em cada kit e são suficientes para realizar 50 testes. O número de testes baseia-se na utilização de 200 µl dos reagentes por lâmina. 1 Reagente de bloqueio da peroxidase Reagente de bloqueio da peroxidase 11,5 ml, pronto a utilizar 3% de peróxido de hidrogénio, contendo15 mmol/l de azida de sódio (NaN 3 ). Ficha de Dados de Segurança do Material disponível sob pedido. 2 Solução de anticorpos primários Solução de anticorpos primários 11,5 ml, pronto a utilizar Monoclonal mouse anti-human p16 INK4a antibody, Clone E6H4, e monoclonal rabbit anti-human Ki-67 antibody Clone AC3, fornecidos num tampão Tris de 50 mm, ph 7,2, contendo 15 mmol/l de azida de sódio (NaN 3 ) e estabilizador de proteína. 3 Reagente de visualização de HRP Reagente de visualização de HRP 11,5 ml, pronto a utilizar Conjugado de reagente de polímero com peroxidase de rábano e fragmentos de anticorpo Fab anti-ratinho de caprino purificado por afinidade, fornecido em solução estabilizante com conservantes e proteína estabilizadora. Contém 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano que pode produzir uma reacção alérgica. Ficha de Dados de Segurança do Material disponível sob pedido. 4 Reagente de visualização de AP Reagente de visualização de AP 11,5 ml, pronto a utilizar Reagente de polímeros conjugado com fosfatase alcalina e fragmentos Fab de anticorpos anti-coelho de caprino purificados por afinidade, fornecidos numa solução estabilizadora contendo conservantes e estabilizador de proteínas. Contém 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano que pode produzir uma reacção alérgica. Ficha de Dados de Segurança do Material disponível sob pedido. REF / PT Rev 2.2

8 5 Substrato tamponado DAB Substrato tamponado DAB 16,0 ml, Solução tampão de substrato, ph 7,5, contendo <0,1% de peróxido de hidrogénio, estabilizadores, intensificadores e um agente antimicrobiano. 6 Cromogénio DAB Cromogénio DAB 0,85 ml, solução de cromogénio 3,3 -diaminobenzidina. A DAB é nociva. Consulte as seguintes Frases de risco e segurança: R40 Possibilidade de efeitos cancerígenos. R43 Pode causar sensibilização através do contacto com a pele. R68 Possível risco de efeitos irreversíveis. S35 Este material e o respectivo recipiente devem ser eliminados de forma segura. S36/37 Utilizar vestuário de protecção e luvas. NOTA: Embora a diaminobenzidina esteja estruturalmente relacionada com a benzidina, não existem quaisquer evidências de carcinogenicidade quanto à diaminobenzidina. Consulte os regulamentos federais, estatais ou locais para informações sobre a eliminação. Ficha de Dados de Segurança do Material disponível sob pedido. 7 Substrato de fosfato de naftol Substrato de fosfato de naftol 25,0 ml, Solução tampão de substrato, ph 9,2, contendo Substrato de fosfato AS-TR de naftol, estabilizadores, intensificadores e um agente antimicrobiano. 8 Fast Red Chromogen Fast Red Chromogen 1,33 ml, solução Fast Red chromogen. 9 Solução de recuperação do epítopo 10 x Solução de recuperação do epítopo 10 x 500 ml, 100 mm Tris, 10 mm EDTA, ph 9,0, contendo 15 mmol/l de azida de sódio (NaN 3 ). REF / PT Rev 2.2

9 10 CINtec PLUS Mount CINtec PLUS Mount 18,0 ml, meio de montagem permanente com uma base aquosa para a preservação permanente de preparações de lâminas coradas com peroxidase e fosfatase alcalina com base em sistemas de visualização. Contém 7,7 mmol/l de azida de sódio (NaN 3 ) Armazenamento Conservar entre 2 8 C. Não utilizar depois do prazo de validade. Não foram gerados dados relativos ao armazenamento dos reagentes em condições diferentes das indicadas acima. Depois de aberto, os componentes do kit permanecem estáveis durante 6 meses, se armazenados entre 2 8 C. As soluções devem ser eliminadas se apresentarem um aspecto turvo. O frasco CINtec PLUS Mount (Frasco 10) deve ser removido da embalagem do kit depois de o kit ser aberto pela primeira vez e armazenado à temperatura ambiente (2 30 C). O tampão de lavagem diluído e a solução de recuperação do epítopo permanecem estáveis durante 1 mês se armazenados a uma temperatura entre 2 8 C. As soluções não devem ser utilizadas se apresentarem um aspecto turvo. Materiais e reagentes necessários mas não fornecidos O tampão de lavagem que deve ser utilizado com o Kit CINtec PLUS está disponível com o código de produto 8550 a partir da Roche mtm laboratories AG mas não é fornecido com o kit. Para obter mais detalhes, consultar o site da internet Hematoxilina sem álcool para o contraste; Água destilada ou desionizada; Etanol a 99% Meio de montagem à base de xilol para a protecção com lamela de vidro; Lâminas: SuperFrost PLUS, ThinPrep Microscopy Slides; BD SurePath PreCoat slides Xilol; Protecções de vidro ou película; Controlos de processos, por ex., lâminas ThinPrep produzidas a partir de um frasco de amostras residuais: Controlo positivo: Lâmina ThinPrep de amostra(s) (colectivas) com o resultado da citologia de Pap a confirmar uma lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL); Controlo negativo: Lâmina ThinPrep de amostra(s) (colectivas) com o resultado da citologia de Pap Negativo para uma lesão intraepitelial ou malignidade (NILM); REF / PT Rev 2.2

10 Equipamento necessário Microscópio óptico (ampliação da objectiva 10 a 40x); Tinas de coloração resistentes ao calor (plástico); Provetas graduadas; Garrafa de pulverização (a encher com tampão de lavagem); Cronómetro (capaz de intervalos de 30 segundos a 60 minutos); Banho-maria com tampa (capaz de manter uma solução de recuperação do epítopo a uma temperatura entre C); Termómetro; V. Advertências e precauções Aviso 1. Atenção! Alguns dos reagentes incluídos neste kit contêm químicos perigosos. Ao manusear os componentes deste kit, seguir as precauções de segurança para o manuseamento de reagentes laboratoriais perigosos. 2. Os componentes 1, 2, 9 e 10 deste produto contêm azida de sódio (NaN 3 ), que é altamente tóxico na sua forma pura. Nas concentrações do produto, apesar de não serem classificadas como perigosas, a azida de sódio pode reagir com a canalização de chumbo e cobre e formar acumulações altamente explosivas de azidas metálicas. Durante a eliminação, juntar com grande volume de água para evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização. 3. Os componentes 2, 3 e 4 contêm material de origem animal. Cumprir os procedimentos de manuseamento adequado conforme aplicado a qualquer produto derivado de origens biológicas. 4. Ficha de Dados de Segurança do Material para o kit disponível sob pedido. 5. Aquando do manuseamento e eliminação de amostras citológicas, incluindo todas as amostras antes e após a fixação, bem como de todos os materiais expostos a estas amostras, cumpra as precauções de segurança para o manuseamento de materiais potencialmente infecciosos, bem como os requisitos de eliminação de resíduos aplicáveis. 6. Nunca pipetar reagentes com a boca. Evitar o contacto da pele e das membranas mucosas com reagentes e amostras. No caso de os reagentes ou amostras entrarem em contacto com a pele ou membranas mucosas, lavar abundantemente com água. 7. Os reagentes para visualização, DAB Chromogen e Fast Red Chromogen podem ser adversamente afectados se expostos a níveis excessivos de luz. Não armazenar os componentes do kit ou realizar a coloração com luz forte, como luz solar directa. 8. Usar equipamento de protecção individual apropriado para evitar o contacto com os olhos e com a pele ao manusear qualquer um dos componentes incluídos ou para serem utilizados em conjunto com o Kit CINtec PLUS. Consultar a ficha de dados de segurança do material para obter informações adicionais. REF / PT Rev 2.2

11 Atenção 1. Para utilizar no diagnóstico in vitro. 2. Apenas para utilização profissional. 3. Minimizar a contaminação microbiana de reagentes para evitar coloração não específica. 4. A utilização de tempos de incubação, temperaturas ou métodos que não os especificados pode dar origem a resultados erróneos. 5. Não utilizar o kit se a embalagem de qualquer um dos componentes estiver danificada. Se a embalagem estiver comprometida ou os componentes danificados, notificar o fabricante sem demora. 6. A eliminação de todos os resíduos deve ser efectuada em conformidade com directrizes e regulamentos locais. 7. Todos os reagentes são formulados especificamente para utilização com este teste. Para o teste ser efectuado conforme especificado, não devem ser efectuada substituições. 8. Se se observar uma coloração inesperada, que não possa ser justificada pelas variações nos procedimentos laboratoriais e se suspeitar de um problema com o Kit CINtec PLUS, consultar imediatamente o site da internet para obter informações sobre a assistência técnica. 9. O mau funcionamento do produto devido a problemas de manuseamento ou instabilidade não resulta em sinais óbvios. Por isso, como medida de controlo de qualidade, devem realizar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras de doentes. VI. Procedimentos Preparações de amostras citológicas As amostras citológicas devem ser adequadamente manuseadas para preservar as amostras para procedimentos imunocitoquímicos. Todas as amostras devem ser sujeitas aos métodos padrão para o processamento de células. As lâminas ThinPrep (Hologic Inc.) preparadas no Processador ThinPrep 2000 (Hologic Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante, as lâminas BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) preparadas de acordo com o protocolo do fabricante, bem como as lâminas preparadas manualmente (esfregaços convencionais) são adequadas para utilização. Notas: 1. Preparação de amostras ThinPrep : Tenha em atenção que a utilização do Processador ThinPrep 3000 não é recomendada, uma vez que o procedimentos de fixação de pulverização fornecido pelo instrumento pode levar a uma perda celular substancial. 2. Preparação de amostras BD SurePath : REF / PT Rev 2.2

12 Uma vez que tem sido ocasionalmente relatado que o armazenamento de materiais celulares residuais após o processo de enriquecimento na água pode ter um impacto negativo na intensidade do sinal imunocitoquímico, recomendamos fortemente que siga as instruções delineadas abaixo aquando da preparação de lâminas para a realização do teste CINtec PLUS, para evitar qualquer risco de perda de sinal: a. Preparação de lâminas directamente após o processamento da lâmina do papanicolau i. Uma segunda lâmina para cada caso pode ser preparada imediatamente após a coloração do papanicolau da lâmina SurePath ser concluída. ii. Coloque um segundo conjunto de lâminas etiquetadas nos suportes de lâminas. iii. Utilizando a versão GYN 1.1 ou 1.2 do PrepStain, Preparação de lâminas, seleccione o programa "Transfer only". b. Preparação de lâminas a partir de esferas celulares enriquecidas após a preparação posterior de uma lâmina de papanicolau i. Retirar os suportes dos tubos do Sistema PrepStain e adicionar aproximadamente 2 ml de Fluido conservante SurePath a cada tubo. ii. Colocar a tampa em cada um dos tubos e armazenar à temperatura ambiente durante 4 semanas ou em refrigeração (entre 2 8 ºC) até 6 meses. iii. Se uma lâmina para o CINtec PLUS tiver de ser preparada a partir de uma amostra armazenada, permitir que a amostra se adapte à temperatura ambiente durante 1 hora. Iniciar o segundo passo de centrifugação do Processo de enriquecimento GYN e prosseguir com o procedimento Prep. c. Preparação de lâminas a partir de resíduos de amostras ainda presentes no frasco de amostra original (aproximadamente 2 ml) i. Adicionar 8 ml de Fluido conservante SurePath à amostra residual no frasco SurePath (aprox. 2 ml). ii. A amostra diluída deverá ser processada no PrepMate utilizando a técnica padrão e no PrepStain utilizando a versão 1.1 ou 1.2 do GYN, Preparação de lâminas, programa "Transfer only". Imediatamente após a preparação, as lâminas ThinPrep ou BD SurePath devem ser fixadas em etanol a 99% entre 10 minutos a uma hora e secos ao ar entre 20 minutos a 16 horas (durante a noite). A preparação de citologia ThinPrep ou BD SurePath não deve ser fixa com reagente de fixação de pulverização citológica contendo polietileno glicol (por ex., Merckofix, Merck). Os esfregaços convencionais devem ser fixos com reagente de fixação de pulverização citológica contendo polietilenoglicol (por ex., Merckofix, Merck) imediatamente após a recolha da amostra. Antes de iniciar o procedimento de imuno-coloração, todas as amostras devem ser rehidratadas seguindo os protocolos específicos descritos na Secção 2.1. REF / PT Rev 2.2

13 NOTA: É necessário utilizar um etanol com o mínimo de impurezas para a fixação de lâminas citológicas de base líquida ThinPrep para evitar a coloração do fundo. Durante a preparação de lâminas ThinPrep destinadas a serem utilizadas para a imuno-coloração, renovar o banho de etanol após a fixação de cada 25 lâminas ThinPrep. Tratamento de recuperação do epítopo induzida por calor de amostras antes da coloração A recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) utilizando a Solução de recuperação do epítopo incluída no kit é necessária para um desempenho óptimo do ensaio. O desvio do procedimento descrito pode afectar os resultados! Para a recuperação do epítopo induzida por calor, a amostra citológica deve ser aquecida por imersão na Solução de recuperação do epítopo num banho-maria calibrado capaz de manter a Solução de recuperação do epítopo a uma temperatura entre C. Laboratórios situados em locais mais elevados devem determinar o melhor método de manter a temperatura necessária do banhomaria. O fabricante não recomenda nenhum desvio ao procedimento aqui descrito. Após a recuperação do epítopo induzida por calor, a amostra citológica deve ser mantida à temperatura ambiente durante 20 minutos ou mais até que a temperatura tenha arrefecido para uma temperatura igual ou inferior a 50 ºC antes de qualquer processamento adicional. Assim, a coloração da amostra citológica deve ser efectuada sem demora. Procedimentos de coloração de lâminas O kit contém volume de reagente suficiente para efectuar 50 testes. O número de testes baseia-se na utilização de 200 µl dos reagentes por lâmina. É recomendado um volume de 200 µl por lâmina para o processamento de preparações citológicas ThinPrep ou BD SurePath nos instrumentos Dako ou LabVision Autostainer (duas gotas por lâmina com 100 µl cada) ou para utilização no sistema Shandon Coverplate (Thermo Fisher Scientific Inc.). Recomenda-se igualmente um volume de 200 µl por lâmina para o processamento de esfregaços convencionais utilizando o sistema Shandon Coverplate. No entanto, para assegurar uma completa cobertura de esfregaços convencionais nos instrumentos Dako ou LabVision Autostainer, recomenda-se a utilização de um volume de 300 µl por lâmina (100 µl para as três zonas de queda disponíveis). 1. Preparação de reagentes Recomenda-se a preparação dos seguintes reagentes, à excepção da solução de trabalho Fast Red, antes de iniciar o procedimento de coloração. Todos os reagentes devem ser equilibrados à temperatura ambiente (entre C) antes da imuno-coloração. 1.1 Solução de recuperação do epítopo Preparar a quantidade de Solução de recuperação do epítopo suficiente para o procedimento de coloração que é planeado por diluição de uma quantidade de Frasco 9 (Solução de recuperação do epítopo 10 x) 1:10 utilizando água destilada ou desionizada. REF / PT Rev 2.2

14 Após diluição, a Solução de recuperação do epítopo pode ser armazenada entre 2 8 C durante até um mês. A solução diluída deve ser eliminada se apresentar um aspecto turvo. NOTA: A utilização de água com níveis elevados de iões para diluição da solução de recuperação do epítopo pode reduzir de forma significativa o desempenho de coloração do teste. Assegurar que a água utilizada é devidamente destilada ou desionizada (isto é, assegurar que a coluna de troca de iões para produzir água desionizada foi verificada pela manutenção de rotina. Não utilizar água da torneira! 1.2 Tampão de lavagem Utilizar Tampão de lavagem (10 x), referência 8550, fornecido pela Roche mtm laboratories AG juntamente com o Kit CINtec PLUS. Para obter mais detalhes, consultar o site da internet Preparar uma quantidade de Tampão de lavagem suficiente para os passos de lavagem do procedimento de coloração que é planeado por diluição de uma quantidade do Tampão de lavagem (10 x) 1:10 utilizando água destilada ou desionizada. Depois da diluição, o Tampão de lavagem pode ser armazenado entre 2 8 C durante até um mês. A solução diluída deve ser eliminada se apresentar um aspecto turvo. 1.3 Soluções de substrato-cromogénio (DAB e Fast Red) Assegurar que os cromogénios e os substratos são equilibrados à temperatura ambiente (entre C). Adicionar o cromogénio em excesso ao substrato resultará em deterioração do sinal positivo. A) Preparação da solução de trabalho DAB antes do processo de coloração A solução de trabalho DAB permanece estável durante 8 horas após a preparação. Preparar a solução de trabalho DAB da seguinte forma: i) Transferir 1 ml da Solução de substrato DAB (frasco 5) para um tubo de reacção limpo; ii) Adicionar uma gota (entre 25 e 30 µl) de Cromogénio DAB (Frasco 6) e misturar cuidadosamente invertendo o tubo (não colocar no vórtex); iii) Ao utilizar o Autostainer, transferir a solução de trabalho DAB para um frasco de reagentes Autostainer antes de iniciar o processo de coloração e colocá-la na posição apropriada no suporte do Autostainer. B) Preparação da solução de trabalho Fast Red directamente antes da sua utilização Preparar a solução de trabalho Fast Red imediatamente antes da sua utilização, uma vez que, de outro modo, a intensidade de coloração é menor e, consequentemente, poderá ocorrer perda de sensibilização. Não colocar a solução de trabalho Fast Red no vórtex, uma vez que isto poderá resultar na formação de precipitados. REF / PT Rev 2.2

15 Preparar a solução de trabalho Fast Red da seguinte forma: i) Transferir 1 ml da Solução de fosfato de naftol (Frasco 7) para um tubo de reacção limpo; ii) Adicionar uma gota (entre 40 e 45 µl) de Cromogénio Fast Red (Frasco 8) e misturar cuidadosamente invertendo o tubo (não colocar no vórtex); iii) Ao utilizar o Autostainer, preparar a solução de trabalho Fast Red quando solicitado pelo software Autostainer. Em seguida, transferir a solução de trabalho para um frasco de reagentes Autostainer e colocá-la na posição apropriada no suporte do Autostainer. Evitar o atraso no passo "lote de substratos" durante o processo do Autostainer para minimizar o risco de secagem dos artefactos. 1.4 Contrastante As reacções de coloração DAB e Fast Red resulta num produto final colorido insolúvel em água (DAB: castanho; Fast Red: vermelho). NOTA: Deverá utilizar hematoxilina sem álcool como contrastante, uma vez que a utilização de álcool pode afectar negativamente a intensidade do sinal gerado pelo Fast Red ou até mesmo eliminá-lo completamente. Se utilizado, cumprir as instruções fornecidas pelo fornecedor da hematoxilina para efectuar o contraste. 1.5 Meio de montagem Para a montagem de amostras em lâminas depois da coloração, é necessário um procedimento de montagem de dois passos conforme descrito abaixo. Em primeiro lugar, o CINtec PLUS Mount (Frasco10), um meio de montagem permanente com base aquosa, é aplicado manualmente numa camada fina e deixado a secar ( protecção líquida ). Numa segunda fase, é aplicada uma lamela de vidro na superfície seca do meio de montagem aquoso utilizando um meio de montagem à base de xilol. Equilibrar o CINtec PLUS Mount à temperatura ambiente antes de utilizar e armazenar à temperatura ambiente para utilizações adicionais. 2. Procedimento de coloração O Kit CINtec PLUS foi validado para utilização nos Instrumentos Autostainer (por ex., o Lab Vision Autostainer 480 ou o Dako Autostainer Plus) de acordo com o modelo descrito em baixo (consultar a Secção 2.3.1), bem como no sistema Shandon Coverplate (consultar a Secção 2.3.2). Antes da coloração, as amostras e reagentes devem ser preparados conforme indicado nas secções e 2.1 Todos os reagentes devem ser equilibrados à temperatura ambiente (entre C) antes da realização do procedimento de imuno-coloração. Do mesmo modo, todos os passos devem ser efectuados à temperatura ambiente. Não deixar as amostras secar durante o procedimento de coloração. Amostras secas podem resultar num aumento de coloração não específica. Se forem utilizadas incubações prolongadas, colocar as amostras num ambiente húmido. 2.1 Rehidratação de amostras Para todas as amostras citológicas, é necessário realizar um passo de rehidratação antes do processo de coloração. Este passo deve ser efectuado à temperatura ambiente (entre C). REF / PT Rev 2.2

16 A) Lâminas de citologia ThinPrep de base líquida e esfregaços convencionais Colocar as lâminas em água destilada ou desionizada e incubar durante 10 (±3) minutos; Iniciar o procedimento de coloração conforme descrito na Secção 2.2, Passo 1: Recuperação do epítopo. B) Lâminas de citologia BD SurePath As lâminas de citologia BD SurePath fixas em álcool têm de ser submetidas a um procedimento de rehidratação especial para produzir lâminas de vidro especialmente revestidas compatíveis com o meio de protecção líquida. Certificar-se de que as lâminas foram completamente secas; Colocar as lâminas num banho fresco de 100% de xilol (utilizar tinas resistentes de xilol); mergulhar as lâminas repetidamente e incubar durante 2 minutos; Transferir as lâminas para um banho fresco de etanol a 99% e incubar durante 2 minutos; Transferir as lâminas para um banho fresco de etanol a 70% e incubar durante 2 minutos; Transferir as lâminas em água destilada ou desionizada e incubar durante 2 minutos. Nota: Substituir os banhos utilizados para a desidratação após o processamento de 50 lâminas ou uma vez por semana se for processada uma quantidade inferior de lâminas. 2.2 Recuperação do epítopo A) Lâminas de citologia ThinPrep de base líquida e esfregaços convencionais: Encher tinas de coloração resistentes ao calor (em plástico) com a Solução de recuperação do epítopo (ver Procedimento, Secção 1.1); Colocar tinas de coloração contendo Solução de recuperação do epítopo em banho-maria e em água quente e a Solução de recuperação de epítopo entre ºC. A temperatura deve ser medida no interior das tinas de coloração. É importante ajustar o nível de água no banho-maria para assegurar que as tinas estão imersas em água a um nível de 80%. Para estabilizar a temperatura e evitar evaporação, cobrir as tinas com tampas; Quando a temperatura de 95 a 99 C for alcançada, imergir as lâminas de citologia rehidratadas na Solução de recuperação do epítopo pré-aquecida nas tinas de coloração; normalmente, este passo baixa a temperatura nas tinas para menos de 90 ºC. Manter a sonda de temperatura nas tinas e fechar a tampa das tinas de coloração tão bem quanto possível. Equilibrar a temperatura do banho-maria e a Solução de recuperação do epítopo nas tinas novamente para uma temperatura entre C; verificar a temperatura da Solução de recuperação do epítopo nas tinas; incubar durante 10 (±1) minutos entre C; iniciar a contagem decrescente apenas depois de se verificar se a temperatura da Solução de recuperação do epítopo nas tinas atingiu uma temperatura entre C; REF / PT Rev 2.2

17 Remover a tina completa com lâminas do banho-maria; Remover a tampa das tinas de coloração e deixar as lâminas arrefecer na Solução de recuperação do epítopo durante 20 (±1) minutos à temperatura ambiente até atingir uma temperatura igual ou inferior a 50 C; Transferir as lâminas para uma tina de coloração com Tampão de lavagem (consultar o Procedimento, Secção 1.2) e incubar durante 5 (±1) minutos antes de carregar as lâminas para o instrumento Autostainer programado. Ao utilizar o Sistema Shandon Coverplate, monte as lâminas e lamelas de acordo com o Protocolo REF EN (disponível nos Roche mtm laboratories AG). B) Lâminas de citologia BD SurePath Encher tinas de coloração resistentes ao calor (em plástico) com a Solução de recuperação do epítopo (consultar o Procedimento, Secção 1.1). Ter em atenção que, quando utilizar tinas que não sejam feitas de plástico resistente ao calor, mas de metal ou vidro resistente ao calor, por exemplo, o tempo para a recuperação do epítopo deve ser modificado com base em cada caso individual; Imergir as lâminas na Solução de recuperação do epítopo; fechar a tampa da tina de coloração; Colocar a tina de coloração num banho de água fria e equilibrar a temperatura do banho-maria e da Solução de recuperação do epítopo para uma temperatura entre C e incubar durante 15 minutos, assim que a temperatura for atingida; ter em atenção que o período de tempo para aquecer a solução para uma temperatura entre C não deve ser superior a 40 minutos, no máximo; Remover a tina completa com lâminas do banho-maria; Remover a tampa das tinas de coloração e deixar as lâminas arrefecer na Solução de recuperação do epítopo durante 20 (±1) minutos à temperatura ambiente até atingir uma temperatura igual ou inferior a 50 C; Transferir as lâminas para uma tina de coloração com Tampão de lavagem (consultar o Procedimento, Secção 1.2) e incubar durante 5 (±1) minutos antes de carregar as lâminas para o instrumento Autostainer programado. Ao utilizar o Sistema Shandon Coverplate, montar as lâminas e lamelas de acordo com o Protocolo REF EN (disponível nos Roche mtm laboratories AG). NOTA: A Solução de recuperação do epítopo foi concebida apenas para uma única aplicação. Não reutilizar. REF / PT Rev 2.2

18 2.3 Protocolos de coloração Protocolo de coloração para Instrumentos Autostainer (Dako, LabVision) Antes da primeira aplicação do Kit CINtec PLUS num Instrumento Autostainer, deve ser configurado um novo modelo e os reagentes do Kit CINtec PLUS devem ser adicionados à "Lista de reagentes" do Autostainer. Consultar o Manual do operador do Instrumento Autostainer dedicado. A utilização de um volume de 200 µl por lâmina é recomendada para o processamento de preparações de citologia ThinPrep ou BD SurePath. Para esfregaços convencionais nos instrumentos Dako ou LabVision Autostainer, poderá ser necessário utilizar um volume de 300 µl dos reagentes por lâmina. REF / PT Rev 2.2

19 O seguinte é um resumo do programa: Programa Passo Preparações citológicas ThinPrep e Esfregaços convencionais Preparações citológicas BD Surepath 1 lavar* lavar* 2 Reagente de bloqueio da Reagente de bloqueio da peroxidase peroxidase 5 minutos 5 minutos 3 lavar* lavar* 4 Solução de anticorpos primários 30 minutos Solução de anticorpos primários 30 minutos 5 lavar* lavar* 6 Reagente de visualização de HRP 15 minutos Reagente de visualização de HRP 15 minutos 7 lavar* lavar* 8 lavar* lavar* 9 lavar* lavar* 10 Reagente de visualização de AP 15 minutos Reagente de visualização de AP 15 minutos 11 lavar* lavar* 12 lavar* lavar* 13 lavar* lavar* 14 trocar trocar 15 Passo "Substrato": DAB 10 minutos Passo "Substrato": DAB 10 minutos 16 lavar com água destilada ou lavar com água destilada ou desionizada desionizada 17 lavar* lavar* 18 Passo "Substrato-lote": Fast Red 15 minutos Passo "Substrato-lote": Fast Red 15 minutos 19 lavar* lavar* Para o LabVision Autostainer: Passo "Substrato-lote": Fast Red 15 minutos Para o Dako Autostainer: Passo Substrato : Fast Red 15 minutos lavar* 22 lavar com água destilada ou lavar com água destilada ou desionizada desionizada 23 trocar trocar *utilizar Tampão de lavagem para os respectivos passos de lavagem. REF / PT Rev 2.2

20 NOTA: Se o instrumento Autostainer utilizado para o procedimento de coloração lavar lâminas com tampão, as lâminas devem ser lavadas com água destilada ou desionizada depois de serem retiradas do Autostainer. Após o programa, proceder da seguinte forma: Transferir os reagentes das garrafas do kit para os frascos de reagente Autostainer. Utilizar o mapa gerado pelo Autostainer para programar tempos e volumes de reagente; Colocar os frascos de reagente do Autostainer no suporte de reagentes Autostainer de acordo com o "mapa de disposição de reagentes"; Carregar as lâminas para o Autostainer de acordo com o "Mapa de disposição de lâminas" e lavar as lâminas com Solução de lavagem para evitar a secagem das amostras Protocolo de coloração para o Sistema Shandon Coverplate Montar as lâminas uma ao lado da outra com as lamelas de acordo com o Protocolo REF EN (disponível nos Roche mtm laboratories AG) e colocá-las numa posição vertical no suporte de lâminas. Verificar se a montagem do Sistema Shandon Coverplate está correcta enchendo o reservatório de reagentes com água destilada ou desionizada (2 ml) e incubando durante 5 minutos para deixar a água sair completamente pela abertura. O sistema de lâminas e lamelas montado é à prova de fugas se a água correr lentamente pela abertura entre a lâmina e a lamela. 1. Equilibração: Encher o reservatório de reagentes com Tampão de lavagem (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar o tampão de lavagem sair completamente pela abertura; repetir este passo uma vez; 2. Aplicar 200 µl de Reagente de bloqueio da peroxidase. Incubar durante 5 minutos; 3. Encher o reservatório de reagentes com tampão de lavagem (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar o tampão de lavagem sair completamente pela abertura; 4. Aplicar 200 µl de Solução de anticorpos primária (p16 INK4a /Ki-67). Incubar durante 30 minutos; 5. Encher o reservatório de reagentes com tampão de lavagem (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar o tampão de lavagem sair completamente pela abertura; 6. Aplicar 200 µl de Reagente de visualização de HRP. Incubar durante 15 minutos; 7. Encher o reservatório de reagentes com tampão de lavagem (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar o tampão de lavagem sair completamente pela abertura; Repetir este passo duas vezes; 8. Aplicar 200 µl de Reagente de visualização de AP. Incubar durante 15 minutos; REF / PT Rev 2.2

21 9. Encher o reservatório de reagentes com tampão de lavagem (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar o tampão de lavagem sair completamente pela abertura; Repetir este passo duas vezes; 10. Aplicar 200 μl de solução de substrato-cromogénio DAB que tenha sido preparada de acordo com o procedimento descrito na Secção 1.3 acima. Incubar durante 10 minutos; 11. Encher o reservatório de reagentes com água destilada ou desionizada (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar a água sair completamente pela abertura; 12. Encher o reservatório de reagentes com tampão de lavagem (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar o tampão de lavagem sair completamente pela abertura; 13. Aplicar 200 μl de solução de substrato-cromogénio Fast Red que tenha sido preparada de acordo com o procedimento descrito na Secção 1.3 acima. Incubar durante 15 minutos; Nota: Para as preparações de lâminas BD SurePath, este passo deve ser repetido uma vez. 14. Encher o reservatório de reagentes com água destilada ou desionizada (2 ml) e incubar durante 5 minutos para deixar a água sair completamente pela abertura; Repetir este passo uma vez. Para recuperar as lâminas, puxar cuidadosamente todo o conjunto de lâmina/lamela para fora do suporte de lâminas utilizando o polegar e o segundo dedo na traseira e, em seguida, retirar cuidadosamente a lâmina da lamela. Idealmente, este processo é realizado submerso em água. Colocar as lâminas em água destilada ou desionizada e prosseguir com o contrastante. 2.4 Aplicar o contrastante com hematoxilina Mergulhar as lâminas num banho de hematoxilina sem álcool. Incubar entre 2 e 10 minutos, dependendo do potencial da hematoxilina sem álcool utilizada; NOTA: A utilização de hematoxilina sem álcool é absolutamente obrigatória. Corar as lâminas num banho-maria de água tépida ou numa solução alcalina como uma solução de amónia fraca (NH 4 OH, 0,08% em água desionizada) e incubar entre 30 segundos a 2 minutos; REF / PT Rev 2.2

22 Para assegurar que todos os resíduos de hematoxilina foram eliminados, substituir posteriormente a água tépida na tina várias vezes (entre 3 e 5 x) com nova água tépida até não conseguir observar quaisquer resíduos de coloração; Incubar brevemente as lâminas num banho de água destilada ou desionizada. NOTA: Dependendo da duração da incubação e do potencial da hematoxilina utilizada, um contrastante resultará numa coloração azul clara a escura dos núcleos das células. A adição excessiva ou insuficiente de contrastante pode interferir com a interpretação correcta dos resultados. 2.5 Montagem Para manter uma sensibilidade óptima e prevenir o esbatimento do cromogénio Fast Red, é necessário implementar um procedimento de montagem de dois passos. Após de aplicar um contraste e corar, as lâminas deverão ser montadas seguindo um protocolo de dois passos. Os passos A e B devem ser realizados sequencialmente: A) Liquid coverslipping Incubar lâminas em água destilada ou desionizada durante pelo menos 1 min; Remover as lâminas da água destilada ou desionizada sem qualquer secagem; Sacudir o excesso de líquido sem secar as amostras; limpar cuidadosamente a parte inferior das lâminas com uma toalha de papel para remover a água; Aplicar 4 gostas de CINtec PLUS Mount (1 gota corresponde entre 35 a 40 µl deste meio de montagem aquoso) por lâmina LBC e 8 gotas para um esfregaço convencional, respectivamente. Evitar a criação de bolhas de ar. Para evitar a formação de pequenas bolhas, a primeira gota pode ser eliminada para uma toalha de papel antes de aplicar o CINtec PLUS Mount na amostra; Inclinar e rodar cuidadosamente a lâmina de vidro para criar uma fina camada de meio de montagem e para cobrir totalmente a amostra (NÃO aplicar ainda uma lamela de vidro ou película!); verificar a distribuição do meio de montagem na lâmina efectuando uma inspecção visual; Para a secagem de lâminas numa posição horizontal: a. Incubar as amostras ThinPrep ou BD SurePath a uma temperatura entre C durante 1 hora ou, de forma alternativa, durante a noite à temperatura ambiente; b. Incubar esfregaços convencionais a 37 ºC durante 4 horas ou a 60 ºC durante 1 hora ou, de forma alternativa, durante a noite à temperatura ambiente; B) Protecções de vidro ou película REF / PT Rev 2.2

23 Depois de concluir a secagem do meio de montagem aquoso, incubar as lâminas em xilol durante no mínimo 1 minuto e, no máximo, durante 20 minutos. Em seguida, proteger as lâminas utilizando um meio de montagem à base de xilol. NOTA: As lâminas não devem ser desidratadas por uma série ascendente de álcool antes de iniciar a protecção com vidro ou película. Deixar o meio de montagem à base de xilol secar à temperatura ambiente; NOTA: Para minimizar o esbatimento, proteger as lâminas da luz e armazenar à temperatura ambiente (entre C). VII. Controlo de qualidade Desvios aos procedimentos recomendados para fixação e processamento adicional de amostras citológicas do colo do útero podem produzir uma variabilidade significativa de resultados, sendo necessário o processamento regular de controlos internos. Controlo positivo As amostras processadas da mesma forma que as amostras do doente devem ser utilizadas como controlos positivos. Os controlos positivos são indicativos de amostras correctamente preparadas e técnicas de coloração adequadas. Um controlo positivo deverá ser incluído em cada processo de coloração. Os controlos positivos conhecidos deverão ser utilizados apenas para monitorizar o correcto desempenho das amostras processadas e dos reagentes de teste, e não para auxiliar na formulação de um diagnóstico específico das amostras de doentes. Se os controlos positivos não demonstrarem uma coloração positiva adequada, os resultados das amostras de teste deverão ser considerados inválidos. Controlo negativo Utilizar um controlo negativo processado de forma idêntica à(s) amostra(s) de doentes com cada processo de coloração para verificar a especificidade do procedimento de coloração e para fornecer uma indicação da coloração de fundo. Uma variedade de diferentes tipos de células presentes em amostras citológicas do colo do útero representativas e que se sabe serem negativas para a expressão dos antigénios p16 INK4a e Ki-67 (como por exemplo, células superficiais) podem servir como um controlo interno negativo adicional para avaliar qualquer coloração de fundo (isto deverá ser verificado pelo utilizador). Verificação do ensaio Antes da utilização inicial de qualquer anticorpo ou sistema de coloração num procedimento de diagnóstico, o utilizador deve verificar a especificidade do anticorpo através do teste de uma série de amostras internas com características de desempenho imunocitoquímicas conhecidas, representando amostras positivas e negativas. Consultar os procedimentos de controlo de qualidade anteriormente descritos nesta secção do folheto informativo e os requisitos de controlo de qualidade do programa de certificação CAP para imuno-histoquímica e/ou a norma aprovada Quality Assurance for Immunocytochemistry (CLSI - NCCLS). REF / PT Rev 2.2

24 VIII. Interpretação dos resultados O procedimento CINtec PLUS causa dois produtos de reacção coloridos distintos: um precipitado castanho nos locais do antigénio p16 INK4a e um precipitado vermelho nos locais do antigénio Ki-67. A coloração castanha das células (citoplasma e/ou núcleo) indica uma sobre-expressão do p16 INK4a. A coloração vermelha das células (núcleo) indica a expressão do Ki-67. As células que apresentam coloração para ambos os antigénios exibem, normalmente, uma coloração citoplasmática castanha com um núcleo acentuadamente vermelho. Um patologista/citologista qualificado com experiência em procedimentos imunocitoquímicos e com formação na interpretação de lâminas CINtec PLUS com coloração deverá avaliar os controlos positivos e negativos antes de interpretar os resultados. A interpretação dos resultados tem que ser efectuada dentro do contexto do historial clínico do doente, e através de outros testes de diagnóstico, por um profissional certificado. Relativamente à interpretação de lâminas de citologias do colo do útero coradas com o Kit CINtec PLUS, as lâminas devem ser avaliadas quanto à presença de células epiteliais do colo do útero com uma coloração citoplasmática castanha e uma coloração nuclear vermelha, indicativas da expressão simultânea de p16 e do Ki-67. A presença de uma ou mais células epiteliais do colo do útero com a colocalização de imuno-coloração citoplasmática castanha E imuno-coloração nuclear vermelha dentro da mesma célula é interpretada como um resultado de teste CINtec PLUS positivo. Caso não existam quaisquer células epiteliais do colo do útero com imunocoloração citoplasmática castanha E imuno-coloração nuclear vermelha, o resultado do teste CINtec PLUS é considerado negativo. Ter em atenção que a presença de células epiteliais do colo do útero que não apresentam imuno-reactividade apenas para um dos dois marcadores (como por exemplo, coloração castanha apenas para o p16 ou coloração vermelha apenas para o Ki-67) não é considerada um resultado de teste positivo para o Kit CINtec PLUS, mesmo que ambos os tipos potenciais de células do colo do útero apresentem uma imuno-reactividade individual apenas quando presentes na mesma lâmina citológica. Em caso de presença de células com sinais morfológicos de discariose grave, mas sem qualquer coloração dupla para o p16 e para o Ki-67, os critérios de interpretação morfológicos não devem ser ignorados. IX. Limitações Apenas para utilização profissional. É necessária formação especial para o desempenho de procedimentos imunocitoquímicos. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou negativa, deve ser avaliada dentro do contexto do historial clínico e critérios citológicos. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou negativa, deve ser complementada por meio de estudos morfológicos que utilizem controlos positivos e negativos, bem como por meio de outros testes de diagnóstico. É da responsabilidade de um patologista/citologista qualificado que está familiarizado com a utilização correcta dos anticorpos, reagentes e métodos, interpretar todas as etapas realizadas para preparar e interpretar a preparação imunocistoquímica final. REF / PT Rev 2.2

25 Os resultados de coloração em procedimentos de imunocistoquímica são fortemente influenciados pela qualidade das células coradas. Em conformidade, o manuseamento apropriado das etapas de protocolo para fixação, lavagem, secagem ou aquecimento das lâminas, bem como evitar a utilização de reagentes contaminados com bactérias irá contribuir significativamente para o resultado global do procedimento de coloração. Os desvios ao protocolo poderão produzir artefactos, aprisionamento de anticorpos ou resultados falsos negativos. Os resultados inconsistentes podem ser resultantes de variações nos métodos de fixação ou amostragem não adequada. A adição excessiva ou insuficiente de contrastante pode interferir com a interpretação correcta dos resultados. O fabricante fornece estes anticorpos/reagentes com a diluição ideal para utilização de acordo com as instruções aqui fornecidas, para testes de imunocitoquímica em lâminas de citologia com base em fluidos (LBC) ou esfregaços convencionais. Qualquer desvio aos procedimentos de teste recomendados pode invalidar resultados esperados declarados; devem ser empregues e documentados controlos adequados. Os utilizadores que se desviem dos procedimentos de teste recomendados terão de aceitar a responsabilidade da interpretação dos resultados das doentes nestas circunstâncias. Poderão observar-se resultados falsos positivos devido a ligação não imunológica de proteínas ou produtos de reacção dos substratos. Tais resultados poderão igualmente ser provocados por actividade de pseudoperoxidase (eritrócitos) e actividade de peroxidase endógena (por ex., citocromo C). Não substituir reagentes do kit por reagentes com números de lote diferentes ou com reagentes de outros fabricantes. X. Características de desempenho Desempenho clínico O desempenho clínico do Kit CINtec PLUS foi avaliado em três estudos clínicos separados: a. O ensaio PALMS Primary ASC-US LSIL Marker Study (Estudo de marcador ASC-US LSIL primário) b. O ensaio EEMAPS European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study (Estudo europeu de resultados de citologia de Pap equívocos ou ligeiramente anormais) c. O ensaio Wolfsburg Um subestudo incorporado no projecto de co-teste Pap/HPV Wolfsburg Descrições dos estudos: a. PALMS Primary ASC-US LSIL Marker Study (Estudo de marcador ASC-US LSIL primário) O ensaio PALMS foi realizado como um estudo clínico de diagnóstico provável, multinacional e multicêntrico. O estudo foi concebido para demonstrar a adequação do Kit CINtec PLUS como auxiliar na identificação de mulheres com neoplasia intra-epitelial do colo do útero de elevado grau estabelecida (isto é, CIN2 e superior, CIN2+) (a) em mulheres submetidas a rastreio do cancro do colo do útero de rotina, (b) no subgrupo de doentes com resultados da citologia de Pap de ASC- REF / PT Rev 2.2

26 US (células escamosas atípicas de significado indeterminado), ou (c) no subgrupo de doentes com resultados da citologia de Pap de LSIL (lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau). Os principais objectivos do estudo foram 1. Avaliar a sensibilidade e especificidade do Kit CINtec PLUS na identificação de mulheres com neoplasia intra-epitelial do colo do útero de elevado grau (CIN2+) num cenário de rastreio primário do cancro do colo do útero; em mulheres com um resultado da citologia de Pap de ASC-US; em mulheres com resultados de citologia de Pap de LSIL. 2. Comparar a sensibilidade e especificidade do Kit CINtec PLUS Kit na identificação de neoplasia intra-epitelial do colo do útero de elevado grau (CIN2+) para testes de citologia de Pap (rastreio) e testes de HPV (triagem de ASC-US e LSIL; rastreio). O estudo foi realizado a um total de mulheres submetidas a consultas de rotina para rastreio do cancro do colo do útero em cinco países europeus (Bélgica, França, Alemanha, Itália e Espanha) e potencialmente inscritas para o ensaio depois de darem o seu consentimento informado por escrito. Durante a consulta de rastreio, foram recolhidas duas amostras ao colo do útero a todas as mulheres participantes: Foi recolhida uma primeira amostra ao colo do útero utilizando um dispositivo de amostragem do tipo de varrimento e utilizado para efectuar um teste de citologia de Pap, ao preparar um esfregaço numa lâmina de vidro para a análise de esfregaço Pap convencional ou ao transferir o material do colo do útero num frasco de colheita para citologia com base em fluidos (Teste Pap ThinPrep, Hologic, Marlborough, MA; ou SurePath, BD Diagnostics, Burlington, NC) para a preparação subsequente da lâmina para teste de Pap. Uma segunda lâmina foi preparada para todas as amostras, quer a partir do material residual no dispositivo de amostragem que foi utilizado para a preparação inicial de um esfregaço de Pap convencional (técnica de "amostra dividida"), quer a partir do material residual do respectivo frasco para citologia com base em fluidos, e subsequentemente utilizado para o teste da citologia com dupla coloração p16/ki-67. Uma segunda amostra do colo do útero foi recolhida de cada participante no estudo utilizando o DNAPap Cervical Sampler (Qiagen, Hilden, Germany), um dispositivo de amostragem tipo varrimento combinado com um meio de colheita, especificamente concebido para a colheita de amostras para testes de HPV. Estas amostras foram subsequentemente utilizadas para determinar a presença de infecções de HR-HPV utilizando o teste digene HC2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen). O teste Pap foi realizado localmente num total de 16 laboratórios de citologia europeus e utilizando o sistema de classificação de Bethesda [28]. O teste da citologia com dupla coloração foi realizado centralmente seguindo os protocolos nas Instruções de utilização do Kit CINtec PLUS (Roche mtm laboratories AG). Para fins de interpretação, as lâminas foram analisadas quanto à presença de células do colo do útero com dupla coloração por parte de membros individuais de uma equipa independente de 8 citologistas contratados para a interpretação das lâminas no decorrer dos ensaios clínicos. Todos os resultados de citologia com dupla coloração positivos foram revistos e confirmados por membros de uma equipa de 5 patologistas europeus. REF / PT Rev 2.2

27 O teste de HPV foi realizado por um total de 6 laboratórios clínicos independentes em França, Alemanha e Itália. Quaisquer resultados de testes positivos, isto é, um resultado de citologia de Pap de ASC-US ou superior (ASC-US+), e/ou resultado de teste positivo CINtec PLUS e ou resultado de teste HR-HPV positivo (em mulheres com 30 ou mais anos), desencadearam uma consulta para colposcopia. Durante a colposcopia, foram efectuadas biópsias conforme clinicamente indicado. Os diagnósticos de histologia foram estabelecidos em secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina em lâminas coradas por H&E. O resultado de patologia local para cada caso foi comparado ao resultado de um patologista de análise de CQ europeu independente. Qualquer discrepância entre os resultados locais e os primeiros resultados de análise de CQ, bem como quaisquer diagnósticos de CIN2 ou de grau mais elevado (CIN2+) resultaram numa análise de CQ completa por parte de um painel de patologistas europeus considerados especialistas em patologia ginecológica. Os dois diagnósticos entre três diagnósticos de consenso maioritário ou diagnósticos adjudicados para os casos onde não se alcançou uma maioria, foram utilizados como os diagnósticos padrão para os fins do estudo. Os resultados de histologia foram confirmados através de uma avaliação independente do padrão de coloração p16 IHC em secções consecutivas preparadas a partir dos blocos de tecido e imuno-corados utilizando o Kit de Histologia CINtec (Roche mtm laboratories AG, REF 9511). Apenas nos casos onde o padrão de coloração p16 não suportava o diagnóstico histológico estabelecido nas lâminas coradas por H&E, foi efectuada uma adjudicação separada por parte de 3 patologistas de análise de CQ nas secções de tecido corado por H&E e p16. Todos os dados do ensaio PALMS são comunicados após a correcção estatística quanto a tendências da verificação devido a alguma disparidade nos procedimentos de acompanhamento colposcópicos e verificação da doença para resultados positivos dos três testes individuais, isto é, citologia de Pap, CINtec PLUS ou teste de HPV. b. EEMAPS European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study (Estudo europeu de resultados de citologia de Pap equívocos ou ligeiramente anormais) O ensaio EEMAPS foi um estudo clínico de controlo de caso multinacional e multicêntrico utilizando preparações de citologia do colo do útero com base em fluidos recolhidas retrospectivamente (ThinPrep, Hologic ). O estudo foi realizado para provar a utilidade do teste CINtec PLUS como um auxiliar na identificação de mulheres com CIN2+ subjacente no subgrupo de doentes com resultados de citologia de Pap categorizado como ASC-US ou LSIL de acordo com o sistema de classificação de Bethesda [28] e quando estava disponível material residual no frasco para citologia com base em fluidos ThinPrep. Foram seleccionados os casos para os quais estavam disponíveis amostras de tecido histológicas correspondentes obtidas durante os procedimentos de acompanhamento do diagnóstico, efectuados num período de 6 meses após a citologia de Pap. As amostras de tecido histológicas englobaram uma distribuição de biópsias do colo do útero obtidas por punção, biópsias por cone e amostras de curetagem endocervical. Os principais objectivos do estudo eram 1. Avaliar a sensibilidade e especificidade do Kit CINtec PLUS na identificação de CIN2+ em mulheres com resultados de citologia de Pap de ASC-US ou LSIL; REF / PT Rev 2.2

28 2. Comparar a sensibilidade e especificidade da detecção de CIN2+ ao utilizar o Kit CINtec PLUS com a sensibilidade e especificidade ao utilizar o teste digene HC2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen) em mulheres com resultados de citologia de Pap de ASC-US ou LSIL. O teste de HPV foi realizado centralizado num laboratório clínico qualificado acreditado na Alemanha e de acordo com as instruções do fabricante. Para a citologia com dupla coloração p16/ki-6, foi utilizado o material residual dos frascos para citologia com base em fluidos ThinPrep para preparar lâminas novas utilizando um Processador T2000 ThinPrep (Hologic ). As lâminas foram subsequentemente submetidas a imuno-coloração seguindo o protocolo destacado nas Instruções de utilização do Kit CINtec PLUS. As lâminas foram analisadas por um único citotécnico quanto à presença de células do colo do útero com dupla coloração. Todos os casos identificados pela análise do citotécnico que demonstraram uma ou mais células com dupla coloração foram sujeitos a confirmação através da análise de um patologista para a obtenção de resultados finais de citologia de dupla coloração. O diagnóstico histológico estabelecido em amostras de blocos de tecido recortados foi utilizado como o diagnóstico padrão (isto é, critério de precisão de diagnóstico) para o estudo com o qual os resultados dos teste de citologia com dupla coloração e os testes de HPV foram comparados. Foi estabelecido um diagnóstico de consenso maioritário para cada caso por dois ou mais patologistas de análise de CQ de uma equipa de cinco patologistas. Os profissionais que efectuaram a análise não tiveram acesso ao resultado histopatológico original do centro de estudo local que concedeu as amostras e não tiveram acesso a todos os outros resultados de testes. Os patologistas de análise de CQ realizaram uma análise combinada das lâminas coradas por H&E e lâminas consecutivas coradas para p16 com o Kit de Histologia CINtec (Roche mtm laboratories AG) neste estudo particular. Foi disponibilizado um total de 776 casos, dos quais 361 casos de ASC-UC e 415 casos de LSIL para análise. c. O estudo Wolfsburg Um subestudo incorporado no projecto de coteste Pap/HPV Wolfsburg O objectivo global do estudo foi investigar a utilidade clínica do Kit CINtec PLUS como teste de rastreio, bem como um teste de reflexo para resultados de testes negativos de Pap e positivos de HPV em mulheres com 30 anos ou mais. A avaliação das características de desempenho do Kit CINtec PLUS Kit para a identificação de mulheres com lesões intra-epiteliais do colo do útero de elevado grau estabelecidas (HGCIN) foi efectuada como um subestudo incorporado no projecto de co-teste Pap/HPV Wolfsburg. Os objectivos do estudo eram 1. Avaliar a sensibilidade e especificidade da citologia com dupla coloração para a identificação de HGCIN num cenário de rastreio do cancro do colo do útero; 2. Comparar a sensibilidade e especificidade da citologia com dupla coloração para a identificação de HGCIN num cenário de rastreio do cancro do colo do útero à sensibilidade e especificidade do teste de citologia de Pap com base em fluidos e teste de HPV, respectivamente; 3. Avaliar o desempenho do diagnóstico de citologia com dupla coloração na triagem de resultados de teste de rastreio negativos de Pap e positivos de HPV. REF / PT Rev 2.2

29 O estudo foi realizado com um estudo de diagnóstico retrospectivo multicêntrico em amostras do estudo potencialmente colhidas. As mulheres com 30 ou mais anos que assinaram um consentimento informado por escrito foram inscritas no projecto de rastreio Wolfsburg. Na consulta de selecção, foi colhida uma primeira amostra do colo do útero utilizando um dispositivo de amostragem com espátula/escova ou tipo varrimento e directamente transferida para um frasco de amostragem para teste Pap ThinPrep (Hologic ). Subsequentemente, foi colhida uma segunda amostra do colo do útero utilizando o DNAPap Cervical Sampler (Qiagen) e o respectivo frasco de amostragem para o subsequente teste de HPV utilizando o teste digene HC2 High- Risk HPV DNA Test (Qiagen). Foi efectuada a citologia de Pap (teste Pap ThinPrep ) centralizada num laboratório independente directamente após a consulta de inscrição. A amostra da primeira lâmina foi preparada a partir do frasco para citologia com base em fluidos para o teste Pap. O teste de HPV foi efectuado num laboratório clínico centralizado em Wolfsburg. As mulheres foram encaminhadas para colposcopia com base apenas nos resultados dos teste de HPV e de citologia de Pap, seguindo os requisitos do algoritmo do estudo de co-teste de Pap/HPV Wolfsburg. As mulheres com resultados positivos para citologia de Pap (Pap IIw; utilizando a nomenclatura de Munique), quase equivalente a ASC-US), utilizado como limiar) e testes de HPV foram encaminhadas para colposcopia imediata; As mulheres com resultados positivos Pap mas resultados HPV negativos ou resultados negativos Pap mas resultados HPV positivos foram encaminhadas para colposcopia apenas quando os resultados do teste de Pap ou HPV eram persistentemente positivos no decorrer de um ou mais procedimentos de teste repetidos nos 6-12 meses seguintes, ou mais; As mulheres com resultados de testes negativos para citologia de Pap e testes de HPV não foram submetidas a testes de rastreio do colo do útero repetidos durante um período de 5 anos. O teste de citologia com dupla coloração p16/ki-67 foi efectuado retrospectivamente após 1-2 anos de armazenamento dos frascos ThinPrep. A preparação da lâmina e imuno-coloração foram efectuadas centralmente no laboratório do promotor. As lâminas foram analisadas quanto à presença de células do colo do útero com dupla coloração por parte de membros individuais de uma equipa de 8 citotécnicos independentes contratados para a interpretação das lâminas durante os ensaios PALMS e Wolfsburg. Todos os resultados de citologia com dupla coloração positivos foram revistos e confirmados por um único patologista independente. Os diagnósticos histológicos dos materiais das biópsias serviram como os diagnósticos padrão. Todos os resultados histológicos locais foram verificados por membros de um conselho de análise de CQ independente de 6 patologistas europeus, cujos resultados foram ocultados ao centro clínico para interpretação, bem como todos os outros resultados de testes. O processo de análise de CQ foi efectuado em analogia ao processo estabelecido para o ensaio PALMS (consulte acima). REF / PT Rev 2.2

30 Para a análise de secções transversais da população de rastreio em mulheres com 30 ou mais anos, casos foram seleccionados aleatoriamente de um total de mulheres inscritas no Projecto Wolfsburg durante 2007 e 2008 e com material celular residual suficiente deixado no frasco para citologia com base em fluidos. Para avaliar a utilidade do teste CINtec PLUS na triagem das mulheres testadas com resultados Pap negativos, mas com resultados de HPV positivos, todos os casos com esses resultados de testes (n=427) do grupo de mulheres foram incluídas na análise. Resultados: TODAS AS TABELAS E A FIGURA 1 SÃO APRESENTADAS NO ANEXO 2! DESEMPENHO CLÍNICO DO TESTE CINtec CANCRO DO COLO DO ÚTERO PLUS NO RASTREIO DO A Tabela 1 demonstra que as taxas de positividade para o CINtec PLUS foram encontradas em níveis comparáveis às taxas de anormalidade de Pap (limiar de ASC-US ou superior; ASC-US+), e aproximadamente a metade das taxas de positividade para o teste HR-HPV, independentemente dos grupos etários. Na Tabela 2, são apresentadas as taxas de sensibilidade e especificidade para o teste CINtec PLUS na população de rastreio conforme confirmado no ensaio PALMS. A sensibilidade do teste CINtec PLUS para CIN2+ em todas as idades foi de 90,1% (IC de 95% 85,3-93,5), significativamente superior à sensibilidade dos testes de citologia de Pap (6,4%; IC de 95% 59,5-72,6; Aumento de 36%, p<0,0005). A sensibilidade do teste de HPV para a detecção de CIN2+ foi encontrada em 96,4% (IC de 95% 93,1-98,3). A especificidade do teste CINtec PLUS (95,3; IC de 95% 95,0-95,6) foi encontrada ao mesmo nível elevado que a especificidade do teste de citologia de Pap (95,4%; IC de 95% 95,2-95,7), enquanto a especificidade do teste de HPV foi de 90,2% (IC de 95% 88,1-92,4) em todas as idades. As diferenças das taxas de especificidade entre CINtec PLUS ou citologia de Pap vs. teste de HPV foram altamente significativas, do ponto de vista estatístico (p< 0,0005), com taxas de resultados falsos positivos duplamente mais elevadaspara o teste de HPV em todas as idades, bem como nos grupos etários <30 vs. 30 anos. Os resultados para a avaliação da sensibilidade e especificidade para o CINtec PLUS vs. a citologia de Pap e teste de HPV, respectivamente, no Estudo Wolfsburg são demonstrados na Tabela 3. Os elevados níveis de sensibilidade e especificidade do CINtec PLUS para a detecção de CIN de elevado grau conforme encontrado no ensaio PALMS (consulte a Tabela 2) são confirmados de modo independente pelos resultados do estudo Wolfsburg em mulheres com 30 ou mais anos. DESEMPENHO CLÍNICO DO TESTE CINtec PLUS NA TRIAGEM DE MULHERES COM CITOLOGIA DE PAP ASC-US PARA DETERMINAR A NECESSIDADE DE ENCAMINHAMENTO PARA COLPOSCOPIA A sensibilidade e especificidade do CINtec PLUS para a detecção de CIN+2 confirmada por biópsia na altura da colposcopia na triagem de casos de citologia de ASC-UC em mulheres de todas as idades foram encontradas no PALMS em 94,6% (n=17/18) e 77,5%, respectivamente (Tabela 4) e no EEMAPS em 92,2% (n=71/77) e 80,6%, respectivamente (Tabela 5). REF / PT Rev 2.2

31 O teste de HPV forneceu níveis de sensibilidade comparáveis (100% (n=18/18) no PALMS) e 90,9% (n=70/77) no EEMAPS), mas em níveis de especificidade significativamente mais baixos (60,7% no PALMS e 36,3% no EEMAPS). Esta melhoria da especificidade é ainda mais elevada no grupo etário mais novo (ou seja, mulheres com menos de 30 anos de idade), conforme ilustrado na Tabela 5, contudo, também no grupo etário mais velho ( 30 anos), a especificidade do CINtec PLUS é duplamente mais elevada qando comparada com o teste de HPV (85,5% vs. 43,6%). Uma vez que as taxas positivas para o CINtec PLUS na categoria ASC-US no potencial ensaio PALMS foram encontradas em 25,6% vs. 41,9% para o teste de HPV, o teste com o CINtec PLUS poderá permitir uma triagem de ASC-UC mais eficaz, fornecendo uma sensibilidade comparável para o CIN de elevado grau subjacente, apesar de uma taxa mais reduzida de mulheres encaminhadas para colposcopia. DESEMPENHO CLÍNICO DO TESTE CINtec PLUS NA TRIAGEM DE MULHERES COM CITOLOGIA DE PAP LSIL PARA DETERMINAR A NECESSIDADE DE ENCAMINHAMENTO PARA COLPOSCOPIA As taxas de positividades do teste CINtec PLUS em casos de citologia categorizados como LSIL nos ensaios PALMS e EEMAPS são apresentadas na Tabela 6 e Tabela 7 e comparadas às taxas de positividade do teste de HPV. A taxa de positividade de 52,4% (PALMS) e 52,3% (EEMAPS) para o teste CINtec PLUS em LSIL é significativamente mais baixa que a taxa de resultados de teste HR-HPV positivos de 83,9% (PALMS) e 86,2% (EEMAPS), demonstrando o potencial do teste CINtec PLUS como uma ferramenta de triagem eficiente para os resultados de citologia de Pap LSIL. A sensibilidade e especificidade do CINtec PLUS para a detecção de CIN+2 confirmada por biópsia na altura da colposcopia na triagem de casos de citologia de LSIL em mulheres de todas as idades foram encontradas no PALMS em 85,4% (n=54/63) e 53,9%, respectivamente (Tabela 6) e no EEMAPS em 94,2% (n= 129/137) e 68,0%, respectivamente (Tabela 7). DESEMPENHO CLÍNICO DO TESTE CINtec PLUS NA TRIAGEM DE MULHERES COM RESULTADOS DE TESTE DE CITOLOGIA DE PAP NEGATIVOS E DE HPV POSITIVOS PARA DETERMINAR A NECESSIDADE DE ENCAMINHAMENTO IMEDIATO PARA COLPOSCOPIA A Figura 1 apresenta a taxa de positividade do teste CINtec PLUS na triagem de casos testados negativos em Pap, mas positivos em HR-HPV. Aproximadamente um quarto (n=109; 25,5%) dos casos com resultados de Pap negativos e HPV positivos apresentaram células epiteliais do colo do útero com dupla coloração para p16 e Ki-67, enquanto 318 em 427 casos apresentaram resultados negativos (74,5%). Mais de 90% do CIN2+ subjacente foram encontrados no grupo de casos positivos de CINtec PLUS, isto é, 34 de 37 biópsias confirmaram casos de CIN2+ que foram identificados durante o acompanhamento (duração média de acompanhamento de 12,5 meses). REF / PT Rev 2.2

32 XI. Resolução de problemas Problema Causa provável Acção sugerida 1. Sem coloração de lâminas 2. Coloração de lâminas fraca 1a. Desvio das Instruções de utilização; 1b. Os frascos de reagente não foram carregados nas localizações correctas nos suportes de reagentes; 1a. Ler cuidadosamente as Instruções de utilização e cumprir os procedimentos aqui resumidos; 1b. Verificar o Mapa de Reagentes para verificar a localização adequada dos frascos de reagente; 1c. Reagente insuficiente no frasco; 1c. Garantir que foi carregado reagente suficiente nos frascos antes de iniciar o processamento. Consultar o Mapa de Reagentes para obter informações sobre os volumes necessários; 1d. Ausência de Tampão de lavagem para os Instrumentos Autostainers Dako ou LabVision; 2a. Recuperação do epítopo inadequada; 2b. Tempos de incubação de reagente inadequados; 1d. Verificar que existe o tampão suficiente. Caso contrário, encher o recipiente com tampão e preparar a bomba; Verificar se a tubagem de plástico transparente em redor da seringa (situada no lado esquerdo do braço articulado) contém bolhas de ar - se for esse o caso, remover as bolhas poderá resolver o problema; 2a. Utilizar Solução de recuperação do epítopo e/ou garantir que a Solução de recuperação do epítopo atinge entre 95 e 99 C para um total de 10 minutos e arrefece mais 20 minutos; Garantir que não entra água nas tinas de coloração resistentes ao calor durante o procedimento de recuperação do epítopo. Consultar o ponto 2.2 para obter recomendações; 2b. Rever os pontos / Protocolo de coloração, para obter recomendações; 2c. Método de fixação inadequado; 2c. Garantir que as preparações de citologia são fixadas conforme salientado na Secção VII ou que não foi utilizado nenhum fixador alternativo; 2d. Água que tenha sido utilizada para diluir a solução de recuperação do epítopo inclui uma concentração de iões demasiado elevada; 2e. Ausência de Tampão de lavagem para os Dispositivos de coloração automáticos Dako ou LabVision; 2d. Garantir que a coluna de troca de iões para produzir água desionizada foi verificada pela manutenção de rotina; 2e. Consultar a Secção 1d da resolução de problemas; REF / PT Rev 2.2

33 3. Sem colocação ou coloração Ki67 fraca (vermelha) em lâminas de controlo positivas 4. Coloração de lâminas de fundo excessiva 2f. Diluição dos componentes do kit com tampão de lavagem devido a um tempo de espera inadequado após as etapas de lavagem para o Shandon Coverplate System; 3a. Utilização de álcool contendo hematoxilina (por ex., Harris ); 3b. As lâminas foram desidratadas utilizando séries ascendentes de álcool antes de serem cobertas por uma lamela de vidro ou película; 3c. A solução de trabalho Fast Red não foi preparada de acordo com as recomendações; 4a. Remoção de reagente de fixação de pulverização incompleta (polietilenoglicol) durante a utilização de esfregaços convencionais; 2f. Aguardar 5 minutos depois de adicionar o tampão de lavagem no funil do Shandon Coverplate System e verificar que não permanece nenhum tampão de lavagem no funil que possa causar a diluição do reagente seguinte; 3a. O Fast Red é solúvel em EtOH, por isso, a utilização de hematoxilina sem álcool é obrigatório para prevenir o esbatimento do corante Fast Red (sinal Ki-67); 3b. Seguir o protocolo de montagem de 2 fases utilizando o CINtec PLUS Mount seguido da cobertura com lamela de vidro ou película permanente; Consultar o ponto 2.5 para obter recomendações; 3c. Preparar a solução de trabalho Fast Red imediatamente antes da utilização; aplicar a solução nas lâminas 15 depois da preparação, caso contrário, poderá ocorrer uma diminuição da intensidade do sinal e sensibilidade ao teste; 4a. Seguir o procedimento conforme resumido na Secção 2.1.; 4b. Lavagem de lâminas insuficiente; 4b. Utilizar solução recente e garrafas de lavagem; Para o Instrumento Autostainer, garantir que antes do processamento, o instrumento é devidamente preparado e que estão disponíveis quantidades suficientes de tampão para todo o processamento; utilizar soluções de tampões e reagentes novos; REF / PT Rev 2.2

34 4c. Secagem da amostra durante o procedimento de coloração; 4c. Quando utilizar o Instrumento Autostainer, garantir que a quantidade de reagente fornecida é suficiente e que a tampa do instrumento está fechada durante o processamento; Não expor as lâminas a temperaturas elevadas ou a um ambiente seco; Considerar se o volume de reagente programado e localização de distribuição (zona de colocação) são adequados para cobrir todas as áreas numa lâmina que contenha materiais celulares; Verificar que existe o tampão suficiente. Caso contrário, encher o recipiente com tampão e preparar a bomba; Verificar se a tubagem de plástico transparente em redor da seringa (situada no lado esquerdo do braço articulado) contém bolhas de ar - se for esse o caso, remover as bolhas poderá resolver o problema; Evitar atrasar a etapa de incubação da solução de trabalho Fast Red durante o processamento no Autostainer para minimizar o risco de secagem dos artefactos; 4d. Método de fixação inadequado; 4d. Utilizar apenas fixadores da forma aqui recomendada. Células fixadas de forma aberrante podem demonstrar coloração de fundo excessiva; 4e. Ligação não específica de reagentes com as células; 4e. Verificar o método de fixação utilizado para a amostra; 5. Coloração específica excessivament e forte 4f. Secagem das amostras durante a preparação do Instrumento Autostainer; 4g. Secagem das amostras durante a montagem do sistema Shandon Coverplate System; 4f. Manter as amostras cobertas com reagente (tampão) durante a iniciação do processamento; 4g. Encher uma taça plana com água destilada ou desionizada. Retirar uma lâmina da solução de recuperação do epítopo e montar a lâmina e o Sistema Coverplate submergido na taça (submerso); 5a. Método de fixação inadequado; 5a. Garantir fixador e método de fixação adequado; 5b. Tempos de incubação de reagente prolongados; 5b. Rever e cumprir o protocolo de coloração dado nas Secções / acima; 5c. Solução de lavagem inadequada; 5c. Utilizar o Tampão de lavagem (referência 8550); REF / PT Rev 2.2

35 6. Não foi possível efectuar a avaliação de células duplamente imunoreactivas 7. Protecção com lamela de vidro ou película não adequada 8. Padrão de coloração em placas ou esporádico depois da utilização do Shandon Coverplate System 9. Formação de rachadelas depois de montar as lâminas com o meio de montagem à base de xilol 6a. Contrastante de hematoxilina demasiado forte; 7a. Não foi possível aplicar correctamente a protecção com lamela de vidro ou película; 8a. Bolhas de ar entre a lâmina e o Sistema Coverplate; 9a. Secagem insuficiente de CINtec PLUS Mount antes de montar as lâminas com o meio de montagem à base xilol; 6a. Reduzir o tempo de incubação para a hematoxilina e/ou bluing em água da torneira ou água com amoníaco; 7a. Prevenir a formação de bolhas de ar quando aplicar o CINtec PLUS Mount (protecção aquosa); Aderir ao tempo de secagem recomendado para a protecção líquida; 8a. A montagem da lâmina e do Sistema Coverplate tem de ser realizada de acordo com o Protocolo REF EN (disponível da Roche mtm laboratories AG); As bolhas de ar na lâmina têm de ser removidas antes da montagem; 9a. Secar as lâminas que foram cobertas com CINtec PLUS Mount durante a noite à temperatura ambiente ou, pelo menos, durante 4 horas a 37 C. O CINtec PLUS Mount tem de estar completamente seco. REF / PT Rev 2.2

36 XII. Símbolos Símbolo: Explicação: Referência Código de lote Dispositivo médico de diagnóstico in vitro Fabricante Contém o suficiente para <n> testes Consultar instruções de utilização Utilizar até Limite de temperatura XIII. Fabricante Fabricado por: Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D Mannheim Germany XIV. Estado da revisão As Instruções de utilização actuais representam a versão 2.2 publicadas em Janeiro de XV. Aviso legal As marcas comerciais SuperFrost, Eukitt, Merckofix, Autostainer, SurePath, ThinPrep, Shandon Coverplate e Hologic referidas neste texto são propriedades dos respectivos detentores da marca comercial. Nenhum destes detentores de marca comercial são afiliados da Roche mtm laboratories AG. As marcas comerciais CINtec, mtm laboratories e E6H4 são propriedade exclusiva da Roche mtm laboratories AG e não podem ser utilizadas sem o consentimento prévio por escrito da Roche mtm laboratories AG. O Kit CINtec PLUS baseia-se na tecnologia exclusiva propriedade da Roche mtm laboratories AG, protegida por direitos de propriedade intelectual nacionais e internacionais incluindo a Patente Europeia EP (inc. DE, UK, FR, ES, IT), EP (inc. DE, UK, FR, ES, IT), EP , Patente dos EUA US 6,709,832, US 7,425,617, US 7,691,632 e candidaturas pendentes a patentes nos EUA US 2009/ ; bem como outras patentes nacionais. REF / PT Rev 2.2

37 Anexo 1: Referências 1. Arbyn M, Sasieni P, Meijer CLJM, et al. Clinical applications of HPV testing: a summary of meta-analyses. Vaccine 2006;24(Suppl 3):S Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, Trunk MJ, Keller T, Ridder R. Conjunctive p16 INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2010;133: Brown DC, Gatter KC. Ki-67 protein: the immaculate deception? Histopathology 2002;40: Carozzi F, Confortini M, Dalla Palma P, et al. Use of p16ink4a over-expression to increase the specificity of human papillomavirus testing: a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2008;9: Chen SF, Yang SF, Chu TY, et al. Which test is a better strategy to determine the outcome of atypical glandular cell-categorized Pap smears? Immunocytochemical p16 INK4a expression or human papillomavirus test a retrospective cohort study. Gynecol Oncol. 2005;99: Cuschieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mrna and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17: Del Pino M, Garcia S, Fusté V, et al. Value of p16 INK4a as a marker of progression/ regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol. 2009; Denton K, Bergeron C, Klement P, et al. The sensitivity and specificity of p16ink4a Cytology versus HPV Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and LSIL Pap Cytology Results. Am J Clin Pathol. 2010;134: Guo M, Hu L, Baliga M, et al. The predictive value of p16 INK4a and hybrid capture 2 human papillomavirus testing for high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2004;122: Holladay EB, Logan S, Arnold J, et al. A comparison of the clinical utility of p16 INK4a immunolocalization with the presence of human papillomavirus by hybrid capture 2 for the detection of cervical dysplasia/neoplasia. Cancer Cytopathol. 2006;108: Horn LC, Reichert A, Oster A, et al. Immunostaining for p16 INK4a used as a conjunctive tool improves interobserver agreement of the histological diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol. 2008;32: Ishikawa M, Fujii T, Saito M, et al. Overexpression of p16 INK4a as an indicator for human papillomavirus oncogenic activity in cervical squamous neoplasia. Int J Gynecol Cancer 2006;16: Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of p16 INK4a as a specific marker for dysplasia and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001;92: Klaes R, Benner A, Friedrich T, et al. p16 INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol. 2002; 26: Meyer JL, Hanlon DW, Andersen BT, et al. Evaluation of p16 INK4a expression in ThinPrep cervical specimens with the CINtec p16 INK4a assay. Cancer Cytopathol. 2007;111: Nanda K, McCrory DC, Myers ER, et al. Accuracy of the Papanicolaou test in screening for and follow-up of cervical cytologic abnormalities: a systematic review. Ann Intern Med. 2000;132: Negri G, Egarter-Vigl E, Kasal A, et al. p16 INK4a is a useful marker for the diagnosis of adenocarcinoma of the cervix uteri and its precursors: an immunohistochemical study with immuncytochemical correlations. Am J Surg Pathol. 2003; 27: REF / PT Rev 2.2

38 18. Negri G, Vittadello F, Romano F, et al. p16 INK4a expression and progression risk of lowgrade intraepithelial neoplasia of the cervix uteri. Virchows Arch. 2004;445: Nieh S, Chen SF, Chu TY, et al. Is p16 INK4a expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undertemined significance-categorized Pap smears? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies. Gynecol Oncol. 2005;97: Ordi J, Garcia S, del Pino M, et al. p16 INK4a immunostaining identifies occult CIN lesions in HPV-positive women. Int J Gynecol Pathol. 2008;28: Redman R, Rufforny I, Liu C, et al. The utility of p16 INK4a in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix. Arch Pathol Lab Med. 2008;132: Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, et al. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol ;153: Schiffman M, Solomon D. Findings to date from the ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS). Arch Pathol Lab Med Aug;127(8): Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, et al. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet 2007;370: Schlederman D, Andersen BT, Bisgaard K, et al. Are adjunctive markers useful in routine cervical cancer screening? Application of p16 INK4a and HPV-PCR on ThinPrep samples with histological follow-up. Diagn Cytopathol. 2008;36: Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 2000;182: Solomon D, Schiffman M, Tarone R. Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance: baseline results from a randomized trial. J Natl Cancer Inst. 2001;93: Solomon D, Davey D, Kurman R, et al.. The 2001 Bethesda system. Terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002;287: Szarewski A, Ambroisine L, Cadman L, et al. Comparison of predictors for high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal smears. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17: Trunk MJ, Dallenbach-Hellweg G, Ridder R, et al. Morphologic characteristics of p16 INK4a -positive cells in cervical cytology samples. Acta Cytol. 2004;48: von Knebel Doeberitz M. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur J Cancer. 2002; 38: Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16 INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13: Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, et al. Evaluation of a nuclear score for p16 INK4a stained cervical squamous cells in liquid-based cytology samples. Cancer Cytopathol. 2005;105: Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, et al. Triage of women with ASCUS and LSIL cytology. Use of qualitative assessment of p16 INK4a positive cells to identify patients with high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Cancer Cytopathol. 2007;111: Wentzensen N, von Knebel Doeberitz M. Biomarkers in cervical cancer screening. Dis Markers. 2007;23: Wright JD, Rader JS, Davila R, et al. Human papillomavirus triage for young women with atypical squamous cells of undetermined significance. Obstet Gynecol. 2006;107: Yoshida T, Fukuda T, Sano T, et al. Usefulness of liquid-based cytology specimens for the immunocytochemical study of p16 expression and human papillomavirus testing: a comparative study using simultaneously sampled histology materials. Cancer Cytopathol. 2004;102: REF / PT Rev 2.2

39 Anexo 2: Tabelas Glossários para as Tabelas e Figura 1 Mulheres no grupo etário dos xx aos xx anos: Frauen im Alter von xx xx Jahren / Femmes agées de xx-xx ans / Donne di età compresa tra xx e xx anni / Mujeres de xx-xx años Citologia de Pap: Pap-Zytologie / Frottis / Pap-test / Citología Pap ASC-US ou superior: ASC-US oder höher / ASC-US ou grade supérieur / ASC-US o superiore / ASCUS o superior Sensibilidade: Sensitivität / Sensibilité / Sensibilità / Sensibilidad Especificidade: Spezifität / Spécificité / Specificità / Especificidad IC (Intervalo de Confiança): Confidence Interval / Konfidenzintervall / Intervalle de Confiance / Intervallo di Confidenza / Intervalo de Confianza Encaminhamento para colposcopia: Überweisung zur Kolposkopie / Orientation vers une colposcopie / Richiesta di colposcopia / Derivación a colposcopia HGCIN (neoplasia intra-epitelial do colo do útero de elevado grau): High-grade cervical intraepithelial neoplasia / Hochgradige zervikale intraepitheliale Läsionen / Lésions cervicales intraépithéliales de haut grade / Lesioni intraepiteliali cervicali di alto grado accertate / Lesiones cervicales intraepiteliales de alto grado REF / PT Rev 2.2

40 Tabela 1: Ensaio PALMS: Taxas de positividade do teste CINtec PLUS na população de rastreio, em comparação com os resultados de citologia de Pap (isto é, resultado ASC-US ou superior) e os resultados do teste HC2 High-Risk HPV DNA, respectivamente. Citologia de Pap, ASC-US ou superior CINtec PLUS Positivo HR-HPV Positivo n % n % n % Mulheres no grupo etário dos 18 aos 65 anos n= Mulheres no grupo etário dos 18 aos 29 anos n= Mulheres no grupo etário dos 30 aos 65 anos n= ,2% ,4% ,7% 563 8,3% 605 8,9% ,2% 844 4,1% 857 4,2% ,5% REF / PT Rev 2.2

41 Tabela 2: Ensaio PALMS: Taxas de sensibilidade e especificidade para o CINtec PLUS na população de Rastreio. Os resultados para o teste de citologia de Pap e testehc2 High-Risk HPV DNA são apresentados para fins de comparação. Sensibilidade CIN2+ % (IC de 95%) Especificidade CIN2+ % (IC de 95%) Sensibilidade CIN3+ % (IC de 95%) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 65 anos (n= ; 205 CIN 2+, 111 CIN 3+) Citologia de Pap 66,4 (59,5-72,6) 95,4 (95,2-95,7) 71,3 (61,9-79,1) CINtec PLUS 90,1 (85,3-93,5) 95,3 (95,0-95,6) 90,4 (83,5-94,6) HR-HPV 96,4 (93,1-98,3) 90,2 (88,1-92,4) 98,9 (94,8-99,7) Mulheres no grupo etário dos 18 aos295 anos (n= 6.372; 82 CIN 2+, 41 CIN 3+) Citologia de Pap 67,7 (56,5-77,2) 92,8 (92,1-93,4) 74,4 (58,2-85,9) CINtec PLUS 93,3 (85,8-96,9) 92,3 (91,6-93,0) 93,2 (80,8-97,8) HR-HPV 97,4 (91,3-99,5) 81,4 (77,3-85,7) 97,1 (86,6-99,4) Mulheres no grupo etário dos 30 aos 65 anos (n= ; 123 CIN 2+, 70 CIN 3+) Citologia de Pap 64,9 (56,0-72,9) 96,3 (96,0-96,6) 69,1 (57,1-78,9) CINtec PLUS 87,8 (80,8-92,5) 96,3 (96,0-96,6) 88,5 (78,7-94,1) HR-HPV 95,6 (89,0-98,3) 93,1 (92,7-93,5) 100 (94,9-100) REF / PT Rev 2.2

42 Tabela 3: Estudo Wolfsburg: Taxas de sensibilidade e especificidade para o CINtec PLUS na população de Rastreio de mulheres com 30 ou mais anos. Os resultados para o teste de citologia de Pap e teste HC2 High-Risk HPV DNA são apresentados para fins de comparação. CIN2+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN2+ Especificidade % (IC de 95) CIN3+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN3+ Especificidade % (IC de 95) Mulheres com 30 ou mais anos (n=4.246; 40 CIN2+, 28 CIN3+) Citologia Pap de 65,0 (48,3-79,4) CINtec PLUS 92,5 (79,6-98,4) HR-HPV 100 (91,2-100) 98,7 (98,3-99,0) 97,5 (97,0-97,9) 94,1 (93,3-94,8) 67,9 (47,6-84,1) 100 (87,7-100) 100 (87,7-100) 98,5 (98,1-98,9) 97,3 (96,7-97,7) 93,8 (93,0-94,5) REF / PT Rev 2.2

43 Tabela 4: Ensaio PALMS: Taxas de positividade (taxa de encaminhamento para colposcopia), sensibilidade e especificidade do teste para o CINtec PLUS na triagem dos resultados de citologia de Pap ASC-US. Os resultados para o teste de HC2 High-Risk HPV DNA são apresentados para fins de comparação. Encaminham ento para colposcopia % (n) CIN2+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN2+ Especificidade % (IC de 95) CIN3+ Sensibilidade % (IC de 95%) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 65 anos, ASC-US (n=575; 18 CIN 2+, 14 CIN 3+) CINtec PLUS 25,6 (147) 94,6 (70,2-99,2) 77,5 (73,7-80,9) 100 (76,8-100) HR-HPV 41,9 (241) 100 (81,5-100) 60,7 (56,5-64,7) 100 (76,8-100) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 29 anos, ASC-US (n=219; 10 CIN 2+, 8 CIN 3+) CINtec PLUS 32,0 (70) 100 (69,2-100) 73,0 (66,2-78,8) 100 (63,1-100) HR-HPV 57,5 (126) 100 (69,2-100) 45,5 (38,8-52,5) 100 (63,1-100) Mulheres no grupo etário dos 30 aos 65 anos, ASC-US (n=356; 8 CIN 2+, 6 CIN 3+) CINtec PLUS 21,6 (77) 87,2 (45,7-98,2) 80,3 (75,6-84,2) 100 (54,1-100) HR-HPV 32,3 (115) 100 (63,1-100) 69,7 (64,6-74,3) 100 (54,1-100) REF / PT Rev 2.2

44 Tabela 5: Ensaio EEMAPS: Taxas de positividade (taxa de encaminhamento para colposcopia), sensibilidade e especificidade do teste para o CINtec PLUS na triagem dos resultados de citologia de Pap ASC-US. Os resultados para o teste de HC2 High-Risk HPV DNA são apresentados para fins de comparação. Encaminham ento para colposcopia % CIN2+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN2+ Especificidade % (IC de 95) CIN3+ Sensibilidade % (IC de 95%) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 65 anos, citologia de Pap ASC-US (n= 361; 77 CIN2+, 51CIN3+) CINtec PLUS 34,8 92,2 (83,8-97,1) HR-HPV 69,6 90,9 (82,2-96,3) 80,6 (75,6-85,1) 36,3 (30,7-42,2) 92,2 (81,1-97,8) 90,2 (78,6-96,7) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 29 anos, citologia de Pap ASC-US (n= 136; 31 CIN2+, 20 CIN3+) CINtec PLUS 43,1 96,8 (83,3-99,9) HR-HPV 81,8 100 (88,8-100) 72,4 (62,8-80,7) 23,8 (16,0-33,1) 100 (83,2-100) 100 (83,2-100) Mulheres no grupo etário dos 30 aos 65 anos, citologia de Pap ASC-US (n= 225; 46 CIN2+, 31 CIN3+) CINtec PLUS 29,8 89,1 (76,4-96,4) HR-HPV 62,2 84,8 (71,1-93,7) 85,5 (79,4-90,3) 43,6 (36,2-51,2) 87,1 (70,2-96,4) 83,9 (66,3-94,5) REF / PT Rev 2.2

45 Tabela 6: Ensaio PALMS: Taxas de positividade (taxa de encaminhamento para colposcopia), sensibilidade e especificidade do teste para o CINtec PLUS na triagem dos resultados de citologia de Pap LSIL Os resultados para o teste de HC2 High-Risk HPV DNA são apresentados para fins de comparação. Encaminham ento para colposcopia % (n) CIN2+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN2+ Especificidade % (IC de 95) CIN3+ Sensibilidade % (IC de 95%) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 65 anos, LSIL (n= 529; 63 CIN 2+, 25 CIN 3+) CINtec PLUS 52,4 (277) 85,4 (74,5-92,2) 53,9 (49,1-58,6) 88,0 (68,7-96,0) HR-HPV 83,9 (444) 98,1 (87,9-99,7) 18,8 (15,4-22,7) 100 (86,3-100) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 29 anos, LSIL (n= 250; 26 CIN 2+, 8 CIN 3+) CINtec PLUS 54,8 (137) 84,2 (65,1-93,9) 50,5 (43,6-57,3) 87,9 (47,4-98,3) HR-HPV 88,0 (220) 95,3 (73,7-99,3) 13,3 (9,3-18,7) 100 (63,1-100) Mulheres no grupo etário dos 30 aos 65 anos, LSIL (n= 279; 37 CIN2+, 17 CIN3+) CINtec PLUS 50,2 (140) 86,0 (70,7-94,0) 56,9 (50,2-63,3) 87,8 (62,4-96,9) HR-HPV 80,3 (224) 100 (90,5-100) 23,6 (18,5-29,5) 100 (80,5-100) REF / PT Rev 2.2

46 Tabela 7: Ensaio EEMAPS: Taxas de positividade (taxa de encaminhamento para colposcopia), sensibilidade e especificidade do teste para o CINtec PLUS na triagem dos resultados de citologia de Pap LSIL Os resultados para o teste de HC2 High-Risk HPV DNA são apresentados para fins de comparação. Encaminham ento para colposcopia % CIN2+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN2+ Especificidade % (IC de 95) CIN3+ Sensibilidade % (IC de 95%) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 65 anos, citologia de Pap LSIL (n=415; 137 CIN2+, 72 CIN3+) CINtec PLUS 52,3 94,2 (88,8-97,4) HR-HPV 86,2 96,4 (91,7-98,8) 68,0 (62,2-73,4) 19,1 (14,6-24,2) 95,8 (88,3-99,1) 95,8 (88,3-99,1) Mulheres no grupo etário dos 18 aos 29 anos, citologia de Pap LSIL (n=142; 55 CIN2+, 32 CIN3+) CINtec PLUS 60,6 96,4 (87,5-99,6) HR-HPV 87,3 94,5 (84,9-98,9) 62,1 (51,0-72,3) 17,2 (10,0-26,8) 96,9 (83,8-99,9) 93,8 (79,2-99,2) Mulheres no grupo etário dos 30 aos 65 anos, citologia de Pap LSIL (n=273; 82 CIN2+, 40 CIN3+) CINtec PLUS 48,4 92,7 (84,8-97,3) HR-HPV 85,3 97,6 (91,5-99,7) 70,7 (63,7-77,0) 19,9 (14,5-26,3) 95,0 (83,1-99,4) 97,5 (86,8-99,9) REF / PT Rev 2.2

47 Figura 1: Estudo Wolfsburg: Fluxograma que apresenta a distribuição dos casos de CIN2+ com confirmação através de biópsia em mulheres com 30 e mais anos e com resultados do teste Pap negativos e de HPV positivos, nos grupos de resultados positivos vs. negativos do CINtec PLUS, respectivamente. 25,5% 74,5% 68,8% 31,2% 99,1% 0,9% REF / PT Rev 2.2

48 Tabela 8: Estudo Wolfsburg: Taxas de sensibilidade e especificidade (para CIN2+ confirmado através de biópsia) do CINtec PLUS na triagem de resultados de testes de Pap negativos e de HPV positivos. Os números baseiam-se na avaliação de 147 casos com biópsias colposcópicas obtidas durante um período de acompanhamento médio de 12,5 meses. CIN2+ Sensibilidad e % (IC de 95%) CIN2+ Especificidade % (IC de 95) CIN3+ Sensibilidade % (IC de 95%) CIN3+ Especificidade % (IC de 95) Mulheres com 30 ou mais anos, com citologia de Pap normal e testes de HPV positivos (n=147,37 CIN2+, 28 CIN3+) CINtec PLUS 91,9 (78,1-98,3) 84,5 (76,4-90,7) 96,4 (81,7-99,9) 79,8 (71,5-86,6) REF / PT Rev 2.2