Cytology FISH Accessory Kit N.º de código K 5499

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1 Cytology FISH Accessory Kit N.º de código K ª edição Para a hibridização in situ por fluorescência (FISH) em amostras de citologia. O kit contém reagentes em quantidades suficientes para 20 testes.

2 Índice Página Utilização prevista...3 Introdução...3 Reagentes...3 Materiais fornecidos...3 Materiais necessários mas não fornecidos...3 Precauções...4 Armazenamento...4 INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO A. Preparação dos reagentes...5 A.1 Tampão de lavagem...5 A.2 Formaldeído a 3,7%...5 A.3 Tampão de adstringência...5 A.4 Série de etanol...5 B. Procedimento de coloração...5 B.1 Observações metodológicas...5 B.2 Protocolo de coloração...6 Controlo da qualidade...7 Interpretação dos resultados...7 Referências...7 Resolução de problemas...8 Apêndice 1...9

3 Utilização prevista Para utilização em diagnósticos in vitro. O kit Cytology FISH Accessory Kit foi concebido para ser utilizado na técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) em amostras de citologia. Introdução O kit é empregado num procedimento de dois dias. No primeiro dia, faz-se um pré-tratamento das amostras de citologia (fornecidas pelo utilizador), utilizando-se formaldeído a 3,7% durante 2 minutos, antes de se efectuar a desidratação com etanol. A seguir ao pré-tratamento, aplicamse sondas FISH fornecidas pelo utilizador, fechando-se as amostras com vedante de lamelas antes de se efectuar a desnaturação e hibridização overnight. No segundo dia efectua-se uma lavagem adstringente, que assegura a remoção das sondas FISH não ligadas e em ligações inespecíficas, antes de se proceder à desidratação com etanol. Por fim as amostras são montadas com Fluorescence Mounting Medium contendo uma contracorante fluorescente azul, e são cobertas com uma lamela. Os resultados são interpretados por meio de um microscópio de fluorescência equipado com um filtro apropriado (ver Apêndice 1). Reagentes Materiais fornecidos Os materiais abaixo indicados são suficientes para 20 testes (define-se um teste como sendo uma área alvo de 18 mm x 18 mm). Ampola 1 Tampão de lavagem (x 20) 500 ml, 20 x concentrado Tampão Tris/HCl. Ampola 2 Ampola 3 4.º item Tampão de adstringência (x 20) 150 ml, 20 x concentrado Tampão SSC (soro fisiológico e citrato de sódio) com detergente. Meio de montagem de fluorescência 300 µl. Meio de montagem de fluorescência pronto a ser utilizado com um contracorante azul. Vedante de lamelas 1 tubo Solução pronta a ser utilizada como vedante de lamelas amovível. NOTA: Todos os reagentes são formulados especificamente para serem utilizados com este kit. Materiais necessários mas não fornecidos Reagentes de laboratório Água destilada ou desionizada Etanol a 96% Formaldeído a 37% Equipamento de laboratório Pipetas ajustáveis

4 Termómetro de imersão parcial, calibrado (intervalo de ºC) Termómetro de superfície, calibrado (intervalo de ºC) Lamelas de cobertura (18 mm x 18 mm) Fórceps Hote Bloco térmico ou estufa de hibridização para a desnaturação (82 (±2) C) Câmara de hibridização húmida Estufa ou incubadora de hibridização ou incubadora para a hibridização overnight (45 (±2) C) Lâminas, Dako Silanized Slides, n.º de código S 3003, lâminas revestidas com poli-l-lisina ou lâminas superfrost. Frascos ou banhos de coloração Temporizador (capaz de medir intervalos de 2 a 15 minutos) Tanque de imersão com tampa (capaz de manter uma temperatura de 65 (±2) C a 99 C) Equipamento e acessórios para o microscópio Filtros para microscópio de fluorescência: filtro DAPI e filtros próprios para o fluorocromo utilizado, p. ex. o filtro duplo FITC/Texas Red, ou filtros simples FITC e Texas Red para as sondas FISH da Dako o Apêndice 1 contém mais detalhes Recomenda-se um microscópio de fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts para as sondas FISH da Dako Suporte de lâminas de microscópio (tabuleiro de cartão para 20 lâminas com tampa articulada ou dispositivo semelhante) Precauções 1. Para utilizadores profissionais. 2. Frasco 1, Wash Buffer (20x), contém 10-<25% cloreto de sódio e 10-<20% trometamol. Frasco 1 está rotulado como: Perigo H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Provoca irritação ocular grave. Provoca irritação cutânea. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: Lavar com sabonete e água abundantes. Retirar a roupa contaminada. Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar. Em caso de irritação cutânea: consulte um médico. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retireas, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. Caso a irritação ocular persista: consulte um médico. 3. Frasco 2, Stringent Wash Buffer (20x), contém?10-<25% Cloreto de sódio e?10-<20% 2- amino-2-(hidroximetil) propano-1, 3-diol, cloridrato. Frasco 2 está rotulado como: Perigo H319 Provoca irritação ocular grave. H315 Provoca irritação cutânea. P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial.

5 P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: Lavar com sabonete e água abundantes. Retirar a roupa contaminada. Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar. Em caso de irritação cutânea: consulte um médico. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retireas, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. Caso a irritação ocular persista: consulte um médico. 4. Item 4, Coverslip Sealant, contém 100% nafta (petróleo), leve tratada com hidrogénio e está rotulado como: Perigo H225 H304 H411 P280 P210 P241 P242 P243 P233 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P405 P403 P235 P501 Líquido e vapor facilmente inflamáveis. Pode ser mortal por ingestão e penetração nas vias respiratórias. Tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Manter afastado do calor, superfícies quentes, faísca, chama aberta e outras fontes de ignição. Não fumar. Utilizar equipamento eléctrico, de ventilação, de iluminação e de manuseamento de material à prova de explosão. Utilizar apenas ferramentas antichispa. Evitar acumulação de cargas electrostáticas. Manter o recipiente bem fechado. Evitar a libertação para o ambiente. EM CASO DE INGESTÃO: Contactar imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. NÃO provocar o vómito. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): Retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche. Armazenar em local fechado à chave. Armazenar em local bem ventilado. Conservar em ambiente fresco. Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 5. Os períodos e temperaturas de incubação e os métodos diferentes dos que foram especificados poderão dar resultados incorrectos. 6. Os reagentes foram diluídos a níveis óptimos. Qualquer diluição adicional poderá resultar num desempenho reduzido. Armazenamento Ampola 1, Tampão de lavagem, armazenar a 2-8 C. Ampola 2, Tampão de adstringência, armazenar a 2-8 C. Ampola 3, Meio de montagem de fluorescência, armazenar em local escuro a 2-8º C. Item n.º 4, Vedante de lamelas, armazenar a 2-8º C. O meio de montagem de fluorescência (ampola 3) pode sofrer efeitos adversos caso seja exposto a níveis de luz excessivos. Não armazenar estes componentes nem realizar a análise a uma luz forte como, por exemplo, a luz solar directa. Não utilizar o kit após o fim do prazo de validade inscrito na caixa do kit. Caso os reagentes sejam armazenados noutras condições para além das especificadas no suplemento desta embalagem, o utilizador deve validar o desempenho dos reagentes (1).

6 Não há sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Portanto convém avaliar células normais da amostra analisada. Caso se observe algum padrão de fluorescência inesperado, que não se possa explicar por variações dos procedimentos de laboratório, e se suspeite de um problema no kit Cytology FISH Accessory Kit, contactar com o nosso Centro de Assistência Técnica. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO A. Preparação dos reagentes Convém preparar os seguintes reagentes antes de iniciar a coloração: A.1 Tampão de lavagem Diluir uma quantidade suficiente da Ampola 1 (Tampão de lavagem x 20), diluindo para tal o concentrado a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão por diluir e por utilizar pode ser armazenado a 2-8º C durante um mês. Descartar o tampão diluído caso tenha um aspecto turvo. A.2 Formaldeído a 3,7% Preparar uma quantidade suficiente de formaldeído a 3,7%, diluindo para tal formaldeído a 37%, numa proporção de 1:10, em tampão de lavagem diluído (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, na Secção A.1). Armazenar os frascos tapados à temperatura ambiente, e utilizá-los para um máximo de 100 lamelas. Descartar a solução diluída caso tenha um aspecto turvo. A.3 Série de etanol Preparar, a partir de uma solução de etanol a 96%, 3 frascos com etanol a 70%, 85% e 96%, respectivamente. Armazenar os frascos tapados à temperatura ambiente ou a 2-8 ºC, e utilizálos para um máximo de 200 lamelas. Descartar as soluções caso tenham um aspecto turvo. A.4 Tampão de adstringência Diluir uma quantidade suficiente da Ampola 2 (Tampão de adstringência x 20), diluindo para tal o concentrado a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão diluído e por utilizar pode ser armazenado a 2-8 ºC durante um mês. Descartar o tampão diluído caso tenha um aspecto turvo. B. Procedimento de coloração B.1 Observações metodológicas O utilizador deve ler atentamente estas instruções e familiarizar-se com todos os componentes antes de utilizar o kit (consultar a secção Precauções). Equilibrar todos os reagentes à temperatura indicada antes de os utilizar. Ampola 1: O tampão de lavagem diluído deve ser equilibrado à temperatura ambiente, a ºC. Ampola 2: Um frasco do tampão de adstringência diluído deve ser equilibrado à temperatura ambiente, outro a 65 (±2) ºC, antes de serem utilizados. Ampola 3: O meio de montagem de fluorescência pode ser aplicado a qualquer temperatura, de 2 a 25 ºC. 4.º item: O vedante de lamelas pode ser aplicado à temperatura ambiente. Todas as etapas devem ser efectuadas às temperaturas indicadas. O procedimento inclui uma série de processos de desidratação, seguindo-se a secagem das amostras. Assegurar que as amostras se encontram completamente secas antes de avançar para a etapa seguinte. Não permitir que as amostras sequem durante as outras etapas do procedimento. B.2 Protocolo de coloração 1.º DIA

7 1.ª Etapa: Preparação das lâminas Equilibrar a lâmina com a amostra de citologia à temperatura ambiente. Incubar em formaldeído a 3,7% (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2) durante 2 minutos à temperatura ambiente. Remover as lâminas do formaldeído a 3,7% e mergulhar no tampão de lavagem diluído (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, secção A.1) durante 5 minutos à temperatura ambiente. Substituir o tampão de lavagem diluído e mergulhar novamente as lâminas durante 5 minutos adicionais. Desidratar as lâminas com amostras de citologia, fazendo-as passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96% (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3). Permitir que as lâminas sequem por completo ao ar. 2.ª Etapa: Sonda FISH (fornecida pelo utilizador) A etapa seguinte deve ser efectuada num hote. Aplicar uma quantidade apropriada de uma sonda marcada com fluorocromo, p. ex. 10 µl de uma sonda FISH da Dako, na parte central da amostra. Colocar imediatamente uma lamela de vidro de 18 mm x 18 mm sobre a sonda e deixar alastrar uniformemente por baixo da lamela. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso tal aconteça, dar ligeiras pancadas com um fórceps, para as remover. Vedar a lamela com vedante de lamela, aplicando para tal o vedante em torno da periferia da lamela. Permitir que o vedante de lamela se sobreponha à lâmina e à lamela, formando assim uma camada vedante em torno da lamela. Certificar-se de que o vedante de lamela cobre toda a orla da lamela. Colocar as lâminas numa superfície plana de metal ou pedra (p. ex. um bloco térmico ou um bloco dentro de uma estufa de hibridização) pré-aquecida a 82 (±2) C. Desnaturar durante 5 minutos, assegurando que a temperatura do bloco nunca desce abaixo dos 80 ºC. Colocar as lâminas numa câmara de hibridização humedecida e pré-aquecida. Cobrir a câmara com uma tampa e incubar overnight (14 a 20 horas) a 45 (±2) C quando se utilizarem as sondas FISH da Dako. Podem utilizar-se, para a desnaturação e hibridização, instrumentos que permitam o estabelecimento de condições semelhantes às que foram descritas acima, tais como o DakoCytomaton Hybridizer (nºs de código S 2450 e S 2451). 2.º DIA 3.ª Etapa: Lavagem adstringente Encher dois frascos de coloração, tais como frascos de Coplin, com o tampão de lavagem adstringente, diluído (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.4). Para 1-6 lâminas num frasco, é necessário um volume mínimo de 100 ml de tampão de adstringência diluído. Para mais de 6 lâminas, utilizar pelo menos 15 ml de tampão por cada lâmina. Colocar um dos frascos de coloração contendo o tampão de adstringência diluído, à temperatura ambiente, num hote, e o outro num tanque de imersão. Aquecer o tanque de imersão e o tampão de adstringência diluído até à temperatura de 65 (±2) C. Assegurar a estabilização da temperatura. Cobrir o frasco com uma tampa, a fim de estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. Medir a temperatura dentro do tanque de imersão com um termómetro calibrado, para assegurar a presença da temperatura correcta. Empregando fórceps ou luvas, retirar as lâminas da câmara de hibridização e remover cuidadosamente o vedante de lamelas, bem como as próprias lamelas, colocando as lâminas, uma de cada vez, dentro do frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente. Logo que todas as lamelas tenham sido removidas, transferir as lâminas do frasco de prélavagem à temperatura ambiente para o frasco de lavagem a 65 (±2) C, no tanque de imersão. Executar a lavagem adstringente durante exactamente 10 minutos a 65 (±2) C. Retirar as lâminas do tampão de adstringência diluído e mergulhar as secções em tampão de lavagem diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20-25 ºC).

8 Mudar o tampão de lavagem diluído e mergulhar nele as secções durante 3 minutos adicionais. Desidratar as lâminas, fazendo-as passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96% (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3). Permitir que as lâminas sequem por completo ao ar. 4.ª Etapa: Montagem Aplicar 15 µl de meio de montagem de fluorescência, contendo um contracorante de fluorescência azul (Ampola 3) na área alvo da lâmina, e aplicar uma lamela de vidro. NOTA: As lâminas podem ser interpretadas passados 15 minutos, ou dentro de 7 dias após a execução da montagem. Contudo, se as lâminas ficarem expostas à luz ou a temperaturas elevadas, dar-se-á o esbatimento da amostra. Para minimizar esta ocorrência, armazenar as lâminas em local escuro, a 2-8 ºC. Controlo da qualidade 1. Os sinais devem ser brilhantes, distintos e fáceis de interpretar. 2. As células normais permitem efectuar um controlo interno do ensaio de coloração. 3. As células normais devem ter ainda sinais de fluorescência nitidamente visíveis, o que indica que as sondas FISH se hibridizaram efectivamente às regiões alvo. 4. Caso não se detectem sinais nas células normais, o ensaio falhou e os resultados devem ser considerados inválidos. 5. A morfologia nuclear deve estar intacta quando for avaliada com um filtro DAPI. A presença de numerosas células tipo fantasma e de uma morfologia nuclear de uma maneira geral de má qualidade indica a desnaturação excessiva da amostra, resultando na perda ou fragmentação dos sinais. As amostras desse tipo devem ser consideradas inválidas. Interpretação dos resultados Analisar várias áreas de células tumorais, a fim de dar conta da possibilidade de heterogeneidade. Seleccionar uma área que apresente uma boa distribuição de núcleos. Iniciar a análise no quadrante superior esquerdo da área seleccionada e, examinando-a da esquerda para a direita, contar o número de sinais que se encontrem dentro dos limites de cada um dos núcleos avaliados, de acordo com as orientações fornecidas a seguir. Aumentar e diminuir a focagem para encontrar todos os sinais presentes dentro de cada um dos núcleos. Contar dois sinais que sejam do mesmo tamanho e se encontrem separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal como sendo apenas um sinal. Não incluir na contagem núcleos que não tenham sinais. O número de núcleos que devem ser contados para cada sonda deve ser determinado pelo utilizador. Referências 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR 7163, February 28, Resolução de problemas Problema Causa provável Acção sugerida

9 Problema Causa provável Acção sugerida 1. Ausência de sinais ou sinais fracos 1a. O microscópio não funciona devidamente - Aparelho de filtro inapropriado - Lâmpada inapropriada - Lâmpada de mercúrio demasiado velha - Lente do colector suja e/ou rachada - Óleo de imersão inadequado 1b. Sinais esbatidos 1c. Evaporação da sonda durante a hibridização 1d. Condições de desnaturação incorrectas 1e. Condições da lavagem de adstringência incorrectas 1a. Examinar o microscópio e verificar se os filtros utilizados são próprios para usar com os fluorocromos, e se a lâmpada de mercúrio é correcta e se não está a ser utilizada para além do seu prazo de validade (ver Apêndice 1). Em caso de dúvida, contactar o vendedor do microscópio. 1b. Evitar o exame microscópio prolongado e minimizar a exposição a fontes luminosas fortes. 1c. Certificar-se de que a câmara de hibridização contém suficiente humidade 1d. Verificar se a temperatura da desnaturação é de 82 (±2) C 1e. Assegurar a utilização da temperatura e período de tempo correctos para a lavagem adstringente, bem como a remoção das lamelas antes de efectuar a lavagem adstringente 2. Áreas sem sinais 2a. Volume da sonda demasiado reduzido 3. Coloração de fundo excessiva 4. Morfologia dos núcleos de má qualidade ou fraca coloração dos núcleos 2b. Bolhas de ar presas durante a aplicação ou montagem da sonda 3a. Temperatura da lavagem de adstringência demasiado baixa 3b. Exposição prolongada da secção hibridizada à luz forte 4a. Temperatura da desnaturação demasiado elevada 2a. Certificar-se de que o volume da sonda é suficiente para cobrir a área por baixo da lamela 2b. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso tal aconteça, dar ligeiras pancadas com um fórceps 3a. Verificar se a temperatura da lavagem adstringente é de 65 (±2) C 3b. Evitar utilizar o microscópio durante longos períodos e minimizar a exposição a fontes luminosas fortes 4a. Verificar se a temperatura da desnaturação é de 82 (±2) C NOTA: Caso o problema não possa ser atribuído a nenhuma das causas acima descritas, ou a acção correctiva sugerida não tenha resolvido o problema, telefonar para o Centro de Assistência Técnica da Dako para receber mais assistência.

10 Apêndice 1 Cytology FISH Accessory Kit, n.º de código K 5499 Especificações sobre o microscópio de fluorescência A Dako recomenda que se utilize o seguinte equipamento com o Cytology FISH Accessory Kit, quando se utilizarem as sondas FISH da Dako: 1. Tipo de microscópio Microscópio de epifluorescência. 2. Lâmpada Lâmpada de mercúrio de 100 watts (manter um registo sobre o tempo de iluminação). 3. Objectivos Para a análise do tecido, devem aplicar-se objectivas de fluorescência a seco de 10X ou fluorescência de imersão em óleo de 16X. Para a ampliação a alta potência e registo de sinais, recomendam-se apenas objectivas de fluorescência de imersão em óleo, p. ex. 100X. 4. Filtros Os filtros são individualmente concebidos para fluorocromos específicos e devem ser seleccionados conformemente. A Dako recomenda a utilização de um filtro DAPI específico, em combinação com um filtro duplo Texas Red/FITC de alta qualidade sempre que se utilizem sondas de ADN FISH da Dako. Filtro DAPI, p. ex. o filtro Chroma n.º Filtro duplo Texas Red/FITC, p. ex. o filtro Chroma n.º Podem utilizar-se filtros simples Texas Red e FITC, para se fazer a confirmação. Fluorocromo Comprimento de onda de excitação Comprimento de onda de emissão FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Os filtros são concebidos especificamente para cada tipo de microscópio, e a utilização de filtros apropriados é essencial para se fazer a interpretação. Caso deseje obter informações detalhadas, deverá contactar o fornecedor do seu microscópio ou o seu representante da Dako. 5. Óleo Óleo não fluorescente. Precauções Certos fluorocromos específicos necessitam de equipamento diferente e devem ser seleccionados de modo adequado. Para as sondas FISH da Dako não se recomenda a utilização de uma lâmpada de mercúrio de 50 watts, não se podem utilizar filtros de rodamina e não se recomenda a utilização de filtros triplos. Os microscópios não optimizados podem causar problemas durante a leitura de sinais fluorescentes. É importante que a fonte luminosa não tenha ultrapassado o prazo de validade, e que se encontre devidamente alinhada e focada. O cliente deve monitorizar e acompanhar as recomendações do fabricante relativamente à lâmpada de mercúrio. Deve efectuar-se a manutenção do microscópio e a lâmpada de mercúrio deve ser colocada em alinhamento antes da interpretação dos resultados. Deve fazer-se um esforço para expor a amostra ao mínimo de luz de excitação possível, a fim de minimizar o esbatimento da fluorescência.

11 Recomendamos que o cliente discuta a preparação do seu microscópio específico com o fabricante antes de iniciar o processo de hibridização de fluorescência in situ, ou que consulte a correspondente literatura. Produzido por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax Explicação dos símbolos Número de catálogo Limites de temperatura Código de lote Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Manter ao abrigo da luz solar (consultar a secção de armazenamento) Utilizar até Consultar as instruções de utilização Conteúdo suficiente para <n> ensaios Fabricante Símbolo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Símbolo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Símbolo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Símbolo GHS (consultar a secção relativa às precauções)