ESTUDO DE FEIJÕES TRANSGÊNICOS E CONVENCIONAIS ATRAVÉS DA RMN HR-MAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA ESTUDO DE FEIJÕES TRANSGÊNICOS E CONVENCIONAIS ATRAVÉS DA RMN HR-MAS RAFAEL CHOZE Orientador: Prof. Dr. Luciano Morais Lião Goiânia-GO 2011 i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA ESTUDO DE FEIJÕES TRANSGÊNICOS E CONVENCIONAIS ATRAVÉS DA RMN HR-MAS RAFAEL CHOZE Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Química. Orientador: Prof. Dr. Luciano Morais Lião Goiânia-GO 2011 ii

AGRADECIMENTOS A minha esposa Liliane, pelo enorme amor, carinho, dedicação e rigidez, obviamente quando necessário, em todos os momentos. A minha mãe, pelo amparo nos vários momentos difíceis desta caminhada. Ao meu pai, que desde que nos reencontramos minha vida mudou; para melhor. Ao Professor Luciano Morais Lião, pela valiosa orientação propiciada na realização deste trabalho e desafios saudáveis na tentativa de realizar um bom shimming. Me fez crescer! Aos colegas do laboratório de Ressonância Magnética Nuclear, especialmente ao Xurupita (Bruno), Gordinho (Ígor), Lorena e Elenilson. A Professora Glaucia pelas grandiosas orientações e divertimentos no laboratório. A Aline pelas ótimas contribuições e aprendizado na área de proteínas Aos órgãos financiadores, FUNAPE, CAPES e CNPq. Em especial a Deus pela gigantesca força. iii

SUMÁRIO LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS RESUMO ABSTRACT xiii ix xv xvii xviii 1. O feijão 1 1.1. O Feijão no Mundo 2 1.2. O Feijão no Brasil 3 1.3. Composição Química 4 1.4. Feijão: Um alimento funcional 5 1.5. Incidência de doenças no Feijão 9 1.5.1. Mosaico dourado 10 1.6. Os organismos geneticamente modificados 12 1.6.1. Os organismos geneticamente modificados no Brasil 15 1.6.2. O feijão geneticamente modificado 16 2. A Ressonância Magnética Nuclear e o Infravermelho 19 2.1. Considerações Gerais e Aplicações da HR-MAS 20 2.2. Princípios da HR-MAS 22 2.3. Infravermelho 26 3. A Quimiometria combinada com a RMN HR-MAS e com o 28 Infravermelho 3.1. Considerações Gerais 29 3.2. Análise Exploratória dos dados 30 iv

3.3. Pré- processamentos dos dados 34 3.4. Análise de Componentes Principais 36 4. Objetivos 38 5. Experimental 36 5.1. Amostras 37 5.1.1. Amostra de casa de vegetação 37 5.1.2. Amostras de campo 37 5.1.3. Preparo das amostras para HR-MAS 38 5.1.4. Preparo das amostras para IV 39 5.2. Instrumentação e aquisição dos espectros de 1 H HR-MAS 39 5.3. Aquisições dos espectros bidimensionais 40 5.4. Aquisição dos espectros na região do infravermelho 41 5.5. Tratamento dos dados espectroscópicos (Análise Quimiométrica) 41 5.5.1. Tratamento dos dados de RMN 41 5.5.2. Tratamento dos dados de IV 41 6. Resultados e Discussão 46 PARTE I - FEIJÕES CULTIVADOS EM CASA DE VEGETAÇÃO 47 6.1. Ressonância Magnética Nuclear HR-MAS 48 6.1.1. Otimização dos experimentos de RMN de 1 H HR-MAS 48 6.1.2. Estudo da aplicação da técnica de RMN 1 H HR-MAS em amostras de feijão convencional e geneticamente modificado, 53 cultivados em casa vegetação 6.1.2.1. Identificação dos flavonóides em mistura 57 6.1.3. Caracterização de metabólitos primários em mistura 63 6.1.3.1 Identificação de oligossacarídeos 63 6.1.3.2. Identificação dos aminoácidos 63 v

6.2. Análise Quimiométrica dos dados de RMN de 1 H HR-MAS 65 6.3. Estudo da aplicação da técnica de IV em amostras de feijão convencional e geneticamente modificado, cultivados em 67 casa vegetação e análise quimiométrica dos dados PARTE II FEIJÕES CULTIVADOS EM CONDIÇÃO DE CAMPO 73 6.4. Estudo da aplicação da técnica de RMN de 1 H HR-MAS em amostras de feijão convencional e geneticamente modificado, 74 cultivados em campo 6.5. Análise Quimiométrica dos dados de RMN de 1 H HR-MAS 78 PARTE III ESTUDO DA OXIDAÇÃO DOS FEIJÕES 81 TRANSGÊNICOS 6.6. Estudo da oxidação dos feijões transgênicos 82 6.6.1. Ressonância Magnética Nuclear de RMN de 1 H HR- MAS e Análise Quimiométrica 82 7. CONCLUSÕES 86 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 89 vi

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Produção do feijão no mundo 2006 a 2008. 2 Tabela 2. Importações Mundiais de feijão 2005-2007 3 Tabela 3. Principais Estados produtores de feijão - 2006/07 a 4 2009/10 Tabela 4. Principais doenças que afetam o feijoeiro 9 Tabela 5. Área Global com Cultivos Transgênicos, 1996 a 2002 13 Tabela 6. Principais países responsáveis pelo plantio biotecnológico 14 Tabela 7. Amostras de casa de vegetação cedidas pela Embrapa Arroz e Feijão Tabela 8. Dados de RMN de 1 H HR-MAS e correlações 1 H- 13 C HR- MAS observadas no experimento de ghsqc e ghmbc para a quercetina Tabela 10. Dados de RMN de 1 H HR-MAS e correlações 1 H- 13 C HR- MAS observadas no experimento de ghsqc e ghmbc para a miricetina Tabela 11. Dados de RMN de 1 H e correlações 1 H- 13 C para os dois carboidratos do Feijão Olathe 5.1 37 61 69 78 vii

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Gráfico da PCA para os cultivares de feijão Diamante Negro BRS Executivo e A195 5 Figura 2. Estrutura da genisteína 6 Figura 3. Estrutura das lignanas matairesinol e secoisolariciresinol 7 Figura 4. Estruturas de flavonóis e antocianinas identificados em Phaseolus vulgaris 7 Figura 5. Agente transmissor da doença do mosaico dourado 10 (mosca branca) Figura 6. Cultivar de feijão afetado pelo mosaico dourado 11 Figura 7. Cultivar Olathe 5.1 17 Figura 8. Figura 9. Desenvolvimento da doença do mosaico dourado na linhagem transgênica (T) em comparação com variedades não transgênicas (NT) Planta geneticamente modificada (direita), imune à doença do mosaico dourado e uma planta não modificada (esquerda) 17 18 Figura 10. Rotor inclinado ao ângulo mágico 23 Figura 11. Figura 12. Representação do rotor utilizado em análises de HR- MAS Espectros de RMN de 1 H de folhas de laranjeira no estado semi-sólido (heterogêneo) em uma sonda CPMAS e Espectros de RMN HR-MAS utilizando-se um rotor de CPMAS (80 µl), rotor de HRMAS (12 µl) e do extrato hidroalcoólico obtido em solução de D2O. 24 25 Figura 13. Esquema da seqüência utilizada na análise exploratória dos dados experimentais com a utilização 31 viii

da RMN Figura 14. Exemplo de pré-processamento de dados para 4 variáveis fictícias: (a) dados originais, (b) dados centrados na média (média igual a zero) e (c) dados autoescalados (média igual a zero e desvio padrão igual a 1). As linhas horizontais representam as médias de cada variável 32 Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Representação de um conjunto de dados mostrando a influência da normalização Cultivares transgênicos e convencionais produzidos em condições de campo em (Santo Antônio/GO), (Londrina/PR) e (Sete Lagoas/MG) Componentes do rotor utilizados em análises de HR- MAS Desenvolvimento experimental das análises de RMN HR-MAS para as amostras de feijão CV e GM cultivados em casa de vegetação Desenvolvimento experimental das análises de RMN HR-MAS para as amostras de feijão Olathe pinto CV e GM cultivados em condições de campo Desenvolvimento experimental das análises de RMN HR-MAS para as amostras de feijão Olathe Pinto GM cultivados em casa de vegetação e posterior exposição ao ambiente 32 38 39 43 44 45 Figura 21. Espectros de RMN de 1 H HR-MAS de amostras de feijão comparando a resolução espectral através da condução da amostra diretamente ao rotor e em seguida adição de 4 gotas de D2O/TMSP-d4, com ampliação da região de δ 0,0 com a resolução espectral através da condução da amostra ao 49 ix

Figura 22. Figura 23. eppendorf, adição de 4 gotas de D2O/TMSP-d4 e posterior transferência da suspensão ao rotor, com ampliação da região de δ 0,0, respectivamente Comparação dos espectros de amostras de feijão visando encontrar a quantidade de material ideal para as análises de RMN de 1 H HR-MAS, com ampliação da região de δ 0,0. Influência da temperatura na homogeneidade do campo magnético em análises de 1 H HR-MAS, em amostras de feijão, com ampliação da região de δ 0,0 a 5,4 50 51 Figura 24. Espectros de RMN de 1 H HR-MAS, de amostras de feijão, com ampliação da região de δ 0,0 a 5,4, indicando que à 303K não ocorreu variação do campo magnético Figura 25. Espectros de RMN de 1 H de feijões adquiridos na sonda HR-MAS utilizando as seqüências de pulsos CPMG modificada e ZGCPPR, com ampliação da região de δ 6,0 a 7,9 Figura 26. Espectros de RMN de 1 H HR-MAS dos genótipos Olathe Pinto e Olathe 5.1, indicando as diferenças introduzidas pela transgene na região de δ 6,0-7,9. Figura 27. Espectros de RMN de 1 H HR-MAS dos genótipos Pérola, Pérola 5.1, BRS Pontal e BRS Pontal 5.1, indicando os sinais padrão introduzidas pela transgene na região de δ 6,0-7,9. Figura 28. Espectros de RMN de 1 H HR-MAS do feijão Olathe 5.1, indicando os flavonóides presentes na região de δ 6,0-7,9. Foi utilizado o símbolo Q para o composto quercetina e M referindo-se a miricetina Figura 29. Correlações 1 H- 13 C HR-MAS observadas no experimento de ghsqc do feijão Olathe 5.1 com 52 54 55 56 58 58 x

ampliação dos sinais na região aromática do espectro. Figura 30. Correlações 1 H- 13 C HR-MAS observadas no 59 experimento de ghmbc do feijão Olathe 5.1 com ampliação dos sinais na região aromática do espectro, enfatizando as correlações do H-2 da quercetina com seus respectivos núcleos de carbono. Foi utilizado o símbolo Q para o composto quercetina e M referindose a miricetina Figura 31. Espectros do feijão Olathe 5.1 com e sem a adição do 59 padrão de quercetina, com ampliação da região de hidrogênios aromáticos e de oligossacarídeos, enfatizando as integrações da rafinose e dos hidrogênios aromáticos da quercetina Figura 32. Espectros do feijão Olathe 5.1 com e sem a adição do 60 padrão de miricetina, com ampliação da região de hidrogênios aromáticos e dos oligossacarídeos, enfatizando as integrações da rafinose e dos hidrogênios aromáticos da miricetina Figura 33. Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão Olathe 5.1, 63 evidenciando os hidrogênios anoméricos da rafinose (δ 5,42) e estaquiose + vesbascose (δ 5,44). Figura 34. Espectro de 1 H HR-MAS, enfatizando os hidrogênios 64 metílicos e metilênicos de alguns aminoácidos presentes no feijão Olathe Pinto 5.1 Figura 35. Representação dos feijões comum transgênicos e 65 convencionais na análise de PCA. Figura 36. Representação dos feijões comum transgênicos e 66 convencionais na análise de PCA, com a seleção de variáveis na região de δ6.0 a 7.9. Figura 37. Espectro de IV do feijão Olathe 5.1 67 Figura 38. Espectro de IV do feijão Pérola 5.1 68 Figura 39. Espectro de IV do feijão BRS Pontal 5.1 68 xi

Figura 40. Espectro de IV do feijão Olathe Pinto 69 Figura 41. Espectro de IV do feijão Pérola 69 Figura 42. Espectro de IV do feijão BRS Pontal 70 Figura 43. Figura 44. Figura 45a. Figura 45b. Figura 45c. Figura 46. Figura 47. Figura 48. Figura 49. Gráficos de escores PC1 versus PC2 dos dados de IV dos feijões Olathe Pinto, Pérola e BRS Pontal convencional e seus genótipos transgênicos. Gráficos de escores PC1 versus PC2 dos dados de IV dos feijões Olathe Pinto, Pérola e BRS Pontal convencional e seus genótipos transgênicos, com a seleção das regiões de impressão digital e entre 1650 e 1750 cm -1. Espectro de 1 H HR-MAS dos feijões Olathe 5.1 e Olathe Pinto cultivado no campo em Londrina Paraná (Sul). Espectro de 1 H HR-MAS dos feijões Olathe 5.1 e Olathe Pinto cultivado no campo em Santo Antônio de Goiás Goiás (Centro-Oeste). Espectro de 1 H HR-MAS dos feijões Olathe 5.1 e Olathe Pinto cultivado no campo em Sete Lagoas Minas Gerais (Sudeste). Ampliação do experimento de ghsqc, enfatizando as correlações na região de δ 4.2-5.3 Ampliação do experimento de ghmbc, enfatizando as correlações na região de δ 4.2-5.3 Representação dos feijões comum transgênicos e convencionais na análise de PCA, em condições de plantio em campo, com a seleção de todas as variáveis Representação dos feijões comum transgênicos e convencionais na análise de PCA, em condições de plantio em campo, com a seleção de variáveis na região de δ 3.0-5.2. 71 72 75 75 76 77 77 79 79 xii

Figura 50. Representação dos feijões comum transgênicos e convencionais na análise de PCA, em condições de plantio em campo, com a seleção de variáveis na região de δ6.0 a 7.9. Figura 51. Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão Olathe 5.1 passados 30 dias de exposição ao ambiente Figura 52. Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão Olathe 5.1 passados 60 dias de exposição ao ambiente Figura 53. Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão Pérola 5.1 passados 30 dias de exposição ao ambiente. Figura 54. Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão Pérola 5.1 passados 60 dias de exposição ao ambiente 80 83 83 83 84 Figura 55. Figura 56. Figura 57. Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão BRS Pontal 5.1 passados 30 dias de exposição ao ambiente Espectro de RMN de 1 H HR-MAS do feijão BRS Pontal passados 60 dias de exposição ao ambiente Representação dos feijões comum transgênicos cultivados em casa de vegetação na análise de PCA quando expostos ao ar, em dois tempos distintos: 30 dias e 60 dias, com a seleção de todas as variáveis espectrais. 84 84 85 xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS FAO CONAB SEPLAN-GO PCA BGMV DNA OGMs ISAAA CF Food and Agriculture Organization Companhia Nacional de Abastecimento Secretaria de Planejamento do Estado de Goiás Principal Component Analysis Bean Golden Mosaic Virus Deoxyribonucleic acid Organismos geneticamente modificados International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications Constituição Federal CTNBio Comissão Técnica Nacional de Biossegurança EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária RNA RISC HR-MAS RMN HSQC CV GM PC HMBC Ribonucleic acid RNA induced silencing complex High-Resolution Magic Angle Spinning Ressonância Magnética Nuclear Heteronuclear Single Quantum Coherence Convencional(is) Geneticamente Modificado(s) Principal Component Heteronuclear Multiple Bond Correlation xiv

COSY δ TMSP-d4 Hz T1 T2 CPMAS D2O CPMG CPPR UV IV Correlation Spectroscopy Deslocamento químico em partes por milhão (ppm) Sal de sódio do ácido 3-(trimetilsilil)- 3,3,2,2-tetradeuteriopropionico Hertz Relaxação longitudinal (spin-rede) Relaxação transversal (spin-spin) Cross Polarization Magic Angle Spinning Água deuterada Carr-Purcell-Meiboom-Gill Composite pulse presaturation Ultravioleta Infravermelho RMN de 1 H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio - 1 RMN de 13 C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13 m/v FID LB T Massa/volume Free Induction Decay Line Broadening Tesla xv

RESUMO Neste trabalho, propõe-se uma metodologia que permita diferenciar feijões convencionais e transgênicos, cultivados em casa de vegetaçao sob condições controladas ou em campo, baseados em modificações na composição química, utilizando RMN 1 H HR-MAS e infravermelho. Através da RMN foi possível identificar diferenças na composição química entre os feijões, segundo sua origem convencional ou transgênica, especialmente na região de hidrogênios aromáticos. Os espectros de 1 H HR-MAS, ghsqc e ghmbc conduziram às estruturas dos flavonóides quercetina e miricetina, presentes em maior concentração no feijão geneticamente modificado. Além disso, através da técnica de HR-MAS, foi possível caracterizar os aminoácidos treonina, alanina, valina, isoleucina e lisina e os oligossacarídeos estaquiose, verbascose e rafinose, em mistura. As linhagens BRS Pontal 5.1 e Pérola 5.1, derivadas de cultivares de grande aceitação comercial, BRS Pontal e Pérola, e que receberam o transgene do feijão Olathe 5.1, através de cruzamentos e retrocruzamentos, apresentaram o mesmo perfil de variação química observado para as cultivares Olathe Pinto e Olathe 5.1. Esse estudo demonstrou ainda, que as variáveis edafoclimáticas, típicas de condições de plantio no campo, não tiveram influência significativa sobre a capacidade de separação entre cultivares transgênicos e convencionais. Esta metodologia foi corroborada pela análise multivariada dos dados dos espectros de RMN de 1 H. Por outro lado, estudos realizados através da técnica de infravermelho demonstraram que os resultados foram menos conclusivos, quando comparados àqueles obtidos através de RMN. O estudo da influencia da exposição da cultivar ao ar, indicou uma variação no teor do flavonóide miricetina, visualizado pelo decréscimo da intensidade de seus sinais no espectro. Para o flavonóide quercetina, nenhuma variação foi observada. Por fim, esse trabalho aponta para a simplicidade do uso da técnica HR-MAS para análises de alimentos. A medida é extremamente simplificada, pois não requer nenhum prétratamento da amostra além da moagem e adição de gotas de D2O. xvi

ABSTRACT In this work, a new methodology which allows differentiating conventional and transgenic common beans, grown in greenhouse or under field conditions, based on modifications in chemical composition using 1 H HR- MAS NMR and infrared is proposed. Through NMR it was possible to identify differences in chemical composition between the beans, according to transgenic or conventional source, especially in aromatic hydrogen region. The 1 H, ghsqc and ghmbc experiments conducted to the flavonoids quercetin and myricetin structures, present in higher contents in genetically modified cultivars. Moreover, through 1 H HR-MAS NMR was also possible to identify, in mixture, the aminoacids threonine, valine, isoleucine, and lysine, and the oligosaccharides stachyose, raffinose, and verbascose. The NMR spectra of Pérola 5.1 and BRS Pontal 5.1, to which the transgene was received from Olathe 5.1, using crosses and backcrosses, showed the same signal pattern observed in Olathe 5.1 bean. This study also demonstrated that the influence of typical variables from field planting conditions had no significant influence on the ability of separation between cultivars transgenic and conventional. This methodology was corroborated by multivariate data analysis of the 1 H NMR spectra. On the other hand, the infrared studies showed less conclusive results. The study of the influence of exposure to air indicated a decrease in the flavonoid myricetin content. For quercetin no change was observed. This study also points out the simplicity of using the HR-MAS NMR technique for food analyses. The measurement is highly simplified because it does not require any pretreatment of the sample apart from the addition of a small amount of D2O necessary to produce homogeneous dough and a field frequency lock. Moreover, due to the high concentration of the sample, measurement time in HR-MAS NMR is very short. xvii

O feijão 1

1 O feijão 1.1 - O Feijão no Mundo Uma das leguminosas intensamente estudadas tem sido o feijão comum, por representar uma rica e barata fonte de proteínas, carboidratos, fibras e vitaminas para milhões de pessoas em países desenvolvidos e em desenvolvimento (PERAZZINI et al. 2008). O feijoeiro comum, pertencente à família Leguminosae, gênero Phaseolus e espécie Phaseolus vulgaris L., é a espécie mais cultivada do gênero Phaseolus, contribuindo com 95% da produção mundial de feijões. É cultivado em aproximadamente 100 países, destacando-se o Brasil, a Índia, a China, o Myanmar, os EUA e o México, que nas safras de 2006 a 2008, foram responsáveis por 62% da produção mundial, de acordo com a FAO (Food and Agriculture Organization) (SEAB/PR, 2010), como pode ser visto na Tabela 1 (pág. 2). Tabela 1. Produção do feijão no mundo 2006 a 2008. Países Em toneladas 2006 2007 2008 Brasil 3.457 3.169 3.461 Índia 3.270 3.470 3.010 Myanmar 2.502 2.500 2.500 China 1.233 1.560 1.807 Estados Unidos 1.151 1.100 1.235 México 1.050 1.098 1.130 Outros 5.713 5.710 5.520 Fonte: FAO Quando comparado ao comércio mundial do trigo, da soja e do milho, que movimentam grandes volumes por ano, o comércio internacional de feijões apresenta menor destaque por ser um alimento usado basicamente como alimento humano. Os principais países consumidores também são os maiores produtores, tais como: Índia, Brasil, México e EUA, assim o excedente é pequeno e o volume exportado também é reduzido (SEAB/PR, 2010). 2

Os principais países importadores de feijão são: Índia, EUA, Cuba, Japão, Reino Unido, Brasil, Itália e México. Juntos importaram em 2007 em torno de 1,32 milhões de toneladas e representam 45% das importações mundiais, conforme pode ser visualizado na Tabela 2 (pág. 3). Tabela 2. Importações Mundiais de feijão 2005-2007. Países 2005 2006 2007 t (x10 3 ) US$ (x10 6 ) t (x10 3 ) US$ (x10 6 ) t (x10 3 ) US$ (x10 6 ) Índia 304.1 135.5 620.5 423.0 486.2 304.9 EUA 147.4 106.8 152.4 102.5 171.2 128.7 Cuba 138.5 63.0 138.9 65.1 127.2 66.4 Japão 117.5 92.3 119.6 89.1 122.8 103.8 Reino Unido 114.5 74.2 124.4 83.6 122.9 84.0 Brasil 100.7 43.1 70.1 26.5 96.3 52.3 Itália 92.4 65.8 106.8 76.7 104.9 94.6 México 79.0 56.2 131.7 81.1 91.7 68.3 Fonte: FAO 1.2- O Feijão no Brasil O plantio desta leguminosa é estendido em todas as regiões do território brasileiro. Considerada uma cultura de subsistência em pequenas propriedades, mas adotada também em sistemas de produção que requerem o uso de tecnologias intensivas como a irrigação. No Brasil, na década de 90, foram colhidas, em média, 3,0 milhões de toneladas por ano, das quais 2,5 milhões são de feijão comum, com 1,6 milhões do tipo Carioca, 0,4 milhões do grupo comercial preto e 0,1 milhões restantes de outros tipos (FERREIRA et al., 2002). Em 2009, o Brasil produziu cerca de 3,7 milhões de toneladas do feijão em grão, sendo que o consumo anual é de 16 Kg por habitante (FAO, 2010). Atualmente, o Brasil figura como o maior produtor mundial, respondendo por 17% da produção mundial (SEAB/PR, 2010). Na safra 2009/10, os três maiores produtores dessa leguminosa foram 3

o Paraná, Minas Gerais e Bahia, que juntos responderam em média por 48% da produção nacional, com destaque para o Paraná, que participou, em média, com 21% do total nacional (CONAB, 2009). O consumo per capita médio mensal de feijão nas capitais dos Estados da região Centro-Oeste é cerca de 34% maior nas classes de renda mais baixa quando comparado as classes de renda acima de 10 salários mínimos. Nestes locais, o depoimento de 85% dos consumidores foi de que manteriam o consumo de feijão mesmo se ocorresse um aumento do preço do produto (EMBRAPA, 2006). No Estado de Goiás são produzidos anualmente cerca de 233.700 t de feijão, resultando num rendimento médio de 2.038 kg/ha, o que corresponde a 8% do total nacional (SEPLAN-GO, 2007). Abaixo (Tabela 3, pág. 4) estão apresentados dados da CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento) referente aos principais Estados produtores de feijão referentes ao período de 2006/07 a 2009/10. Tabela 3. Principais Estados produtores de feijão - 2006/07 a 2009/10. Estado # 2006/2007 # 2007/2008 # 2008/2009 # 2009/2010 Participação (%) Paraná 795 764 723 853 21 Minas 504 566 578 577 17 Gerais Bahia 323 352 344 317 10 São 314 277 325 332 9 Paulo Goiás 271 218 266 230 8 Fonte: CONAB # (em mil toneladas) 1.3- Composição Química Do ponto de vista químico, os feijões são fonte de proteínas, minerais, vitaminas (principalmente do complexo B), carboidratos, fibras e compostos fenólicos (SOARES, 1996). A composição dos carboidratos de feijões varia de 60 a 65%, onde o amido é o principal carboidrato armazenado. Oligossacarídeos como a 4

rafinose, estaquiose e verbascose também estão presentes, sendo responsáveis pela produção de flatulências, devido à ausência da enzima galactosidase no aparelho digestivo humano. Já a porcentagem de lipídios no feijão é baixa, variando entre 0,8 e 1,5%, de acordo com a variedade, localização, clima e tipo de solo. (GEIL & ANDERSON, 1994). Esta legumionosa constitui rica fonte de vitaminas, como: ácido fólico, vitamina B6 e tiamina (hidrossolúveis), porém pobre em vitamina C e vitaminas lipossolúveis. Em termos de fonte de minerais, uma xícara de feijão cozido pode proporcionar 55% do ferro para homens e 29% para mulheres, 20-25% de fósforo, manganês e magnésio, 20% de potássio e 10% de zinco e cálcio (GEIL e ANDERSON, 1994). Estudos recentes realizados por Santos et al. 2010, mostraram o teor dos micronutrientes Zinco, Ferro, Cálcio, Manganês, Magnésio e Cobre, em 16 variedades de feijões. Dentre os cultivares estudados, o cultivar Diamante Negro, BRS Executivo e A195 apresentam a maior quantidade de micronutrientes, exceto para o mineral magnésio (Figura 1, pág. 5). Fonte: Santos et al., 2010, adaptado. Figura 1. Gráfico da PCA para os cultivares de feijão Diamante Negro BRS Executivo e A195. 1.4 - Feijão: Um Alimento Funcional Do ponto de vista nutricional, os feijões fornecem de 10 a 20% dos nutrientes necessários para um adulto, com teor de proteína de 20 a 25% 5

(BASSINELLO, 2001), que constitui um valioso complemento dos cereais, principalmente onde a população tem limitado acesso à proteína animal (SERRANO & GOÑI, 2004). Além de ser uma fonte de nutrientes essenciais, hoje o feijão está recebendo cada vez mais atenção como alimento funcional, seu consumo vem sendo relacionado à redução de riscos de doenças cardiovasculares, diabetes, obesidade, câncer e doenças do trato digestivo (CARDADOR- MARTÍNEZ et al., 2002). Os efeitos fisiológicos do consumo de feijão podem ser atribuídos à presença de abundantes fitoconstituintes, destacando-se os polifenóis que possuem tanto ação anticarcinogênica quanto propriedades antioxidantes (CARDADOR-MARTÍNEZ et al., 2002). Dentre estes polifenóis, destacam-se os taninos, lignanas, isoflavonas, flavonóis, antocianinas, dentre outros (MOURE et al., 2001, MEIJA et al., 1999, MAZUR et al., 1998). Estes são responsáveis pela cor da semente do feijão e tem como principal função a defesa da semente contra patógenos e predadores (ISLAM et al., 2003). As isoflavonas do feijão podem ter efeitos bioquímicos importantes, como por exemplo, a potente inibição de proteinocinases pela bioflavona genisteína (Figura 2, pág. 6), que ocasiona a redução da proliferação de células cancerígenas (LÉVANO, 1990; AKIYAMA et al., 1987), além do efeito ateroprotetor mediante ação antioxidante que previne a lipo-oxidação de membranas e, portanto, inibe a progressão da aterosclerose (KANAZAWA et al., 1995; WEI et al., 1995; PETERSON, 1995). OH O OH HO O Figura 2. Estrutura da genisteína Assim como a genisteína, as lignanas matairesinol (1) e secoisolariciresinol (2), Figura 3, pág. 7, também apresentam atividades anticarcinogênica e antioxidante (SETCHELL et al., 1981, MOURE et al., 6

2001). CH 3 O HO O O CH 3 O HO OH OH OCH 3 OCH 3 OH OH 1 2 Figura 3. Estrutura das lignanas matairesinol e secoisolariciresinol Estudos de Lin et al., 2007, com 17 variedades de feijão, revelaram a presença de flavonóides e antocianinas (responsáveis pela atividade antioxidante), dentre os quais se destacam a miricetina, quercetina, kaempferol (flavonóis), malvidina, petunidina e cianidina (antocianinas). (Figura 4, pág. 7). R 1 R 1 OH OR 3 HO O R 2 HO O R 2 OR OH OH O OH Kaempferol: R = R 1 = R 2 = H Quercetina: R = R 2 = H; R 1 = OH Miricetina: R = H; R 1 = R 2 = OH Figura 4. Estruturas de flavonóis e antocianinas identificados em Phaseolus vulgaris. Cianidina: R 1 = OH; R 2 = R 3 = H Petunidina: R 1 = OMe; R 2 = R 3 = H Malvidina: R 1 : OMe; R 2 :Me; R 3 = H Amplamente presente no tegumento das sementes das leguminosas, os taninos também apresentam atividades biológicas, tais como: bactericida, antifúngica (SCALBERT, 1991), antiviral (ERDELMEIER, 1996), antioxidante, além de possuírem a capacidade de complexar-se a proteínas, compostos nitrogenados (HASLAM, 1996) e íons metálicos como: ferro, 7

manganês, alumínio, cálcio e outros (MILA et al., 1996, CHANG et al., 1996). Fatores antinutricionais também estão ligados aos taninos, sendo responsáveis pela redução da digestibilidade protéica e de outros nutrientes (VASCONCELOS, 1994). O conteúdo de taninos pode variar de 0,2 a 2% dependendo da espécie e do feijão (REDDY et al., 1985). Os efeitos dos taninos em seres humanos são pouco conhecidos (PRICE et al., 1980) e os efeitos nocivos do consumo anormal de fenóis em plantas apresentam resultados pouco expressivos (CHANG et al., 1996). Dentre as substâncias com propriedades antinutricionais encontradas no feijão também estão os fitatos, derivados do ácido fítico, formados durante o processo de maturação das sementes e também responsáveis pela iniciação da dormência (REDDY et al., 1985; MAGA, 1982; TORRE et al., 1991). Eles possuem a habilidade de formar quelantes com íons de minerais, tais como o cálcio e magnésio, formando complexos solúveis resistentes à ação do trato intestinal, que diminuem a disponibilidade desses minerais. Pelo fato do feijão ser um alimento funcional, sua forma de armazenamento é essencial. O armazenamento de sementes e grãos de feijão tem sido objeto de estudos, principalmente para regiões úmidas e quentes, onde o fator umidade e temperatura são os fatores primordiais na conservação dos grãos. Durante o período de armazenamento, o feijão passa por modificações fisiológicas e bioquímicas que alteram a sua qualidade, tanto para o uso como semente como para consumo como alimento. Santos et al. (2005) estudaram essas alterações em sementes de feijoeiro armazenadas em condições ambientais não controladas de temperatura e umidade relativa do ar e concluiu que existem cultivares com diferentes aptidões para a manutenção da qualidade fisiológica durante o armazenamento. Além de aspectos climáticos, Popinigis (1987) indicou que a qualidade sanitária é outro fator que interfere na qualidade do feijão, na qual os gêneros de fungos Aspergillus e Penicillium são os mais presentes, ocasionando a morte do embrião e posterior descoloração do grão. 8

1.5- Incidência de doenças no Feijão Na última década, a produção agrícola brasileira teve um enorme impulso. A produção de grãos no país aumentou significativamente, chegando a 145 milhões de toneladas no ano de 2008 (AGRIANUAL, 2009). Isso é resultado da crescente utilização de tecnologias modernas, sobretudo as associadas a programas de melhoramento de plantas, que vêm gerando variedades mais adaptadas às diversas condições ambientais e de cultivo no Brasil. Neste contexto, é inevitável o surgimento de pragas e doenças, que encontram nas plantas alimento farto e condição de reprodução. Estima-se que as perdas provocadas por pragas e doenças na agricultura mundial atinjam 37% da produção, dos quais, 13% são devidos a insetos (SILVA-FILHO & FALCO, 2001). A cultura do feijão é extremamente importante para o Brasil, por ter grande impacto social e por ser uma fonte fundamental de proteína, tendo também grande relevância cultural. Entretanto, devido a sua suscetibilidade a várias doenças (Tabela 4, pág. 9), o cultivo do feijão em determinadas épocas do ano é realizado em condições de alto risco. Este fato coloca em risco a segurança alimentar das comunidades que cultivam esta leguminosa. Além disso, a necessidade de utilização de agrotóxicos no combate às pragas produz um impacto ambiental negativo e um aumento do custo de produção, que pode até mesmo inviabilizar seu cultivo devido às variações de mercado. No caso específico do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) uma das doenças mais agressivas é o mosaico dourado, transmitido pela mosca branca. Tabela 4. Principais doenças que afetam o feijoeiro. Doença Patógeno Danos (%) Antracnose Colletotrichum lindemuthianum 100 Ferrugem Uromyces appendiculatus 60 Mofo Branco Sclerotinia slcerotiorum 100 Mosaico Dourado Bean golden mosaic virus 100 Tombamento Rhizoctonia solani 60 Mela Tanathephorus cucumeria 70 Fonte: Oliveira, 1999. 9

1.5.1- Mosaico dourado O mosaico dourado do feijoeiro foi inicialmente descrito por Álvaro Santos Costa como uma doença que, inicialmente, não teria importância econômica, ocorrendo no Estado de São Paulo (COSTA, 1965). É uma das principais doenças que afetam a cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), dificultando a produção de feijão ou mesmo inviabilizando-a em várias regiões. A denominação atual para a espécie viral encontrada é Bean golden mosaic virus (BGMV). BGMV, um geminivirus, é transmitido pela mosca branca (Bemisia tabaci Gen.), pertencente ao gênero Begomovirus (Família Geminiviridae) (Figura 5, pág. 10), sendo que sua incidência nas plantações de feijão comum é maior no período de seca quando a população de B. tabaci é aumentada. Lemos et al., 2003, analisaram diferentes genótipos de feijão, e seus resultados também mostraram que a maior infestação de mosca branca e incidência do vírus ocorrem no período de seca. O mosaico dourado foi assim denominado antes da caracterização molecular do vírus, realizada por Gilbertson et al. (1993). Figura 5. Agente transmissor da doença do mosaico dourado (mosca branca). Fonte: Dow AgroSciences Os sintomas são evidenciados quando as plantas apresentam de duas a quatro folhas trifolioladas manifestando-se por um amarelecimento intenso da lâmina foliar delimitado pela coloração verde das nervuras, dando um aspecto de mosaico, conforme mostrado na Figura 6, pág. 11. As folhas 10

das plantas infectadas podem apresentar-se deformadas e manchadas, afetando a qualidade das sementes. Figura 6. Cultivar de feijão afetado pelo mosaico dourado. Fonte: NORAGRO Nordeste Agrícola De acordo com Morales & Anderson (2001) o mosaico dourado está disseminado por toda a área de produção de feijão, tanto no Brasil como em outros países da América. Foi observado que no Brasil, em condição de campo, as perdas variam de 40% a 85%, podendo chegar a 100%. No período de 1988 a 1996, nos Estados Unidos, os prejuízos causados pela mosca branca foram em torno de 2 milhões de dólares; na América Central, as perdas chegaram a 90% na cultura do pimentão e a 100% nas culturas do feijão, melão e tomate; na República Dominicana, em 1991, as perdas atingiram cerca de 15 milhões de dólares (LACERDA & CARVALHO, 2008). Nenhuma medida de controle, quando utilizada isoladamente, demonstra efeito positivo no controle dessa doença. Assim, tem sido recomendada a antecipação da semeadura do feijão da seca para a primeira quinzena de janeiro, a aplicação de um inseticida sistêmico como tratamento de sementes e o uso de cultivares mais tolerantes (FARIA & ZIMMERMANN, 1988; FARIA, 1994; FARIA et al., 1996). Boiça Júnior et al. (2000) avaliaram o controle de B. tabaci com inseticidas Fosfamidom 500 e Metamidophos BR na dose de 0,5 L.ha -1 em diferentes cultivares de feijoeiro, semeadas na época de inverno, e 11

constataram que os inseticidas controlaram significativamente a incidência do inseto vetor em todas as cultivares, proporcionando incrementos na produção de grãos. Conforme descrito por Barbosa, 2002, o Fosfamidom 500 é um inseticida cloro-fosforado de ampla ação, período residual médio e com toxicidade menor comparado com moléculas puramente fosforadas. Já o Metamidophos BR, conhecido com Tamaron, é um inseticida organofosforado de ação sistêmica que age por contato, ingestão ou de forma sistêmica, responsável por causar importantes efeitos neurotóxicos, inclusive distúrbios comportamentais. Apesar da eficácia, a utilização destes inseticidas vem sendo substituído por outros métodos menos agressivos ao meio ambiente e ao homem Faria (1997) ressalta que trabalhos desenvolvidos em Goiás levaram à recomendação do cultivar Ônix para cultivo na época da seca. Já no Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) foram desenvolvidos alguns cultivares moderadamente resistentes ao vírus-do-mosaico-dourado, como a IAPAR 57 e a IAPAR MD 820 (LEMOS, 2003). Vale destacar, que os prejuízos provocados pelo inseto não se restringem somente ao feijoeiro. Haji et al. (1996) citam danos provocados em frutos de melão (Cucumis melo L.), em tomateiros, cujos frutos amadurecem de forma irregular (VILLAS BÔAS et al., 1997). Lourenção e Nagai (1994) descrevem o prateamento das folhas de abóbora (Curcubita spp.). Serrano et al. (1993) relatam deformações importantes no botão floral do algodoeiro (Gossypium hirsutum L), além do amarelamento e murcha das folhas de couve (Brassica oleracea) (LACERDA & CARVALHO, 2008). 1.6- Os organismos geneticamente modificados Os organismos geneticamente modificados (OGMs) podem ser definidos como organismos cujo material genético (DNA) foi alterado de modo artificial. A tecnologia geralmente é denominada biotecnologia moderna ou tecnologia genética, ou também, tecnologia de DNA recombinante, ou ainda, engenharia genética. 12

Organismos geneticamente modificados (OGMs), em particular plantas geneticamente modificadas (PGMs), têm sido desenvolvidos nos últimos anos por várias razões (PERR, 2002; TAYLOR & HEFLE, 2001; ASTWOOD et.al., 2003). Uma razão para o desenvolvimento dos OGMs é aumentar o fornecimento de alimentos pelo aumento da produção das colheitas. Empresas vem desenvolvendo plantas com características agronômicas melhoradas, tais como resistência a insetos, herbicidas e doenças (NEWELL, 2000). Segundo a ISAAA (International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications) (2009), as avaliações de impacto mundial das culturas transgênicas indicam que, no período de 1996 a 2008, os ganhos econômicos com a adoção de transgênicos foram de 51,9 bilhões de dólares, com a redução nos custos de produção e os ganhos de produtividade. Durante o mesmo período, de 1996 a 2008, a redução de defensivos foi avaliada em 268 milhões de kg de ingredientes ativos, uma economia de 6,9%. Estudos mostraram que de 1996 a 2002 o aumento de áreas cultivadas com sementes de organismos geneticamente modificados (OGMs) foi enorme, com um índice de crescimento sustentável de mais que 10% ao ano, sendo que a área global estimada para cultivos transgênicos em 2002 foi de 58,7 milhões de hectares (Tabela 5, pág. 13) (ISAAA, 2002). Tabela 5. Área Global com Cultivos Transgênicos, 1996 a 2002. Ano Hectares (Milhões) 1996 1,7 1997 11,0 1998 27,8 1999 39,9 2000 44,2 2001 52,6 2002 58,7 Fonte: ISAAA, 2002. 13

No ano de 2009, 21 países cultivaram transgênicos, entretanto o volume da área de cultivo está concentrado em apenas 8 países, conforme mostra a Tabela 6, pág. 14. Tabela 6. Principais países responsáveis pelo plantio biotecnológico. País Área (milhões de Principais Plantios hectares) biotecnológicos EUA 57,7 Soja, milho, algodão, canola, abobrinha, mamão, alfafa Argentina 19,1 Soja, milho, algodão Brasil 15,0 Soja, milho, algodão Canadá 7,0 Canola, milho, soja Índia 6,2 Algodão China 3,8 Algodão, tomate, álamo, petúnia, mamão, pimenta Paraguai 2,6 Soja África do Sul 1,8 Soja, milho, algodão Fonte: ISAAA, 2009. Tilman et al (2001) descrevem em seu trabalho que no ano de 2000 o uso de pesticidas no mundo todo foi de 4.106 milhões de toneladas e que esse número poderá aumentar para 7.106 milhões de toneladas em 2020 (cobrindo uma área de 1,7.10 9 hectare) e 10.106 milhões de toneladas em 2050 (cobrindo uma área de 1,9.10 9 hectare), enfatizando que poderemos estar contaminando muito o ambiente além de danos à saúde. Além disso, estudos divulgados por Diciero, 2006 mostram que a população poderá chegar a até 10 bilhões de habitantes em 2025. Portanto, todos esses fatos justificam uma crescente busca pelo desenvolvimento de tecnologias ligadas à biotecnologia. As culturas transgênicas autorizadas para comercialização são inúmeras, sendo as principais: soja, milho, algodão e canola. A cultura com o maior volume de cultivo é a soja, com aproximadamente 60% do total, seguida pelo milho com 21%, pelo algodão com 11% e pela canola com 5% do total cultivado (ORATI, 2006). Nos Estados Unidos, mais de 50% do 14

algodão, 45% da soja e 40% do milho cultivados passaram por alguma alteração genética, e pelo menos, 60% dos produtos industrializados contêm OGM (ORATI, 2006). 1.6.1- Os organismos geneticamente modificados no Brasil A introdução dos OGMs na cadeia alimentar gerou um intenso debate público e científico a respeito dos seus riscos e da necessidade de fornecer informações ao consumidor. Muitos países estão regulamentando o uso e a rotulagem de OGMs e de produtos que contenham ingredientes derivados destes. Neste sentido, o Estado brasileiro regulou o plantio de transgênicos por meio da aprovação da Lei nº 11.105, de 2005 (Lei de Biossegurança), que regulamenta o art. 225 da Constituição Federal (CF) de forma mais ampla, considerando os novos avanços na tecnologia aplicada para a produção agrícola. No fim de 2009 e durante o ano de 2010, o Brasil ultrapassou a Argentina e se tornou o segundo país que mais usa produtos agrícolas geneticamente modificados no mundo, atrás apenas dos Estados Unidos (INFO EXAME, 2010). O Brasil plantou neste mesmo ano 21,4 milhões de hectares com produtos transgênicos (aumento de 6,4 milhões comparados com o ano de 2009), apenas 100 mil hectares a mais do que a Argentina; porém os Estados unidos lideram com folga a adoção de produtos alterados geneticamente, com 64 milhões de hectares (INFO EXAME, 2010). A soja ainda domina o cultivo de transgênicos no Brasil, mas o crescimento do uso de lavouras geneticamente modificadas no país no ano foi liderado pelo milho. Já a área total com algodão transgênico no Brasil superou 800 mil hectares (INFO EXAME, 2010). Segundo o Portal do Agronegócio Goiano (2010), em 2010, mais da metade de toda a área semeada conta com tecnologia transgênica. Do total de 37,5 milhões de hectares com plantação de soja, milho e algodão, cerca de 67%, ou 25,3 milhões de hectares, correspondem a produção transgênica. Em 2010, pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e da 15

Embrapa Arroz e Feijão solicitaram à Comissão Técnica Nacional de Biossegurança CTNBio a liberação para cultivo comercial de variedades de feijão transgênicas, resistentes ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA, 2010). Vale destacar que a pesquisa marca um feito inédito no Brasil, onde as primeiras plantas transgênicas foram totalmente produzidas por uma instituição pública de pesquisa. Pesquisas com arroz também estão sendo desenvolvidas. Hoje no Brasil ainda não há autorização para o plantio comercial de arroz transgênico, porém estudos que intensifiquem a busca de genes no arroz que garantam maior tolerância à seca devem ser pesquisados nos próximos anos (EXPRESSO MT, 2010). Ainda de acordo com o jornal Expresso MT (2010), pesquisas vem recebendo apoio da iniciativa privada, como é o caso da Monsanto, que desde 2006 investiu R$ 25 milhões e só este ano foi responsável pelo repasse de R$ 5,9 milhões ao Fundo de Pesquisa Embrapa-Monsanto. Outros projetos como: o feijão resistente ao mofo branco via engenharia genética, o melhoramento de algodão convencional resistente a nematóide das galhas e a prospecção de genes de cana-de-açúcar para melhoramento genético visando tolerância à seca serão desenvolvidos nos próximos anos pela EMBRAPA. 1.6.2 - O feijão geneticamente modificado Visando o controle da doença causada pelo vírus BGMV, várias estratégias têm sido utilizadas, com a ajuda da engenharia genética, no sentido de desenvolver plantas transgênicas resistentes ao vírus. Para a maioria das begomoviroses tem-se aplicado a expressão de truncagem de genes defeituosos (ANTIGNUS et al. 2004; BRUNETTI et al. 1997; CHELLAPPAN et al. 2004; DUAN et al. 1997) e silenciamento de RNA (ASAD et al. 2003; ZHANG et al. 2005). Deste modo, a Embrapa Arroz e Feijão, juntamente com a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, desenvolveram várias linhagens geneticamente modificadas para conter a replicação do vírus BGMV, destacando-se a linhagem Olathe 5.1 (Figura 7, pagina 17) que apresentou 16

total resistência ao vírus BGMV. Este cultivar Olathe Pinto não é comercial no Brasil e foi escolhido para ser transformado geneticamente por apresentar boa exposição de seu tecido meristemático e capacidade de crescer in vitro. Linhagens de genótipos dos feijões comerciais Pérola e BRS Pontal receberam a transgene do cultivar Olathe 5.1, através de cruzamentos e 4 retrocruzamentos, e também apresentaram completa resistência ao BGMV. Estes cultivares, por não terem o tecido meristemático exposto, são pouco suscetíveis as transformações gênicas; assim realizar o cruzamento e transferir o transgene é mais simples e eficiente em feijões. Figura 7. Cultivar Olathe 5.1 Desde 2008, pesquisadores da Embrapa conduziram pesquisas de campo com o feijão transgênico em Sete Lagoas (MG), Londrina (PR) e Santo Antônio de Goiás (GO), localizados em regiões de alta produção no país. Em todos os casos, os grãos foram infectados naturalmente pelo mosaico dourado. Os transgênicos não apresentaram sintomas da doença. Os convencionais apresentaram de 80% a 90% das plantas afetadas (EMBRAPA, 2010), conforme apresentado na Figura 8, pág. 17. Figura 8. Desenvolvimento da doença do mosaico dourado na linhagem transgênica (T) em comparação com variedades não transgênicas (NT). A estratégia para a obtenção do cultivar resistente ao BGMV foi à de 17

RNA interferente (RNAi). Várias estratégias incluindo RNA interferente vem sendo utilizados para o silenciamento gênico mediado por RNA. Neste processo de silenciamento moléculas de RNA fita-dupla (dsrna) são clivadas pela ribonuclease DICER em pequenos RNA interferentes (sirna), com 21 a 25 nucleotídeos, que incluem ambos fragmentos senso e antisenso da seqüência do gene silenciado (ELBASHIR et al., 2001). Estes sirnas são então incorporados a um segundo complexo enzimático chamado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC, RNA induced silencing complex), a partir da extremidade 5 desenrolada (KRETSCHMER-KAZEMI & SCZAKIEL, 2003). Esta endoribonuclease (RISC) usa a fita antisenso dos sirna, como primer, para encontrar e degradar a seqüência complementar do mrna alvo a partir da extremidade 3 (HANNON, 2002). A proteína associada à replicação (REP), codificada pelo gene rep AC1, exerce uma função essencial no ciclo de infecção viral, e tem sido alvo de um grande número de estudos nos últimos anos. Hanley-Bowdoin et al. (1990) citam que a mutagênese in vitro e a expressão da proteína em plantas transgênicas demonstraram que esta é a única proteína viral essencial para a replicação. Desta maneira o gene viral (rep AC1) se tornou candidato natural a construção de vetores de transformação por RNA interferente (RNAi). Na Figura 9, pág. 18, é mostrada uma planta geneticamente modificada, imune ao mosaico dourado (vagens desenvolvidas) e uma planta não modificada, apresentando os sintomas típicos (vagens subdesenvolvidas). Ambas foram inoculadas com o BGMV. Figura 9. Planta geneticamente modificada (direita), imune à doença do mosaico dourado e uma planta não modificada (esquerda). 18

A Ressonância Magnética Nuclear e o Infravermelho 19

2 A Ressonância Magnética Nuclear e o Infravermelho (IV) 2.1 - Considerações Gerais e Aplicações da RMN HR-MAS A ressonância magnética nuclear tem sido uma técnica muito útil na análise de materiais sólidos onde a preparação da amostra, na maioria das vezes, se resume ao seu empacotamento no rotor. Entretanto, tradicionalmente, os espectros de hidrogênio não têm sido explorados na análise de amostras sólidas, uma vez que as interações moleculares ainda comprometem significativamente a resolução espectral, no nível de separação que exige esse espectro. Este fato ocorre por existir interações dos núcleos presentes na molécula devido à diminuição dos movimentos moleculares, diferentemente do que ocorre em solução, onde os movimentos Brownianos rápidos fazem com que essas interações sejam praticamente nulas (AGUIAR et al., 1999). Neste contexto, a técnica de High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS), que é utilizada na análise de amostras semi-sólidas, emergiu para solucionar estas dificuldades. A técnica possibilita combinar vantagens de RMN do estado sólido e no estado líquido, pois ao mesmo tempo em que reduz os principais inconvenientes ligados à manipulação da amostra, como ocorre na RMN no estado sólido, também contribui para uma resolução do espectro semelhante à de líquidos (LIÃO et al., 2010). A principal condição para uma amostra ser considerada semi-sólida (sólidos heterogêneos) é que suas moléculas apresentem algum grau de mobilidade, sendo alcançada pela adição de solvente, que possui o papel de hidratar a amostra. Normalmente utiliza-se D2O, que serve ainda para o ajuste da homogeneidade do campo magnético (shimming). A técnica de RMN HR-MAS também possui a vantagem de ser altamente sensível, possibilitando a realização de outros experimentos unidimensionais como RMN de 13 C e 1 H, DEPT135 e bidimensionais como gcosy, ghsqc, ghmbc, entre outros, utilizando-se as mesmas seqüências de pulsos que são utilizadas rotineiramente para a obtenção de espectros em solução. Esta técnica, ao contrário do que se imagina, não requer sequências especiais ou emprego de potências elevadas em seus pulsos, comum em análise de amostras no estado sólido. Em comparação com 20

análise de líquidos, é necessária apenas a aquisição da sonda e da unidade pneumática. A HR-MAS tem se destacado na área alimentícia e biológica. O uso de materiais intactos é um dos motivos pelos quais a RMN tem sido cada vez mais utilizada na análise de alimentos, uma vez que minimiza o tempo de análise e evita o pré-tratamento das amostras, comumente realizado em outras técnicas analíticas, e que podem causar alterações na composição química do material em análise. Sacco et al., 1988 iniciaram o emprego da técnica em alimentos ao adquirir espectros de RMN de 1 H diretamente de amostras de farinha de trigo, bem como a verificação das variações na quantidade de proteínas, ocorridas no grão durante o seu armazenamento. Lião et al. 2010 descrevem a utilização da técnica na avaliação do perfil químico de cultivares de feijão. A aplicação dessa técnica tem apresentado ainda excelentes resultados na caracterização de géis (HANDEL et al., 2003), moléculas adsorvidas em zeólitas (PAMPEL et al., 2005) e ligadas a resinas (FRANKS et al., 2008), proteínas nanocristalinas (SCHRÖDER, 2003), microorganismos (BLAISE, 2007) e, recentemente, aplicada a nanopartículas de óxido de ferro contendo ferro paramagnético (POLITO, 2008), onde demonstrou ser possível a obtenção de espectros com sinais finos e bem resolvidos. A espectroscopia de RMN de 1 H HR-MAS fornece ainda informações metabólicas detalhadas sobre tecidos intactos. Deste modo, a técnica demonstra ser uma valiosa ferramenta em estudos de tecidos biológicos (ROONEY et al., 2003) e células humanas (WEYBRIGHT et al., 1998, GRIFFIN et al., 2000, PÉREZ et al., 2002). Aliás, estudos envolvendo a aplicação clínica em RMN também têm sido frequenemente relatados. Exemplo disso, é a aplicação da HR-MAS para caracterizar diferentes tecidos intactos, tais como cérebro (CHENG et al., 1998; SJØBAKK et al., 2008; TUGNOLI et al., 2006), mama (SITTER et al., 2002; BATHEN et al., 2007), próstata (CELDA et., 2006; SWANSON et al., 2001), rim (GARROD et al., 1999; TATE et al., 2000), colo do útero (LYNG et al., 2007), coração (BARBA et al., 2007) e estômago (CALABRESE et al., 2008). Wang et al. 21

(2008) relataram ainda variação topográfica nos perfis metabólicos do trato gastrointestinal humanos e atribuí-las à variação funcional das diferentes regiões do intestino. Estudos envolvendo lipossomos (Gaede et al., 2003), membranas (Wattraint & Sarazin, 2005), quimiotaxonomia de liquens (ALCANTARA, 2008) e composição química de microalgas também são encontrados na literatura (Chauton et al. 2003). Métodos capazes de reconhecer OGMs também são desejáveis. Neste sentido, a utilização da RMN tradicional (RMN de líquidos) tem sido descrita na literatura aliada a métodos quimiométricos de análises. Manetti et al. (2004) foram capazes de identificar e classificar sementes de milho originados de plantas GM de acordo com a modificação genética, através de análises multivariadas dos espectros de RMN de 1 H. Da mesma forma, espécies geneticamente modificada de tabaco (CHOI et al., 2004) e de tomate (Le GALL et al., 2003) foram discriminadas de suas respectivas espécies convencionais. Noteborn et al. (2000) encontraram diferenças nos teores dos ácidos cítrico e glutâmico em tomates geneticamente modificado. Diferenças nos teores de ácido salicílico produzidas por espécies transgênicas e selvagens de tabaco foram observadas por Choi et al (2004). Vale ressaltar que não existem muitos relatos de trabalhos envolvendo HR- MAS na detecção de OGMs. 2.2- Princípios da HR-MAS A diminuição da mobilidade de sistemas heterogêneos compromete significativamente a resolução espectral no nível de separação que exige um espectro de hidrogênio, devido ao aumento da largura de linhas. Este fato ocorre devido aos efeitos de deslocamento químico anisotrópicos, acoplamentos dipolares e a susceptibilidade magnética, que não são observados na RMN de líquidos devido aos movimentos Brownianos rápidos. O acoplamento dipolar refere-se à interação magnética dos spins nucleares, dependendo da posição que cada núcleo ocupa no espaço. Assim, este campo magnético gerado pelo spin de um núcleo pode somar ou 22

subtrair à força do campo magnético local aplicado ao núcleo vizinho (GIL & GERALDES, 1987), resultando em uma extensa banda de freqüências. Na equação da RMN, o efeito do alargamento dos sinais devido ao acoplamento dipolar é representado pelo termo Blocal = ±µyrjy -3 (3cos 2 α -1), onde o Blocal está associado ao campo magnético local sentido pelo núcleo y, rjy corresponde a distância intermolecular entre os núcleos j e y e α o ângulo entre o vetor intermolecular e o campo magnético estático, comumente chamado de Bo, sendo o sinal ± referente à orientação dos spins nucleares em relação a este campo magnético. Quando este ângulo apresenta um valor de 54,74 (Figura 10, pág. 23), o termo 3cos 2 α -1 torna-se zero, conseqüentemente µ será anulado. Assim, quando o rotor, contendo a amostra, é submetido a esta inclinação, o campo magnético local é minimizado, bem como seus efeitos (GIL & GERALDES, 1987; GAEDE & GAWRISCH, 2004). Consequentemente, a redução destes efeitos fornece um enorme ganho de resolução nas linhas de ressonância e o termo ângulo mágico advém destas razões. Figura 10. Rotor inclinado ao ângulo mágico. Fonte: Sitter et al. 2009 Já o deslocamento químico anisotrópico se refere ao fato da distribuição das ligações eletrônicas não serem simétricas. Todavia, os movimentos aleatórios em solução minimizam este efeito, resultando na observação de apenas uma freqüência para cada núcleo, ou seja, tem-se um deslocamento químico isotrópico, correspondente a média dos deslocamentos químicos referentes a todas as orientações que a molécula 23

pode assumir (CLARIDGE, 1999). No caso de sistemas heterogêneos, devido à restrição de movimento molecular, ocorre uma distinção dos deslocamentos químicos de núcleos correspondentes, provenientes das diversas orientações que a molécula pode assumir em relação ao campo magnético (CLARIDGE, 1999). Além de o rotor ser inclinado ao ângulo mágico é necessário o giro deste a altas velocidades (normalmente de 5-6 KHz ) para minimizar o efeito da anisotropia. A alta rotação supera os efeitos dos deslocamentos químicos anisotrópicos, desde que a freqüência de rotação seja ao menos equiparável ao deslocamento por anisotropia. Assim, da mesma forma que nas amostras em solução, observa-se um único sinal, que é a média de todos os deslocamentos químicos referentes a todas as possíveis orientações em relação a B0. A susceptibilidade magnética diz respeito à heterogeneidade física da amostra na qual compromete a homogeneidade magnética local da amostra. Esta diferença de susceptibilidade nas interfaces da amostra leva a um alargamento considerável dos sinais. Assim, com o intuito de evitar este efeito, utilizam-se rotores apropriados de 12 ou 50 µl, com cavidades esféricas, como pode ser visualizado na Figura 11, pág. 24, onde o material fracionado em pequenos pedaços é inserido. Figura 11. Representação do rotor utilizado em análises de HR-MAS É importante destacar que o ganho na resolução dos espectros oferecida pela técnica é obtido somente quando todas as condições são empregadas conjuntamente. 24

A geometria esférica do rotor é fundamental para a boa resolução do espectro, conforme pode ser observado na Figura 12 (pág.25) onde são comparados os espectros de RMN de 1 H de folhas de Citrus limonea, utilizando um rotor de uso comum para amostras no estado sólido CPMAS; um rotor com geometria interna esférica utilizado para amostras semisólidas, ambos girando com a mesma velocidade e no ângulo mágico e, ainda, o espectro do extrato hidroalcoólico do mesmo material em solução de D2O. Como podemos observar, a resolução do espectro em solução é muito semelhante à obtida do material semi-sólido na sonda de HR-MAS utilizando-se o rotor com geometria interna esférica. Na Figura 13, apresentamos ainda o espectro desse material semi-sólido obtido em uma sonda de sólidos CPMAS, utilizando um rotor de geometria interna esférica, e observamos uma resolução inferior àquela apresentada pela sonda HR-MAS (LIÃO et al; 2010) Figura 12. Espectros de RMN de 1 H de folhas de laranjeira no estado semisólido (heterogêneo) em uma sonda CPMAS e Espectros de RMN HR-MAS utilizando-se um rotor de CPMAS (80 µl), rotor de HRMAS (12 µl) e do extrato hidroalcoólico obtido em solução de D2O Os tempos de relaxação T1 e T2 também são importantes na técnica de HR-MAS. Comparativamente a RMN de líquidos, os tempos de relaxação 25

T1 e T2 são distintos, devido à restrição molecular, fazendo com que o tempo de relaxação spin-spin seja curto devido às interações dipolares que aumentam o tempo de relaxação entre os spins. Este efeito pode ser observado em macromoléculas, onde o movimento molecular é restrito resultando no alargamento de sinais. Assim, para a eliminação destes sinais, pode ser utilizada uma seqüência de pulsos chamada de CPMG (Carr- Purcell-Meiboom-Gill). A técnica é utilizada para eliminar ou amenizar sinais de macromoléculas, que por apresentarem baixa mobilidade molecular, possuem valores de tempo de relaxação transversal curtos, no qual fornece sinais alargados que poderão sobrepor sinais de moléculas menores. Outra seqüência muito utilizada é a CPPR (Composite pulse presaturation) que possui a propriedade de pré-saturação do sinal do solvente mediante uma irradiação contínua e seletiva de ondas contínuas de baixa potência (na faixa de radiofrequência), que elimina o excesso populacional de spins no estado de menor energia. Diferentemente da seqüência CPMG, esta não possui a propriedade de eliminar sinais alargados de macromoléculas. 2.3 - Infravermelho Outra ferramenta muito empregada em estudos de padrões metabólicos é a espectroscopia na região do infravermelho (IV), principalmente pelo baixo custo de suas análises e por não precisar de procedimentos de extração, assim como nas análises de HR-MAS, evitando assim inconvenientes causados pela manipulação e consequentemente a possibilidade de ocorrer decomposições químicas indesejáveis. Trata-se que uma técnica espectroscópica de absorção, a qual envolve transições moleculares de estados vibracionais ou rotacionais de baixa energia (4000 a 400 cm 1 ). Como o número e o tipo de transições que a molécula sofre estão relacionados com o número e o tipo de ligações que ela contém, as informações contidas em espectros deste tipo permitem a identificação de grupos funcionais (TOZETTO et al. 2007). Segundo Miranda et al. 2001, dentro deste contexto, destaque pode ser dado à região da impressão digital (1200 a 700 cm 1 ), que é reconhecida por evidenciar pequenas diferenças na estrutura e constituição da amostra, o que resulta 26

em uma significativa mudança na distribuição dos picos de absorção nesta região do espectro. 27

A Quimiometria combinada com a RMN HR-MAS e com o Infravermelho 28

3 A quimiometria combinada com a RMN HR-MAS e com o Infravermelho 3.1- Considerações Gerais A quimiometria é a parte da química que utiliza métodos matemáticos e estatísticos, assim como aqueles baseados em lógica matemática, aplicados a problemas de origem química para definir ou selecionar as condições de medidas e experiências e permitir a obtenção do máximo de informações a partir da análise dos dados químicos. Com o avanço da instrumentação e automação dentro dos laboratórios de análise, uma enorme quantidade de dados começou a ser gerada muito rapidamente. A classificação e interpretação desses dados podem ser fatores limitantes nas análises, principalmente sem a utilização de um tratamento adequado. Além disso, novas metodologias de análise, que antes nem poderiam ser pensadas, puderam ser propostas baseadas na utilização da quimiometria. São numerosas as metodologias desenvolvidas nas últimas décadas baseadas na combinação da quimiometria com técnicas tais como, absorção no ultravioleta e no visível (UV/Visível), no infravermelho (IV) médio ou próximo, Raman e fluorescência molecular (BRERETON, 2000). Atualmente a utilização da quimiometria em estudos utilizando a espectroscopia de RMN tem sido bastante relatada na literatura. Especificamente na área de RMN, diversos trabalhos envolvendo quimiometria foram realizados. Righi et al. (2008) relatam estudos, utilizando a HR-MAS, na distinção de tecidos do coloretal sadios e neoplásicos em conjunto com métodos multivariados. Mannina et al. (2003); Mavromoustakos et al., (2000), em seus trabalhos, descrevem o emprego da quimiometria no controle de qualidade de azeites e sucos de laranja e uva Sua aplicação também abrange estudos sobre combustíveis, destacando-se estudos recentes para avaliar a qualidade da gasolina brasileira (MONTEIRO et al., 2009), além de pesquisas com OGMs, citados anteriormente. Por outro lado, a associação entre a espectroscopia no infravermelho e procedimentos quimiométricos, como a Análise por Componentes 29

Principais (PCA), tem recebido muita atenção de pesquisadores de diversas áreas por se tratar de uma ferramenta analítica rápida que pode detectar diferenças no perfil químico de amostras em uma única análise. Como exemplos desta combinação do IV com técnicas quimiométricas, destacam-se estudos para determinar mudanças dos constituintes químicos em tomates (SLAUGHTER et al. 1996) e trabalhos envolvendo o controle de qualidade de medicamentos contendo diclofenaco de potássio (SOUZA & FERRÃO, 2006). Já Salomonsen et al. 2008 divulgaram seus estudos envolvendo a comparação de técnicas espectroscópicas (IV e RMN) na predição quimiométrica de substâncias. Deste modo, dentre as técnicas mais utilizadas em conjunto com a RMN e IV estão à análise exploratória dos dados, comumente representada pela PCA. 3.2- Análise Exploratória dos dados Em uma análise exploratória um conjunto de dados complexo é reduzido, pelo emprego de algoritmos matemáticos, de tal forma que sua interpretação seja mais simples e direta. Após sua aplicação, o que se tem são poucas variáveis provenientes do conjunto de dados originais, originando para possíveis correlações entre as amostras. Estas análises são utilizadas na quimiometria, sendo consideradas úteis em análise exploratória para a extração do máximo de informação contida nos dados. Os dados são convertidos na forma de uma matriz (tabela de dados). As N linhas da matriz representam as amostras (ou objetos), onde cada valor corresponde a uma propriedade medida para uma amostra específica, enquanto que as p colunas são variáveis que correspondem a uma propriedade medida para cada amostra. No caso dos dados de RMN e IV, as variáveis são os deslocamentos químicos e os números de onda, respectivamente. Cabe ressaltar que antes de proceder à análise exploratória dos dados é feita uma inspeção visual para verificar problemas de variação da linha de base, sobreposição de bandas e ruídos. A seqüência básica da análise exploratória de dados experimentais por métodos quimiométricos está ilustrada na Figura 13, pág. 31. 30

Figura 13. Esquema da seqüência utilizada na análise exploratória dos dados experimentais com a utilização da RMN. 3.3- Pré- processamentos dos dados Antes de aplicar a análise multivariada a dados numéricos, é necessário efetuar algum tipo de pré-processamento nos dados originais. Estes pré-processamentos são utilizados para reduzir fontes equivocadas de variação no sentido de otimizar a matriz de dados, principalmente para correção das linhas de base em amostras, muito comum em espectros de RMN. (MANLY, 2008; BEEBE, 1988). Existem dois tipos básicos de pré-processamento, dependendo de como são operados. A ferramenta de pré-processamento por colunas, opera sobre as variáveis, enquanto que ferramenta de pré-processamento por linhas opera sobre as amostras. Dentre os tipos de pré-processamento por linhas está a normalização e a aplicação de derivadas. Já no préprocessamento por colunas destaca-se o autoescalamento. O processo de autoescalamento consiste em padronizar a escala de todas as variáveis para desvio-padrão igual a um. Deste modo assume-se que todas as variáveis possuem o mesmo peso para o modelo. 31

Diferentemente, o pré-processamento centrado na média somente conduz as variáveis à mesma média. A Figura 14, pág. 32 ilustra a diferenciação dos dois tipos de préprocessamento discutidos anteriormente. Na Figura 14a é apresentado 3 variáveis e, como pode ser facilmente observado, elas possuem tamanhos muito diferentes. Ao se aplicar o pré-processamento centrado na média colocamos todas as médias em zero (ver Figura 14b). Já na Figura 14c temos os dados autoescalados e o tamanho das variáveis é basicamente o mesmo. Figura 14. Exemplo de pré-processamento de dados para 4 variáveis fictícias: (a) dados originais, (b) dados centrados na média (média igual a zero) e (c) dados autoescalados (média igual a zero e desvio padrão igual a 1). As linhas horizontais representam as médias de cada variável. A normalização é feita dividindo cada valor original pela soma de todos os valores absolutos da medida, de tal forma, que todas as amostras fiquem em uma mesma escala (Figura 15, pág. 32). Normalmente sua utilização minimiza problemas de diferença de concentração. Figura 15. Representação de um conjunto de dados mostrando a influência da normalização. 32

Já a derivação é utilizada pra remover inclinações e desvios da linha de base. Como o cálculo das derivadas é feito a partir de diferenças entre valores de pontos adjacentes, a relação sinal/ruído torna-se pior com esse tipo de pré-processamento. Por isto, antes da diferenciação é comum aplicar-se aos dados algum tipo de suavização. O algoritmo mais utilizado para este fim é o de Savitzky-Golay. 3.4- Análise de Componentes Principais A análise por componentes principais é um dos métodos mais comuns empregados na análise de informações (FERREIRA, 2002), sendo principalmente utilizada pela sua capacidade de compressão dos dados em função da existência de correlação entre diversas variáveis medidas. Quando aplicamos um algoritmo de PCA num conjunto de variáveis, como por exemplo, em dados de RMN, o conjunto original destas variáveis é substituído por um novo conjunto de variáveis denominado de Componentes Principais (PCs). A principal característica deste novo conjunto é a ortogonalidade, porém o mesmo é facilmente reconstruído a partir da combinação linear das variáveis originais (espectros). Como vantagem, o novo conjunto de variáveis (PCs), geralmente concentra a maior parte da informação (variância) em poucas variáveis, diminuindo assim a dimensionalidade dos dados, sem perda significativa da informação. Em uma análise de componentes principais, o agrupamento das amostras define a estrutura dos dados através de gráficos de scores e loadings, cujos eixos são componentes principais, nos quais os dados são projetados. Deste modo, a explicação do que cada componente representa é obtido através dos loadings, ou seja, os pesos que são dados as variáveis originais. Já com o gráfico de scores é possível verificar o agrupamento das amostras que são semelhantes entre si. 33

Objetivos 34

4- Objetivos Os objetivos do trabalho foram: Desenvolver uma metodologia que permita a distinção entre um feijão convencional específico e seu genótipo geneticamente modificado de acordo com a modificação da composição química, utilizando espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear em particular a técnica de HR-MAS; Avaliar duas linhagens de feijão, nomeadas como BRS Pontal 5.1 e Pérola 5.1, derivadas de cultivares de grande aceitação comercial, BRS Pontal e Pérola, que receberam o transgene através de cruzamentos e quatro retrocruzamentos com Olathe 5.1; Caracterizar os metabólitos primários e secundários presentes nos cultivares de feijão, utilizando técnica de RMN 1D e 2D (ghsqc e ghmbc); Avaliar a variação da composição química dos feijões cultivados em casa de vegetação com feijões semeados em campo, em função de seu tempo de exposição a condições não controladas, como umidade, temperatura, dentre outros; Estudar o perfil químico dos cultivares transgênicos cultivados em casa de vegetação de acordo com seus tempos de exposição ao ar (oxidação destes cultivares). Realizar um estudo comparativo entre as técnicas de RMN de 1 H HR- MAS e Infravermelho avaliando o potencial de cada uma delas. 35

Experimental 36

5- Experimental 5.1 Amostras Todas as amostras de feijão foram cedidas pela Estação Experimental da Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás-GO, no segundo semestre de 2009. As sementes foram armazenadas na câmara de sementes em temperaturas entre 15-18 C e umidade relativa em torno de 50%. Destaca-se que para manipulação de OGM s nos laboratórios da Embrapa e de RMN possuem autorização da CTNBio. 5.1.1 Amostra de casa de vegetação Sementes de feijão geneticamente modificadas, assim como suas parentais convencionais foram cedidas pela Embrapa Arroz e Feijão (Tabela 7, página 37). As plantas geneticamente modificadas e sua linhagens parentais (espécime convencional) foram cultivadas lado a lado e nas mesmas condições experimentais, afim de garantir que possíveis diferenças na composição química destes feijões sejam devido ao evento transgênico. Cabe ressaltar que os cultivares Pérola 5.1 e BRS Pontal 5.1 foram originados a partir do cultivar Olathe 5.1, através de cruzamentos com seus respectivos parentais convencionais. Tabela 7. Amostras de casa de vegetação cedidas pela Embrapa Arroz e Feijão. Cultivar Origem genética Olathe Pinto Convencional Olathe 5.1 Transgênico Pérola Convencional Pérola 5.1 Transgênico BRS Pontal Convencional BRS Pontal 5.1 Transgênico 5.1.2 Amostras de campo Para verificar se o ambiente em que as plantas foram cultivadas poderiam influenciar os resultados, o cultivar Olathe Pinto e seu respectivo 37

geneticamente modificado, Olathe 5.1, foram cultivados sob condições de campo em três regiões distintas do Brasil, conforme mostrado na Figura 16, pág. 38. Figura 16. Cultivares transgênicos e convencionais produzidos em condições de campo em (Santo Antônio/GO), (Londrina/PR) e (Sete Lagoas/MG). 5.1.3 - Preparo das amostras para HR-MAS Para aquisição dos espectros de RMN HR-MAS, os embriões foram removidos das sementes e moídos em um almofariz com auxílio de nitrogênio líquido, até formar um pó. Vale destacar que a parte embrionária da semente foi escolhida devido a uma tendência do embrião em acumular a maior quantidade de informações químicas em eventos transgênicos. Em relação ao preparo das amostras no sentido de avaliação de uma possível mudança na composição química dos feijões transgênicos, as partes embrionárias, previamente pulverizadas, destes feijões, foram expostas ao ambiente (variáveis como: temperatura, umidade, pressão não controladas) por 30 e 60 dias consecutivos. Deste modo, aproximadamente 15 mg do embião já pulverizado, é acondicionado em um rotor de zircônio de 12 µl ou 50µL, seguido da adição 38