ADVANCE TM HRP. Referência K4069. Pronto para utilizar. Finalidade. Para utilização em diagnóstico In Vitro.

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1 ADVANCE TM HRP Referência K4067 Referência K4068 Referência K4069 Pronto para utilizar 500 ml 110 ml 11 ml Finalidade Para utilização em diagnóstico In Vitro. Este sistema destina-se à utilização com anticorpos primários de ratinho ou coelho, fornecidos pelo utilizador para a identificação qualitativa de antigénios por microscopia óptica de tecidos normais e patológicos fixados em formol e impregnados em parafina. É fornecida abaixo uma lista de produtos recomendados disponíveis na Dako para uma utilização óptima do ADVANCE TM HRP. quanto a: (1) Princípio de procedimento, (2) Materiais necessários, mas não fornecidos, (3) Conservação, (4) Preparação das amostras, (5) Procedimento de coloração, (6) Controlo de qualidade, (7) Resolução de problemas, (8) Interpretação da coloração, (9) Limitações gerais. Sumário e explicação Princípio do procedimento Reagentes fornecidos O sistema de detecção ADVANCE HRP é uma técnica de coloração IHC extremamente sensível. Este sistema é útil para a detecção de antigénios presentes em baixas concentrações. Este sistema não contém biotina, e elimina ou reduz significativamente a coloração não específica resultante da actividade da avidina-biotina endógena no fígado, rim, tecidos linfóides e secções de criostato. Todos os reagentes no sistema ADVANCE HRP estão prontos a utilizar. Este sistema é um método extremamente sensível e, como resultado, as diluições óptimas do anticorpo primário podem ser várias vezes superiores às utilizadas para os métodos EnVision, ABC ou LSAB tradicionais. 1-5 Qualquer actividade da peroxidase endógena é extinguida incubando a amostra com um reagente bloqueador da peroxidase endógena adequado. A amostra é então incubada com um anticorpo primário de ratinho ou coelho devidamente caracterizado e diluído, seguida de incubação sequencial de 30 minutos com ADVANCE HRP Link e ADVANCE HRP Enzyme. A coloração fica completa com uma incubação de 5 30 minutos com um substrato-cromogénio adequado. ADVANCE TM HRP Link Este reagente contém anticorpos secundários anti-ratinho e anti-coelho num tampão Tris-HCl contendo proteína estabilizadora e um agente anti-microbiano. Enzima ADVANCE TM HRP Este reagente contém anticorpos polimerizados com peroxidase de rábano num tampão Tris-HCl contendo proteína estabilizadora e um agente anti-microbiano. Os reagentes no sistema de detecção ADVANCE HRP são bastante indicados para procedimentos imunohistoquímicos. Os reagentes são fornecidos prontos para utilizar. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos. Materiais necessários, mas não fornecidos Toalhetes absorventes Tecido de controlo, positivo e negativo Contrastante; de base aquosa, como por exemplo Automation Hematoxylin (referência S3301), Hematoxylin for IHC (referência S3302) e Mayer s Hematoxylin ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (referência S3309) Lamelas Água destilada Etanol, absoluto e a 95% Microscópio óptico (20x 800x) Meios de montagem, como por exemplo Glycergel Mounting Medium (referência C0563) ou Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (referência S3025) ou meios de montagem não aquosos permanentes, Ultramount (referência S1964) Anticorpos primários e reagentes de controlo negativo Lâminas, revestidas com poli-l-lisina ou Silanized Slides (referência S3003) Tinas ou banhos de coloração Cronómetro (com intervalos de 3 a 40 minutos) Frascos de lavagem Solução tampão de lavagem Xilol, tolueno ou substitutos de xilol Materiais necessários opcionais, mas não fornecidos Hidróxido de amónio, 15 mol/l, diluído para 0,037 mol/l PAP Pen (referência S2002) ( ) PT_002 p. 1/5

2 Produtos Dako recomendados Referência Dako Nome do Produto Tipo de Produto S3800 Autostainer Plus Instrumento S2001 S2003 Peroxidase Block Dual Endogenous Enzyme Block Bloqueio de peroxidase Bloqueio de peroxidase endógena S3006 K3461/K3469 K3467/K3468 S3301 S3302 S3309 Wash Buffer 10x For Automated and Manual IHC Use. AEC+ Ready-to-use Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Tampão de lavagem Sistema substrato Contrastante Precauções Conservação 1. Para utilizadores profissionais. 2. Não utilizar reagentes fora de prazo de validade para o método de conservação recomendado. Caso os reagentes sejam conservados noutras condições além das que se encontram especificadas no folheto informativo, o utilizador deve validar tais condições. 3. Não substituir reagentes de outros números de lote ou kits de outros fornecedores. 4. As enzimas ou os substrato-cromogénios podem ser afectados negativamente se expostos a níveis de luz excessivos. Não conservar os componentes do sistema nem efectuar a coloração sob luz intensa como, por exemplo, luz solar directa. 5. Tempos ou temperaturas de incubação diferentes dos especificados podem provocar resultados erróneos; qualquer uma destas alterações tem que ser validada pelo utilizador. 6. Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados. 7. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 8. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações federais, estatais e locais. Conservar entre 2 e 8 ºC. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade destes produtos. Por isso, devem testar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras de paciente. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o kit, contactar a Assistência Técnica da Dako. Preparação dos reagentes É conveniente preparar os seguintes reagentes antes da coloração. Solução tampão de lavagem TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (referência S3006) é o tampão de lavagem recomendado para a detecção de IHC automática e manual. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (referência S1968) e PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (referência S3024) são igualmente indicados como soluções tampão de lavagem para coloração manual. Soluções tampão de lavagem contendo azida de sódio não são recomendadas. A azida de sódio irá inactivar a peroxidase (HRP) resultando em coloração negativa. Conservar o tampão não utilizado a 2 8 ºC. Rejeitar o tampão se tiver uma aparência turva. Pode ser utilizada água destilada para lavar o bloqueador de peroxidase, o substrato e o contrastante. Anticorpo primário O utilizador final necessita da optimização de anticorpos concentrados. As diluições devem ser preparadas usando Antibody Diluent (referência S0809), ou um diluente contendo tampão Tris-HCI 0,05 mol/l com 1% de albumina de soro bovino (BSA). Para a maioria de anticorpos primários utilizados com este sistema, um tempo de incubação de 30 minutos é suficiente. Reagente de controlo negativo O ideal é o reagente de controlo conter um anticorpo que não exiba nenhuma reactividade específica com tecidos humanos ou soro normal/não-imune na mesma matriz/solução que o anticorpo primário diluído. O reagente de controlo negativo deve ser da mesma subclasse e espécie animal que o anticorpo primário, diluído na mesma concentração de imunoglobulina ou proteína que o anticorpo primário diluído e usando o mesmo diluente. O período de incubação do reagente de controlo negativo deve corresponder ao do anticorpo primário. ( ) PT_002 p. 2/5

3 Contrastante O cromogénio DAB produz um produto final insolúvel em álcool e pode ser utilizado com hematoxilina à base de álcool. Quando é utilizado substrato-cromogénio AEC, o produto final colorido da reacção de coloração é solúvel em álcool e apenas deve ser utilizado com contrastantes de base aquosa, como por exemplo Automation Hematoxylin (referência S3301), Hematoxylin for IHC (referência S3302), Mayer s Hematoxylin ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (referência S3309). A seguir à contrastação da hematoxilina, lavar com água destilada, depois imergir as lâminas de tecido num banho de amónia 0,037 mol/l ou num agente de coloração azul similar. A solução aquosa de amónia 0,037 mol/l é preparada misturando 2,5 ml de hidróxido de amónio, 15 mol/l (concentrado), com 1 litro de água. A solução aquosa de amónia 0,037 mol/l não utilizada pode ser conservada à temperatura ambiente (20 25 ºC), num frasco bem fechado, durante um período máximo de 12 meses. Consultar as orientações do fabricante para obter informação sobre os procedimentos de contrastação alternativos. Meios de montagem Glycergel Mounting Medium (referência C0563) ou Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (referência S3025) é o meio recomendado para montagem aquosa. O Glycergel tem que ser aquecido até pelo menos 50 C, mesmo antes da utilização. Também pode ser utilizado o meio de montagem permanente não aquoso Ultramount (referência S1964). Preparação das amostras Características de desempenho Procedimento de coloração Para utilização em secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina, assim como em secções de tecido congelado e esfregaços de células. Antes da coloração IHC, os tecidos deverão ser fixados e processados. A fixação evita a autólise e putrefacção dos tecidos excisados, preserva a antigenicidade, melhora o índice de refracção dos constituintes dos tecidos e aumenta a resistência dos elementos celulares ao processamento dos tecidos. O processamento dos tecidos inclui a desidratação, a remoção dos agentes desidratantes, a infiltração dos meios de impregnação, a impregnação e o seccionamento dos tecidos. Os agentes de fixação mais comuns para preparações de tecidos IHC são descritos em General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Instruções Gerais para Coloração Imuno-histoquímica ). Estas indicações servem apenas de orientação. O utilizador deverá determinar e verificar os procedimentos ideais. Os anticorpos contidos neste produto foram absorvidos em base sólida para remover anticorpos de reacção cruzada à imunoglobulina humana (Ig), mas pode ser constatada uma reacção cruzada de baixo grau à Ig de outras espécies. As Ig anti-ratinho e anti-coelho foram purificadas por afinidade numa coluna com IG de ratinho e coelho respectivamente. A actividade combinada é dirigida, tanto para os anticorpos primários do ratinho, como do coelho, e inclui ligação a ambas as IgG, todas as subclasses IgG e IgM. O HRP presente no polímero foi preparado a partir de HRP de elevada actividade específica. As moléculas não conjugadas foram removidas por cromatografia de filtração com gel. Notas do procedimento Antes da utilização, o utilizador deve ler atentamente estas instruções e familiarizar-se com todos os componentes. Os reagentes e instruções fornecidos neste sistema foram concebidos para se obter um desempenho óptimo. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação pode originar resultados erróneos. Antes da imunocoloração, todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20 25 ºC). Do mesmo modo, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Durante o procedimento de coloração, não permitir a secagem das secções de tecido. As secções de tecido secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica. Cobrir as lâminas expostas a correntes de ar. Colocar os tecidos num ambiente húmido se for utilizada uma incubação prolongada. Automatizado Programar o sistema Dako Autostainer / Autostainer Plus do seguinte modo: ETAPA 1: Seleccionar o programa automático de modelo do protocolo. ETAPA 2: Colocar os reagentes no suporte de reagentes do instrumento e encher os reservatórios de tampão de lavagem e de água desionizada. ETAPA 3: Carregar as lâminas no instrumento. ETAPA 4: Iniciar o processo. ETAPA 5: Retirar as lâminas do instrumento. Manual (Para cada etapa, consultar a lista de produtos Dako compatíveis.) ETAPA 1: BLOQUEIO DE ENZIMAS ENDÓGENAS Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas. Utilizando um tecido sem fios, limpar cuidadosamente em redor da amostra para remover qualquer resto de líquido e manter os reagentes na área determinada. Aplicar Dual Endogenous Enzyme Block ou Peroxidase Block suficiente para cobrir a amostra. Incubar 5 10 minutos para Dual Endogenous Enzyme Block ou Peroxidase Block, dependendo da concentração de enzimas endógenas no tecido testado. Lavar suavemente com água destilada ou solução tampão (não fazer incidir o fluxo directamente sobre o tecido) e colocar num banho de tampão novo. ( ) PT_002 p. 3/5

4 ETAPA 2: ANTICORPOS PRIMÁRIOS OU REAGENTES DE CONTROLO NEGATIVO Aplicar anticorpo primário com diluição óptima suficiente ou reagente de controlo negativo para cobrir a amostra. Incubar 30* (±1) minutos. Lavar suavemente com solução tampão de um frasco de lavagem (não fazer incidir o fluxo directamente sobre o tecido) e colocar num banho tampão novo durante 5 minutos. ETAPA 3: ADVANCE TM HRP Link Aplicar ADVANCE TM HRP Link suficiente para cobrir a amostra. Incubar 30* (±1) minutos. Lavar como na etapa 2. ETAPA 4: Enzima ADVANCE TM HRP Aplicar ADVANCE TM HRP Enzyme suficiente para cobrir a amostra. Incubar 30* (±1) minutos. Lavar como na etapa 2. ETAPA 5: SUBSTRATO-CROMOGÉNIO Aplicar solução de substrato-cromogénio suficiente para cobrir a amostra. Incubar 5 30 minutos (AEC+) ou 5 10 minutos (DAB+). Lavar suavemente as lâminas com água desionizada. Recolher os resíduos de solução de substrato-cromogénio DAB+ para um recipiente para materiais perigosos, para uma eliminação correcta. Colocar as lâminas lavadas no banho de água desionizada novo. ETAPA 6: CONTRASTANTE DE HEMATOXILINA (opcional) Imergir as lâminas num banho de hematoxilina. A duração da incubação depende da concentração da hematoxilina utilizada. Lavar as lâminas num banho de água destilada ou desionizada durante 2 5 minutos. * Para uma maior produtividade, recomenda-se um menor tempo de incubação, com diluição alternativa do anticorpo primário. O tempo de incubação recomendado é de 30 minutos para maior sensibilidade. Controlo de qualidade As diferenças no processamento dos tecidos e procedimentos técnicos no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade significativa nos resultados, sendo necessária a execução regular de controlos internos, para além dos seguintes procedimentos. Consultar as orientações de controlo de qualidade do College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry e as referências 6 a 8 para obter informação adicional. Consultar a ficha de especificações de cada anticorpo primário utilizado, para obter pormenores sobre a sensibilidade e a imunoreactividade. para obter mais informações sobre controlos positivos e negativos. Interpretação da coloração Limitações gerais para obter orientações sobre a interpretação. para obter informações sobre as limitações gerais. A utilização de agentes de fixação não tamponados, ou a exposição dos tecidos a calor excessivo (superior a 60 C) durante o processo pode resultar numa sensibi lidade de coloração reduzida. A actividade de peroxidase endógena ou de pseudoperoxidase pode ser verificada em hemoproteínas como a hemoglobina, mioglobina, citocromo e catalase, assim como em eosinófilos. 9,10 Esta actividade pode ser inibida incubando as amostras com Peroxidase Block durante 5 minutos, ou Dual Endogenous Enzyme Block durante 5 10 minutos, antes da aplicação do anticorpo primário. Esfregaços de sangue e medula óssea e tecidos congelados podem também ser tratados com este reagente. No entanto, este procedimento não elimina o pigmento vermelho-castanho das hemoproteínas. Em alternativa, pode ser utilizada uma solução de metanol-peróxido de hidrogénio. Alguns antigénios podem tornar-se desnaturados com este procedimento. Os tecidos de pessoas infectadas pelo vírus da hepatite B que contenham o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) podem exibir coloração não específica com a peroxidase de rábano. 11 Soros normais/não imunes da mesma fonte animal que os anti-soros secundários utilizados nas etapas de bloqueio podem provocar resultados falsos-negativos ou falsos-positivos devido a auto-anticorpos ou anticorpos naturais. Os reagentes fornecidos neste kit foram diluídos de forma óptima. A diluição subsequente pode originar a perda de detecção de antigénio. ( ) PT_002 p. 4/5

5 Resolução de problemas Observação Sinal demasiado intenso Fundo na orla Fundo nos testes positivos Fundo nos testes negativos Coloração não específica Sem sinal Tempo de ensaio demasiado longo Comentário ADVANCE HRP é um sistema de detecção de elevada sensibilidade, permitindo uma diluição superior de anticorpos primários. Se os anticorpos não estiverem suficientemente diluídos o sinal aparecerá demasiado intenso. Efectuar uma série de diluições do anticorpo primário e seleccionar uma diluição do plateau antes do ponto fall-off. O tecido secou. Para a coloração manual, colocar as lâminas na câmara de atmosfera húmida. Diluição subsequente dos anticorpos primários (consultar Sinal demasiado intenso acima). A concentração dos reagentes de controlo negativo deve corresponder à concentração do anticorpo primário com titragem óptima. Caso contrário, efectuar uma diluição adicional do controlo negativo. A lavagem é essencial. Se uma lavagem seguida de uma incubação de 5 minutos não for suficiente, lavar duas vezes deixando impregnar durante 5 minutos de cada vez. A sequência do ADVANCE TM HRP Link e do ADVANCE TM HRP Enzyme é essencial para a reacção ocorrer: verificar se foi utilizada a sequência correcta. O anticorpo primário estava demasiado diluído. Efectuar uma série de diluições do anticorpo para determinar a diluição correcta. O ADVANCE HRP tanto permite elevada sensibilidade como incubações mais curtas ou uma combinação das duas. Se desejar um tempo de ensaio geral menor, o anticorpo primário tem que ser mais concentrado. Bibliografia 1. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27: Warnke R and Levy R. Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies. A biotin-avidin-horseradish peroxidase method. J Histochem Cytochem 1980; 28: Petrusz P and Ordronneau P. Immunohistochemistry of pituitary hormones. Polak MT and van Noorden S, eds. Immunocytochemistry: Practical applications in pathology and biology. Bristol-Wright-PSG 1983; Guesdon JL, et al. Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms. A comparison of methods. J Histochem Cytochem 1983; 31: Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984; 2: Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: NCCLS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards). Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA Order code MM4-A. 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66: Escribo LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1990; Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 Edition 06/10 ( ) PT_002 p. 5/5