Engenharia genética - Capacidade de manipular ácidos núcleicos de forma bem definida e controlada. As ferramentas que o permitem são as enzimas capazes de actuarem sobre ácidos núcleicos. Enzimas de restrição (endonucleases) - Reconhecem pequenas sequências de DNA e "cortam" DNA de dupla cadeia nos locais ou próximo dos locais de reconhecimento. Aplicações Estabelecimento de mapas de restrição Fragmentação de DNA para posterior análise noutras técnicas Geração de fragmentos passíveis de serem clonados em vectores apropriados Produção de fragmentos de DNA para serem usados como sondas em diferentes técnicas Enzimas de restrição Tipo I - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Têm sequências de reconhecimento específicas, mas cortam de forma inespecífica dentro da sequência de reconhecimento. Tipo II - Apenas possuem capacidade de corte. A metilação é feita por proteínas diferentes. Cortam sequências específicas de forma também específica. Tipo III - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Cortam sequências específicas de forma também específica. Enzimas tipo II - As mais utilizadas em biologia molecular. Existem mais de 600! Os locais de reconhecimento têm, quase sempre, 4 a 6 nucleótidos e são geralmente caracterizados por "dyad symmetry" ( a sequência 5'-3' de uma das cadeias é semelhante à da cadeia complementar. GGATCC CCTAGG 1
Corte no eixo de simetria - "blunt ends" Corte "em escada" - "sticky ends" "Isoschizomers" - Enzimas que reconhecem a mesma sequência de DNA. Terminações compatíveis - Terminações idênticas de DNA produzidas por enzimas diferentes. Fragmentos de DNA com terminações compatíveis podem ser ligados entre si. Enzimas de restrição - Têm origem em células procarióticas, onde são usadas para degradar DNA exógeno (especialmente DNA bacteriófago). Os organismos que produzem enzimas de restrição protegem o seu próprio DNA por metilação das sequências de reconhecimento das enzimas. E. coli possui duas metilases de sequências específicas: dam - Metila adenina na sequência GATC dcm - Metila a citosina interna da sequência CC(A/T)GG DNA de mamíferos possui metilação em pares 5'-CpG-3', especialmente em "CpG islands" da região promotora de genes. Actividade "star" de enzimas de restrição - Actividade inespecífica de algumas enzimas de restrição quando as condições de reacção não são as apropriadas, ou o tempo de reacção é demasiado. Os fragmentos de DNA originados por esta actividade possuem as terminações correctas. 2
Mapas de restrição Permitem determinar com precisão os diversos locais de restrição presentes num fragmento de DNA, gene ou na totalidade do genoma de um organismo. São ferramentas essenciais para desenhar estratégias de manipulação de DNA. 3
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Mapa de restrição de um plasmídeo de estrutura desconhecida. Considere o plasmídeo circular pproto com 9 kb. A digestão com a enzima A ou a enzima B originou um fragmento de 9 kb. A digestão simultânea com as enzimas A e B originou dois fragmentos - 4 kb e 5 kb. A enzima C origina três fragmentos - 1 kb, 2 kb e 6 kb A digestão simultânea com as enzimas A e C origina 4 fragmentos - 1 kb, 1,5 kb, 2 kb e 4,5 kb. 5
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Mapa de restrição de um insert de DNA incluído num plasmídeo de estrutura conhecida. Considere o plasmídeo circular pcdna, com 4363 bp, onde é clonado (PstI) um insert de DNA de tamanho desconhecido. O local de restrição PstI dista 754 bp do local EcoRI. A digestão com PstI origina dois fragmentos 4363 bp e 1000 bp. A digestão com EcoRI origina três fragmentos 300, 900 e 4163 bp. Quando a digestão é completa os produtos de digestão têm que estar presentes em quantidades equimolares - A intensidade das bandas (coradas por brometo de etídio) é proporcional ao tamanho dos fragmentos. 7
A soma do tamanho dos fragmentos de restrição é igual ao tamanho do fragmento de DNA original. Soma inferior ao esperado - Co-migração de fragmentos (bandas com intensidade superior à esperada). - Produção de fragmentos de tamanho reduzido, não visíveis no gel de electroforese. Soma superior ao esperado - Digestão incompleta - Contaminação com outros DNA's Mapa de restrição parcial. Um BAC clone de DNA genómico é digerido com a enzimas de restrição A e o fragmento resultante de 5 kb isolado. Após marcação com 32 P por end-labeling o fragmento é digerido e separado por electroforese. Três bandas são obtidas 2.7, 1.3 e 1.0 kb. 8