Guia Rápido de Bioinformática Antônio Augusto Fonseca Júnior 1
Sobre o autor Antônio Augusto Fonseca Júnior é farmacêutico formado pela Universidade Federal de Minas Gerais, especialista em Bioética e Biotecnologia pela Universidade Federal de Lavras, Mestre em Ciência Animal e Doutor em Ciência Animal pela Universidade Federal de Minas Gerais. Já trabalhou como professor lecionando em disciplinas de Microbiologia, Biologia Molecular, Bioinformática, Farmacologia e Genética. Atualmente é responsável pelo Laboratório De Biologia Molecular do Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais (Lanagro/MG) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. 2
Edição 1 Edições Implementação de dados básicos para projeto de primers, Blast e Filogenia Edição 2 Dados se sequenciamento Edição 3 Erros de sequenciamento Edição 4 Melhoria dos protocolos para filogenia Edição 5 Análise por Restrição enzimática Edição 6 Noções de PCR e desenho de primers e sondas para PCR em tempo real Edição 7 Análise de pressão seletiva e protocolo para Mr. Bayes 3
Formatos O Guia Rápido de Bioinformática existe em dois formatos: O formato digital é vendido na Amazon.com.br. Caso encontre esse livro pirateado, ajude o autor e adquira por um precinho camarada. Todas as atualizações do formato digital são gratuitas. Para permitir uma atualização, simplesmente configure sua conta na Amazon para permitir isso. Vá em Sua Conta Gerencie seu dispositivo e conteúdo Configurações Atualização automática de ebooks. O formato impresso pode ser encontrado em www.perse.com.br. Infelizmente ele é atualizado com menor frequência e, por razões óbvias, as atualizações não são gratuitas. Mantenho suas versões disponíveis apenas devido aos pedidos de vários professores de bioinformática e algumas pessoas que preferem ter roteiros impressos. 4
Sumário Capítulo 1: A PCR... 7 Extração de Ácidos Nucleicos... 8 Extração por Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico... 9 Extração por coluna de sílica... 13 A Teoria da PCR... 15 Eletroforese... 17 Capítulo 2: Sequenciamento de Sanger... 23 Introdução... 23 Resolução de Problemas... 27 Análise do Scan... 27 Presença de Artefatos... 28 Presença de picos sobrepostos... 30 Picos sobrepostos após homopolímeros... 31 Sequência menor do que a esperada... 31 Sinal Fraco... 32 Falha no Sequenciamento... 33 Capítulo 3: Análise de Eletroferogramas... 34 Introdução... 34 Roteiro... 35 Capítulo 4: Bioedit... 39 Introdução... 39 Inserindo sequências... 40 Criando os Arquivos em FASTA... 41 Atalhos de teclado interessantes... 41 Alinhamento no BioEdit... 42 Outras opções... 45 Capítulo 5: Desenho de Primers... 50 Introdução... 50 Parâmetros... 50 Alinhamento... 50 Desenho dos primers... 51 Roteiro... 52 Uso do Primer3 Plus... 52 Verificando especificidade in silico... 54 Capítulo 6: Restrição Enzimática in silico... 57 Roteiro para restrição in silico... 59 Capítulo 7: GenBank... 61 Introdução... 61 Roteiro... 62 Parte I - Nucleotídeos... 62 5
Parte II - Número de Acesso... 64 Parte III - Genes... 68 Parte IV - Genomas... 69 Capítulo 8: Blast... 71 Introdução... 71 Roteiro... 78 Capítulo 9: Filogenia... 80 Introdução... 80 Escolha das Sequências... 80 A Análise De Dados Da Filogenia... 82 Alinhamento... 82 Modelo de Substituição... 83 Reconstrução da Árvore Filogenética... 86 Métodos de Distância... 86 Métodos Cladísticos... 88 Métodos Probabilísticos... 89 Avaliação Estatística Da Árvore... 89 A Árvore... 90 Enraizando Árvores... 92 Utilizando o MEGA 6.06... 95 Criando os Arquivos em Fasta... 95 Recuperando Sequências... 95 Encontrando o Melhor Modelo de Substituição... 100 Reconstrução da Árvore... 101 Modificando a Árvore... 103 Calculando Distâncias Genéticas... 105 Utilizando o Mr. Bayes... 112 Roteiro... 112 Preparando uma corrida simples... 113 Capítulo 10: Pressão Seletiva... 119 Utilizando o Selecton... 120 Inserindo os Dados Iniciais... 120 Inserindo Opções Avançadas... 121 Resultados... 123 Referências... 126 6
Capítulo 1: A PCR A versão original desse livro não tratava de uma das principais ferramentas do laboratório de biologia molecular. O objetivo era voltar o livro principalmente para os trabalhos de bioinformática, no entanto, o uso da PCR muito frequente para se gerar as sequências de DNA e RNA que serão estudadas mais tarde. Esse capítulo pretende resumir brevemente o que é a PCR e quais os passos necessários para executá-la. Estudantes da área da biologia mais experientes no laboratório podem considerá-lo desnecessário, mas aqueles que ainda estão no início da graduação ou vindos de outras áreas sem currículo básico de biologia molecular podem necessitar da pequena revisão a seguir. PCR é uma sigla para Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction). A ideia é antiga, sendo original da década de 80 quando se percebeu que seria possível gerar grandes quantidades de partes específicas do DNA a partir de uma enzima e de reagentes que pudessem delimitar a região desejada. O objetivo dessa reação é, portanto, gerar muitas cópias de uma molécula de uma maneira exponencial. Essas cópias são de uma região específica e delimitada do DNA que será utilizado como molde. A própria PCR é uma reação enzimática que ocorre dentro de um microtubo. Geralmente o volume total não passa de 50 microlitros, sendo mais comum pode volta de 20-25 microlitros. Além dos próprios eventos bioquímicos que ocorrem nesse tubo, são necessárias ainda outras duas etapas. Antes de se adicionar todos os reagentes da PCR no tubo, é necessário extrair o DNA da amostra a ser utilizada. Essa é uma etapa essencial para o sucesso da reação. Finalizado esse processo, a amostra é adicionada ao tubo. Feito isso, os resultados devem ser visualizados. A PCR convencional necessita de ter os resultados da amplificação do DNA visualizados em um gel de agarose, enquanto outros tipos como a PCR digital e a PCR em tempo real têm os resultados demonstrados em computadores acoplados às máquinas. 7
Figura 1: Microtubos utilizados na PCR Figura 2: Termocicladores. Esses são os equipamentos normalmente utilizados onde as reações de PCR são colocadas para serem submetidas às variações de temperatura necessárias para que a reação ocorra. Cada máquina pode realizar, em média, até 96 reações por vez, mas existem outras com capacidades muito maiores como 384 reações. Extração de Ácidos Nucleicos A extração de ácidos nucleicos é a primeira etapa da PCR e deve ser praticamente considerada como um conjunto com a reação tamanha a importância desse processo para o sucesso do experimento. Diferentes amostras exigem diferentes extrações, apesar de cada vez mais as empresas lançarem kits que funcionam em uma vasta gama de tecidos ou células de microrganismos variados. 8
O tipo mais simples de extração é a fervura de colônias de bactérias para PCRs mais simples que visam, por exemplo, apenas identificação genética da espécie pesquisada. Uma simples colônia fervida a ponto de inativar a bactéria rende DNA suficiente para muitas PCRs. Obviamente, o método varia conforme a espécie, mas existem processos validados dessa extração seguida de PCR. Outros exemplos de extração são descritos a seguir. Todas costumam passar por um processo básico de preparação da amostra para quebra do tecido antes do início da separação do DNA da porção proteica/lipídica. Existem métodos como a quebra física ao se adicionar nitrogênio seguido de maceração ou a destruição completa do tecido em equipamentos específicos para maceração. O método mais comum visto nos laboratórios é o uso de Proteinase K. Essa enzima é uma protease de amplo espectro. Devido à sua falta de especificidade ao clivar ligações peptídicas, pode ser utilizada em diversos tecidos. A enzima tem preferência para digestão de proteínas a partir de aminoácidos hidrofóbicos, sendo ativada pelo íon Ca 2+. O ph ótimo é 8,0, porém ainda age em uma faixa de 4,0 a 12,0. A utilização de um tampão adequado (30 mm EDTA, 30 mm Tris Cl; 800 mm cloreto de guanidina; 5% Tween 20; 0.5% Triton X-100) pode aumentar em até 300% sua atividade. Extração por Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico A extração por Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (F/C/A) já foi bastante comum nos laboratórios, porém foi substituída por kits mais práticos. Suas vantagens são o preço e a quantidade de ácidos nucleicos obtidos, porém o processo é trabalhoso, usa reagentes tóxicos e está sujeito a contaminações por proteínas e sais. A solução obtida após a digestão enzimática do tecido é adicionada a uma mistura de fenol tamponado saturada (72% fenol, 28% água). A densidade dessa solução é um pouco maior do que a da água, o que garante que, após a centrifugação, a fase lipídica e 9
proteica fique na parte inferior do tubo e a fase aquosa (contendo ácidos nucleicos) na parte superior (Figura 3). Essas posições podem ser invertidas caso a solução aquosa contenha quantidade muito grande de sais, o que alterará as densidades. Figura 3: Solução da extração F/C/A após centrifugação. 1. Fase aquosa contendo ácidos nucleicos. 2. Interfase contendo proteínas parcialmente desnaturadas, DNA (caso apenas RNA esteja sendo extraído e o fenol esteja com ph mais ácido). 3. Fase orgânica com fenol, proteínas, lipídeos. O fenol misturado ao clorofórmio é melhor para a desnaturação de proteínas do que qualquer um desses dois reagentes separados. O álcool isoamílico desfavorece a formação de espuma. O uso de fenol puro também tem a desvantagem de reter parte da solução aquosa (cerca de 15%). A presença do clorofórmio reduz esse efeito. A separação das fases pela centrifugação ocorre devido à densidade diferente das mesmas. A água tem densidade de 1.00 g/cm 3, o fenol 1,07 g/cm 3 e o clorofórmio 1,47 10
g/cm 3. A presença do clorofórmio permite uma separação mais nítida das fases com uma interfase. O DNA tende a permanecer na fase aquosa por ser um polímero polar, pois a água é mais polar do que a fase F/C/A. As proteínas possuem regiões hidrofóbicas e hidrofílicas. As regiões hidrofóbicas interagirão com o fenol causando precipitação de formando uma interfase esbranquiçada que nunca deve ser pipetada. Os lipídeos tenderão a permanecer na fase F/C/A. A permanência do DNA na fase aquosa depende do ph do fenol. Quando o ph está entre 7,5-8,0, os fosfatos permanecerão com carga negativa. Caso o ph seja reduzido (por volta de 4,0-5,0), as cargas negativas do DNA (principalmente fragmentos maiores) serão diminuídas, causando sua precipitação para a interfase. Esse fenômeno pode ser usado para a extração do RNA. Por ser mais ácido (e mais difícil de diminuir sua carga negativa), o RNA ainda permanecerá na fase aquosa, livre de proteínas, DNA e outras substâncias. O DNA será posteriormente precipitado após lavagens com etanol para a remoção de sais. A primeira lavagem ocorre com Etanol em alta concentração (95%) e na presença de um sal. O etanol é muito menos polar do que a água. Adicioná-lo a solução diminui a atração dos grupos fosfatos que permitem a solubilização do DNA. Assim o DNA interagirá com o sal (como Na +, NH + 4 ou Li + ) também adicionado e tenderá a precipitar. Em outra etapa, adiciona-se etanol 70% para precipitar o DNA ao mesmo tempo em que se diminui a concentração de sais. Cuidados na extração F/C/A 11
Cuidado se a solução fenólica estiver rosada, POIS é indicativo de oxidação, o que pode quebrar o DNA e degradar o RNA. É preciso haver um antioxidante para evitar que isso ocorra com frequência. Sempre use luvas e jalecos. O fenol é irritante para as mucosas e pode ser fatal se ingerido ou inalado em grandes quantidades. Deve-se agir com a cautela adequada ao utilizá-lo. Dedique as pipetas exclusivamente para extração de DNA e RNA e não as utilize no preparo do mix de PCR. Protocolo simples de extração F/C/A O protocolo a seguir é um método simples para se obter grandes quantidades de DNA utilizando-se o método F/C/A. O padrão da metodologia é mais trabalhoso e extenso, porém o descrito a seguir é bastante útil para obtenção rápida dos ácidos nucleicos a partir de bactérias ou tecidos. Reagentes Tampão TE ph 8,0 Fenol tamponado Solução F/C/A (50%/48%/2%) utilizar fenol saturado ph 8,0. Álcool etílico 95% Álcool etílico 70% Acetato de amônio 7,5 M 12
Protocolo 1. Adicionar ao tubo com solução de células lisadas volume igual de F/C/A. 2. Agite fortemente, preferencialmente utilizando um vórtex. 3. Centrifugar a temperatura por 5 min a 700 g. 4. Coletar a fase sobrenadante e transferir para outro tubo. 5. Adicionar o dobro de volume de álcool etílico 100% e metade do volume de acetato de amônio 7,5 M. 6. Centrifugar a 90% da velocidade máxima da centrífuga. 7. Remover o sobrenadante gentilmente. 8. Adicionar 700 µl de álcool etílico 70%. 9. Centrifugar a 90% da velocidade máxima da centrífuga. 10. Remover o sobrenadante gentilmente. 11. Secar por dez minutos. 12. Ressuspender o pellet com TE ph 8,0. Extração por coluna de sílica As extrações por kits a base de centrifugações em colunas de sílica são comuns hoje em dia. O método se baseia na ligação do ácido nucleicos à fase sólida de sílica seguida de lavagens para limpeza de íons. 13
O processo é simples e rápido, ocorrendo em menos de quinze minutos (dependendo da agilidade do operador e do número de amostras). Após a lise das células, como explicado anteriormente, o material é adicionado a uma solução tampão de ligação juntamente com etanol. A mistura das células lisadas, etanol e solução de ligação será adicionada a um tubo contendo uma fase sólida de sílica. O DNA é absorvido pela sílica quando está em soluções com alta concentração de íons e ph 7. O sódio agirá como uma ponte que atrai a carga negativa do fosfato do DNA, além de quebrar as ligações de hidrogênio na água (Figura 4). O tubo será centrifugado e o material coletado será descartado. A coluna de sílica conterá o DNA e será colocada em outro tubo (há a possibilidade de se aproveitar o tubo anterior). Agora serão realizados dois processos de lavagem com tampões específicos para retirar o excesso de sais (um inibidor de PCR). Ao final, convém fazer centrifugar mais uma vez sem adição de tampão para terminar essa remoção. O passo seguinte é adicionar a solução de eluição que aumentará o ph na sílica, desprendendo o DNA para que seja coletado em um tubo próprio. Figura 4: Coluna de sílica com representação da ponte de ligação dos íons de sódio entre a sílica e o DNA. A sílica normalmente está ligada à água por pontes de hidrogênio, no entanto, em altas concentrações iônicas, essa ligação é desestabilizada. 14
A Teoria da PCR A técnica de PCR foi um dos grandes inventos da Biologia Molecular, transformando os processos laboratoriais como poucas vezes ocorreu na história da ciência. É hoje uma das mais utilizadas nas mais variadas áreas, desde a pesquisa a métodos de diagnóstico. O fundamento da técnica é a amplificação específica e exponencial de regiões do genoma ou de moléculas de RNA utilizando pares de iniciadores (primers) para delimitar os pontos de interesse. Os reagentes básicos de uma PCR são: DNA polimerase, dntp (os quatro nucleotídeos; adenina, citosina, timina, guanina), cloreto de magnésio (MgCl 2 ), iniciadores (oligonucleotídeos iniciadores ou primers), tampão, água e o DNA molde obtido em processo de extração. Todos esses reagentes devem ser misturados em um tubo para que a reação ocorra. A DNA polimerase é a enzima responsável por catalisar a reação, adicionando nucleotídeos à fita nascente de DNA. A mais conhecida e utilizada delas é a Taq polimerase, derivada da bactéria Thermus aquaticus. Essa enzima é utilizada por ser termoestável, isto é, resiste às altas temperaturas em que a PCR ocorre. Sem esta estabilidade, seria necessário trocá-la a cada passo. É importante lembrar que a enzima estabilidade da enzima ocorre por determinado tempo, ocorrendo desgaste durante o processo. Os dntps são os quatro nucleotídeos (adenina - datp, citosina - dctp, guanina - dgtp e timina, dttp) que serão utilizados no processo de formação da nova fita de DNA. Deve haver cada um deles em solução e é importante que estejam sempre com os fosfatos que serão utilizados como energia a ligação de um nucleotídeo a outro pela DNA polimerase. O termo dntp significa desoxinucleotídeo trifosfato. Dois desses três fosfatos serão perdidos no processo de ligação de um nucleotídeo a outro realizado pela DNA polimerase no momento de extensão da fita de DNA em formação. 15