CONTRIBUIÇÃO DAS MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE DE APRENDIZAGEM NA MATEMÁTICA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO CONTRIBUIÇÃO DAS MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE DE APRENDIZAGEM NA MATEMÁTICA ORIENTADA: Gabriela Chadid Salazar ORIENTADORA: Profª Drª Maria Raquel Santos Carvalho Belo Horizonte - MG Julho de 2013

II GABRIELA CHADID SALAZAR CONTRIBUIÇÃO DAS MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE DE APRENDIZAGEM DA MATEMÁTICA Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Genética. Orientadora: Profª. Drª. Maria Raquel Santos Carvalho Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte - MG 2013

III Dedico este trabalho ao meu eterno anjo BÁRBARA CHADID SALAZAR

IV AGRADECIMENTOS O meu muito obrigada. À Deus, por todas as bênçãos em minha vida e por permitir essa conquista; À professora Dra. Maria Raquel Santos Carvalho, pela oportunidade, confiança, apoio e principalmente a orientação e os ensinamentos para a concretização deste; À colega de trabalho, amiga e exemplo Izinara Rosse, pela dedicação, ajuda, explicações, correção da dissertação, por cada palavra de apoio, carinho, incentivo e principalmente por acreditar em mim; Aos colegas do LGHM, Pablo, Fernanda, Laura, Pedro, Luana, Paula e principalmente Aline, pela ajuda e apoio no dia a dia. Em especial à Marlene, que desde o primeiro dia de laboratório tanto me ajudou e apoiou, e que com suas doces palavras me deu força nos momentos difíceis; Aos alunos do Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase pelas coletas e os testes realizados para triagem e diagnóstico neuropsicológico das amostras. Em especial à Flávia Neves pela ajuda na compreensão dos testes; À todos os professores, colegas e amigos da pós-graduação pelos ensinamentos e que de alguma forma contribuíram para o meu aprendizado. Em especial Michelle Alves, Raiana Silva e Raphael Steinberg; Aos colegas do LBMM em especial a Isa e Anderson e à Elisangela Monteiro e Mariana Eduarda Lopes da Fiocruz, pela amizade e ajuda na genotipagem das amostras; À Silvia Costa e Carla Rosenberg do Instituto de Biociências, USP, pela ajuda com a análise do acgh; Aos membros da Banca Examinadora por aceitarem meu convite; À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro; À minha família, em especial meus pais pelo amor incondicional. À minha mãe pelo carinho, paciência, incentivo, apoio, ajuda, por nunca me deixar desistir e por ser meu alicerce; À minhas amigas Rê, Lívia, Pri e Jú pelo apoio e entenderem os momentos de ausência; Em especial ao Thiago Romão por compartilhar cada momento difícil, pela compreensão, paciência, incentivo e por tornar meus dias mais alegres.

V Nunca existiu uma grande inteligência sem uma veia de loucura. Aristóteles

VI SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA VIII IX X 1 INTRODUÇÃO 14 1.1 A dificuldade de aprendizagem da matemática 14 1.1.1 Modelos neuro-cognitivos da DAM 15 1.1.2 Evidências para um componente genético 17 1.1.3 A DAM em síndromes genéticas 18 1.1.4 Estudos moleculares 20 1.2 Estratégia de investigação das bases genético-moleculares em desenvolvimento pelo grupo de pesquisa 21 1.3 A técnica de MLPA 22 1.4 Justificativa e relevância 25 1.5 Objetivos 26 1.5.1 Objetivo geral 26 1.5.2 Objetivos específicos 27 2 MATERIAIS E MÉTODOS 28 2.1 Aspectos éticos 28 2.2 A amostra 28 2.2.1 Amostra ambulatorial 28 2.2.2 A amostra de base populacional 28 2.2.3 Triagem pelo TDE 29 2.2.4 Testagem neuropsicológica e cognitiva 29 2.3 Sistemática de classificação dos pacientes 31 2.4 Métodos moleculares 33 2.4.1 Extração de DNA 33 2.4.2 A técnica MLPA 33 2.4.3 Analise dos resultados 36 2.5 Confirmação dos resultados 37 3 RESULTADOS 40 3.1 Padronização da MLPA 40 3.1.2 Redução do protocolo original 40 3.1.3 Validação do kit P245-A2 41 3.2 Genotipagem por MLPA 43 3.3 Confirmação dos resultados 45 3.3.1 Técnica MLPA 45 3.3.2 Técnica de array-cgh 45

VII 4 DISCUSSÃO 48 4.1 Padronização da MLPA 48 4.1.1 Avaliação do desempenho da técnica 48 4.1.2 Redução do protocolo original 48 4.1.3 Validação do kit P245-A2 49 4.2 Genotipagem por MLPA 49 4.3 Confirmação dos resultados 52 4.4 Contribuição das síndromes de microdeleção para a DAM 53 5. PERSPECTIVAS 54 6. CONCLUSÕES 55 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56 ANEXO 1 - APROVAÇÃO PELA COEP/UFMG 61 ANEXO 2 - TCLE 63 ANEXO 3 - PROTOCOLO ADAPTADO PARA A TÉCNICA DE MLPA 67

VIII LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Modelo neurocognitivo do Código Triplo 15 Figura 2 - Hipótese dos genes generalistas 16 Figura 3 - Redes de interação 17 Figura 4 - Constituição dos oligonucleotídeos das sondas da MLPA 23 Figura 5 - Etapa de anelamento e ligação da MLPA 23 Figura 6 - Etapa de ligação da MLPA 23 Figura 7 - Etapa de amplificação da MLPA 24 Figura 8 - Eletroferograma para interpretação dos resultados finais da MLPA 24 Figura 9 - Estratégias de avaliação utilizadas e grupos de estudo 32 Figura 10 - Ciclo utilizado na MLPA para amplificação dos fragmentos 36 Figura 11 - Gráficos de padronização da técnica de MLPA 41 Figura 12 - Gráfico de validação da MLPA com controles positivos do kit P245-A2 42 Figura 13 - Gráfico de validação da MLPA com os controles internos 43 Figura 14 - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat 44 Figura 15 - Ideograma do cromossoma 5 46 Figura 16 - Gráficos para confirmação da deleção do indivíduo 2761 46 Figura 17 - acgh para confirmação da deleção do indivíduo 2761 47 Figura 18 - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5 51 Figura 19 - Imagem do gene CLPTM1L e sonda do kit SALSA MLPA P245-A2 52

IX LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Tarefas de avaliação cognitiva e domínios avaliados 30 Tabela 2 - Tarefas de avaliação neuropsicológica e domínios avaliados 30 Tabela 3 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-A2 34 Tabela 4 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-B1 38 Tabela 5 - Descrição do kit SALSA MLPA P070-B2 39 Tabela 6 - Descrição das sondas da síndrome Cri du Chat dos kits de MLPA 44

X LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA acgh Array-Based Comparative Genomic Hybridization APA American Psichiatric Association CCDC127 Coiled-Coil Domain Containing 127 CID Classificação Internacional Das Doenças CLPTM1L Cleft Lip and Palate Transmembrane Protein 1-Like COEP Comitê de Ética em Pesquisa CRR9 Cisplatin Resistance-Related 9 DAM Dificuldade de Aprendizagem da Matemática DD Fragmentos de Controle de Desnaturação de DNA (MLPA) DI Deficiência Intelectual DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th DNA Desoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico) DNAH5 Dynein, Axonemal, Heavy Chain 5 DQ Fragmentos de Controle de Quantidade de DNA (MLPA) EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético FISH Fluorescence In Situ Hybridization FMR1 Fragil X Mental Retardation GWAS Genome Wide Association Study Kb Kilobases LGHM Laboratório de Genética Humana e Médica Mb Milhões de Pares De Bases MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information NSD1 Nuclear receptor binding SET Domain protein 1 ng Nanograma NGRL National Genetics Reference Laboratory nm Nanomol OMIM Online Mendelian Inheritance in Man pb Pares de Base PCR Polymerase Chain Reaction QI Quociente de Inteligência qpcr PCR quantitativa SEMA5A Semaphorin-5A SNP Single Nucleotide Polymorphisms SVCF Síndrome Velocardiofacial

XI SWB TCLE TDE TE TERT UFMG λ μl Síndrome de Williams-Beuren Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Teste de Desempenho Escolar Tris-EDTA Telomerase Reverse Transcriptase Universidade Federal de Minas Gerais Lambda Microlitros

XII RESUMO A dificuldade de aprendizagem da Matemática (DAM) é um transtorno cognitivo que afeta as habilidades aritméticas em cerca de 7% das crianças em idade escolar. Os impactos decorrentes do fracasso escolar na Matemática podem repercutir na autoestima, na empregabilidade e na renda. A DAM pode ser causada por fatores ambientais, como baixo nível sócio-econômico, má qualidade do ensino, deficiência intelectual, embriopatia fetal alcoólica, entre outros. Entretanto, há casos nos quais nenhuma outra etiologia ambiental pode ser identificada. Em função disto, sugere-se etiologia genética, multifatorial e heterogênea. Uma evidência de heterogeneidade vem do surgimento da DAM como endofenótipo de várias síndromes de microdeleções, como Síndrome de Velocardiofacial, Síndrome de Tuner, Síndrome do X frágil, Síndrome de Williams, Síndrome NF1, Síndrome de Sotos, entre outras. Há poucos estudos investigando a contribuição dessas e outras síndromes para o fenótipo DAM. Este é um estudo de base populacional, caso-controle, com o objetivo de averiguar a frequência de microdeleções/microduplicações intertisciais em crianças de idade escolar com DAM. A pesquisa foi previamente aprovada pela COEP/UFMG. A amostragem foi feita em duas etapas.a primeira, de rastreio, foi feita com o Teste de Desempenho Escolar (TDE) e teste de transcodificação numérica, aplicados em grupo na sala de aula. A segunda etapa foi uma testagem neuropsicológica completa. A amostra foi composta pelos grupos: Controle Normal Testado, (com TDE e toda a testagem neuropsicológica normal), DAM (TDE<P25 e QI>P15) e Controle Positivo (previamente diagnosticados com alguma das síndromes detectadas pelo kit de MLPA usado, mas não submetidos a testagem neuropsicológica). A extração do DNA foi realizada a partir de sangue periférico ou saliva, no Laboratório de Genética Humana e Médica da UFMG.Todas as crianças foram genotipadas com o kit SALSA MLPA P245-A2. Uma criança, cujos resultados foram alterados com este kit, foi também testada com os kit SALSA MLPA P070 e SALSA MLPA P245-B1 e pela técnica de hibridização genômica comparativa baseada em microarranjos (acgh) com um chip de 60K. Não foram identificadas alterações entre os 90 controles normais testados. Entre os 90 indivíduos com DAM, foi detectada uma microdeleção do cromossoma 5p, detectada pela sonda CLPTM1L. Uma outra sonda do cromossoma 5 presente no kit SALSA MLPA P245-A2 (TERT) assim como os demais métodos usados para confirmar e/ou avaliar a extensão desta deleção apresentaram resultados normais. Entretanto, nenhum destes métodos apresenta sondas se sobrepondo exatamente com a região da sonda CLPTM1L. Consequentemente, pode se tratar de uma deleção pequena ou de um artefato. Se confirmada, trata-se de uma microdeleção entre 70 bp (o tamanho da sonda usada na MLPA) e 70 kb (a distância entre os fragmentos com sinal positivo no acgh). Os resultados relatados aqui, ou seja, uma frequência de 0/90 microdeleções intersticiais entre os indivíduos com DAM(ou 1/90, caso se confirme a microdeleção em 5p), sugerem que o conjunto de síndromes de microdeleção detectadas pelo kit SALSA MLPA P245-A2 (incluindo as síndromes Velocardiofacial, de Tuner, de Williams, da neurofibromatose tipo 1, de Sotos, entre outras) não sejam etiologia frequente da dificuldade de aprendizagem da Matemática não-sindrômica. Palavras chave: genética, dificuldade de aprendizagem, dificuldade de aprendizagem da Matemática, discalculia do desenvolvimento, microdeleção intersticial, MLPA.

XIII ABSTRACT Mathematical learning disability (MLD) is a disorder that affects arithmetic cognitive abilities in about 7% of school-age children. The impacts of failure in mathematics can affect selfesteem, employability and income. The DAM can be caused by environmental factors such as low social and economical status, poor quality of education, intellectual disabilities, and fetal alcohol embryopathy, among others. However, there are cases in which no environmental etiology can be identified. Because of this, a multifactorial and heterogeneous etiologyhas been suggested. Evidence of heterogeneity comes from the emergence of MLD as endophenotype of several microdeletion Syndromes, such Velocardiofacial Syndrome, Tuner Syndrome, Fragile X Syndrome, Williams Syndrome, NF1 Syndrome, Sotos Syndrome, among others. There are few studies investigating the contribution of these and other syndromes for MLD phenotype. This study is a population based, case-control, aiming to ascertain the frequency of interstitial microdeletions/microduplications in school-age children with MLD. This study was approved by the Ethics in Research Committee of the Universidade Federal de Minas Gerais. Sampling was done in two stages. The first one was a school achievement test (TDE) and a numerical transcoding test. The second stage of sampling was a complete neuropsychological testing. The sample was composed by three groups: Normal controls (children with both normal school development and neuropsychological tests), MLD (children with TDE<P25 and IQ>P15) and Positive Control (children, who have been previously diagnosed with any of the syndromes detected by the kit used in MLPA. These children were not submitted to neuropsychological tests). DNA extraction was performed from peripheral blood or saliva. All children were genotyped with the SALSA MLPA kit P245-A2. One child, whose results with this MLPA kit were abnormal, was also tested using the kit SALSA MLPA P070, SALSA MLPA P245-B1, and an arraybased comparative genomic hybridization (acgh), with a 60K chip. No molecular changes were identified among 90 normal controls tested. Among the 90 individuals with MLD, one child presented a chromosome 5p microdeletion detected by the probe CLPTM1L. Another probe mapping to 5p TERT, produced normal results, as well as the kit SALSA MLPA P070, SALSA MLPA P245-B1, and the 60K acgh. However, none of these methods provides probe exactly the same region as SALSA MLPA kit P245-A2. Therefore, the deletion detected by CLPTM1L probe may be a small deletion or an artifact of the technique. If confirmed, this microdeletion pans less than 70 kb according to acgh results. The results reported here, a frequency of 0/90 interstitial microdeletions among individuals with MLD (or 1/90, considering the putative chromosome 5p microdeletion), suggest that the group of interstitial microdeletion syndromes detected by SALSA MLPA kit P245-A2 (which includes Velocardiofacial Syndrome, Tuner Syndrome, Williams Syndrome, NF1 Syndrome, Sotos Syndrome, among others) are not common etiologies of the non-syndromic MLD. Key words: genetics, learning disability, Math learning disability, developmental dyscalculia, interstitial microdeletion, MLPA.

14 1 INTRODUÇÃO 1.1 A dificuldade de aprendizagem da matemática As dificuldades de aprendizagem afetam cerca de 10% da população e possuem um papel fundamental nos resultados dos processos educacionais (BUTTERWORTH & KOVAS, 2013). Essa manifestação pode ser definida como uma desordem em um ou mais processo psicológicos básicos envolvidos na compreensão ou no uso da linguagem, falada ou escrita, que pode manifestar-se em uma habilidade incompleta para ouvir, pensar, falar, ler, escrever, soletrar, ou fazer cálculos matemáticos (FEDERAL REGISTER US, 1999). Dentre as desordens de aprendizagem mais comuns, está a dificuldade de aprendizagem na matemática (DAM), com uma frequência que varia de 3,5 a 6,5 % entre as crianças em idade escolar (BADIAN, 1983; SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; KOUMOULA et al., 2004). Apesar das divergências quanto a sua definição, de acordo com o Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Edition (DSM-IV, APA; 1994), a DAM é definida pela diferença entre o resultado dos testes de desempenho na Matemática e o desempenho esperado baseado na idade, inteligência e anos de escolarização. Entretanto, devem-se utilizar testes padronizados para a população em estudo, pois através dessa avaliação, é possível observar se o aluno está abaixo de um ponto de corte em relação a seus pares. A DAM pode ocorrer em função de diversos fatores, como carências nutricionais ou socioeconômicas de maneira geral, baixa qualidade do ensino, exposição a agentes teratogênicos, como o álcool, déficits sensório-motor, prematuridade e gemelaridade. Entretanto, há indivíduos com DAM nos quais os sintomas não podem ser atribuídos a quaisquer destes fatores (SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; BUTTERWORTH, 2005). Estes indivíduos apresentam múltiplos déficits cognitivos, afetando as funções necessárias à aquisição da Matemática (déficit de senso numérico, estimação de magnitude simbólica e não simbólica, subtizing, orientação especial etc). Por esses motivos essa desordem é classificada, por diversos autores, como um transtorno de aprendizagem heterogêneo (GEARY, 1993; MAZZOCO & MYERS, 2003; BUTTERWORTH, 2005; RUBINSTEN & HENIK, 2009). Considerando a heterogeneidade etiológica da DAM e sua natureza multifatorial, foi proposta a existência de substratos neurais distintos responsáveis pelos processamentos dos números. Dessa forma, alterações em uma ou mais redes neurais podem contribuir para os diferentes fenótipos de déficits cognitivos (RUBINSTEN & HENIK, 2009). Diversos estudos sobre o desenvolvimento cognitivo mostraram que essas crianças poderiam deixar de atingir padrões aceitáveis em importantes áreas do currículo, como a

15 alfabetização e aritmética (BUTTERWORTH, 2005). O fracasso escolar na Matemática pode gerar perda da autoestima, afetar na empregabilidade e na renda do indivíduo (JORDAN & LEVINE, 2009). 1.1.1 Modelos neuro-cognitivos da DAM Com o objetivo de explicar os mecanismos de cognição relacionados ao aprendizado da Matemática, foram propostos os modelos neuro-cognitivos, Esses modelos são importantes também porque permitem construir uma ponte entre o nível genético/neurobiológico e a expressão comportamental (HAASE, WOOD & WILMES, 2010). O Modelo do Código Triplo, desenvolvido por Dehaene (1992), é considerado o mais influente e validado para a compreensão da cognição matemática (DEHAENE & COHEN, 1995). Esse modelo prevê a existência de três sistemas interligados de representação mental numérica: duas formas de representação simbólica a representação numérica visual arábica (ex: 3) e a representação numérica verbal (ex: três) e uma representação analógica, aproximativa e não simbólica (ex: ), conforme demonstrado na figura 1. Figura 1 - Modelo neurocognitivo do Código Triplo CATEGORIAS DE REPRESENTAÇÃO MENTAL CÓDIGO VERBAL TRÊS CÓDIGO DE MAGNITUDE CÓDIGO VISUAL-ARÁBICO 3 Legenda - Modelo neurocognitivo do código triplo, com os três sistemas de representação mental numérica interligados: duas formas de representação simbólica a representação numérica visual arábica e a representação numérica verbal e uma representação analógica não simbólica Fonte: adaptado de Dehaene, 1992.

16 Outro modelo é a Hipótese de Genes Generalistas, que pressupõe que o conjunto dos traços cognitivos que fazem parte do fenótipo DAM seja poligênico. Neste caso, a maioria dos genes seria expressa por toda a extensão cerebral e não apenas em uma região específica. Além disso, esses genes poderiam ser modulados por mecanismos como a pleiotropia e epistasia (KOVAS & PLOMIM, 2006) (Figura 2). Um modelo etiológico geral interessante foi proposto recentemente por Butterworth & Kovas (2013). Este modelo busca integrar os níveis genéticos, neurais, cognitivo, e comportamental. Nesta rede de interação, pode haver diversos tipos de relações entre os níveis. Assim, um processo cognitivo de domínio geral e um processo cognitivo de núcleo específico podem ter efeitos sobre mais de um teste comportamental, e o desempenho no teste comportamental pode ser afetado por mais de um processo cognitivo. Além disso, um processo cognitivo pode depender do outro (por exemplo, a memória na atenção), e um comportamento pode causar efeito em outro (por exemplo, uma deficiência na interpretação da leitura pode prejudicar a resolução de problemas matemáticos) (Figura 3). A hipótese de um componente genético tem motivado uma séria de estudos investigando as bases genéticas da DAM. Figura 2 - Hipótese dos genes generalistas Legenda - Contraste das três hipóteses dos mecanismos de efeitos de um único gene no cérebro, associado a diversos processos cognitivos (pleiotropia). Esta imagem pode ser estendida através da substituição do único gene por múltiplos genes, para ilustrar o efeito poligênico. Fonte adaptado de Kovas & Plomim, 2006

17 Figura 3 - Redes de interação Legenda Modelo esquemático das relações entre os níveis de explicação (genético, neural, cognitivo e comportamental) seguindo a rede de modelo causal. Fonte: Adaptado de Butterworth & Kovas, 2013 1.1.2 Evidências para um componente genético Uma das principais abordagens utilizadas para a investigação de fenótipos complexos quando se desconhece a etiologia, é o estudo de agregação familiar (WILLCUTT et al., 2010). A agregação familiar pode surgir devido ao compartilhamento de genes e de fatores ambientais entre membros da família (FEITOSA & KRIEGER, 2002). Por exemplo, através da estimativa do risco relativo, lambda (λ), é possível relacionar a frequência de afetados nas famílias com o grau de parentesco e comparar a frequência do fenótipo na população em geral. Quanto maior for o valor de λ, maior é a agregação familiar, sugerindo um componente genético (BURTON, TOBIN & HOPPER, 2005). Agregação familiar tem sido descrita para a DAM em diversas populações e condições socioeconômicas, o que sugere um componente genético (BADIAN, 1983; GROSS-TSUR et al., 1996; SHALEV, 2000; BUTTERWORTH, 2005; MIRANDA, 2011).

18 Outra abordagem utilizada são os estudos com pares de gêmeos monozigóticos e dizigóticos. Esses estudos permitem separar fatores genéticos e ambientais responsáveis por doenças em humanos. Através da comparação de gêmeos monozigóticos criados em um mesmo ambiente ou em ambiente diferente é possível avaliar o efeito ambiental. Por outro lado, a comparação da frequência do fenótipo entre gêmeos monozigóticos e dizigóticos permite estimar a contribuição genética para o fenótipo (WILLCUTT et al., 2010). Os estudos de gêmeos com DAM mostraram haver tanto influência genética quanto ambiental, levando a proposição de um modelo de herança multifatorial (ALARCON et al., 1997; RUBINSTEN & HENIK, 2009; KOVAS et al., 2007). 1.1.3 A DAM em síndromes genéticas A compreensão dos mecanismos cognitivos subjacentes, que levam à DAM pode ser reforçada pelo estudo de síndromes genéticas e/ou ambientais associadas a um desempenho ruim em Matemática, tais como, a Síndrome Fetal Alcoólica, Síndrome do X- frágil, Síndrome de Turner, a Neurofibromatose Tipo 1, Síndrome de Sotos, Síndrome de Williams-Beuren (SWB), Síndrome do Velocardiofacial (SVCF), Síndrome de Prader- Willi/Angelman, Síndrome de Gerstmann (KOPERA-FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; SOTOS, 1997; MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; PATERSON et al., 2006; SEMENZA et al., 2008; DeSMEDT et al., 2009; RUSCONI et al., 2009). A síndrome fetal alcoólica é resultante do uso do álcool durante a gravidez. A exposição do feto ao álcool durante o período pré-natal pode comprometer o desenvolvimento cerebral e desencadear prejuízos nas habilidades numéricas, o que gera atraso na aprendizagem da Matemática, além de problemas comportamentais (KOPERA- FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; KODITUWAKKU, 2010). Síndrome de Sotos pode ser causada por uma mutação de ponto ou deleção no gene NSD1 localizado na região 5q35. É caracterizada, dentre outros fatores, pelo crescimento excessivo durante a infância, macrocefalia e pode apresentar diferentes graus de dificuldade de aprendizagem. Além disso, podem ser observados atrasos no desenvolvimento cognitivo e motor, mais especificamente déficits na linguagem e Matemática e também problemas de coordenação motora visual (SOTOS, 1997; BAUJAT & CORMIER-DAIRE, 2007). Síndrome do X frágil é conhecida como a mais comum causa hereditária de retardo mental e dificuldade de aprendizagem ocorrendo em aproximadamente 1:4.000 nascidovivos. É caracterizada pela mutação do gene FMR1, localizado no cromossoma X e mulheres portadoras dessa síndrome apresentam maior dificuldade de aprendizagem na Matemática, quando comparada à leitura e escrita. Além disso, apresentam um

19 desempenho fraco em tarefas de rotação visual mental, mas não em todas as áreas de desempenho de habilidades visos-espaciais (MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; MURPHY & MAZZOCCO, 2008) A Síndrome de Turner é causada pela perda total ou parcial de um dos cromossomas X e ocorre em aproximadamente 1:1900 mulheres nascidas vivas. Embora tenham inteligência normal, os indivíduos tendem a apresentar desempenho relativamente mais baixo na Matemática, além disso, podem apresentar déficit de atenção e viso-espacial (MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; MURPHY & MAZZOCCO, 2008). A Neurofibromatose tipo 1 (NF1) é causada por uma mutação de um único gene no cromossoma 17 e pode ocorrer esporadicamente ou de forma familiar. É uma das mais comuns desordens de gene único que conduz a alterações do sistema nervoso central. A prevalência da NF1 é de aproximadamente 1:4.000 nascido-vivos e a dificuldade de aprendizagem é relatada em cerca de 30% a 56% dos indivíduos afetados. A NF1 tem sido descrita como uma desordem não verbal com base nas dificuldades visos-espaciais e visomotoras. São relatados déficits na Matemática, escrita e linguagem (MAZZOCCO et al., 1995; MAZZOCCO, 2001). A SWB é causada por uma microdeleção em 7q11.23, uma região contendo aproximadamente 28 genes. Trata-se de uma doença genética rara, que ocorre em aproximadamente 1:10.000 nascido-vivos (STRØMME, BJØRNSTAD & RAMSTAD, 2002). Suas características clínicas incluem várias anormalidades físicas, acompanhadas de DI leve a moderada e um perfil de personalidade específica. Os indivíduos afetados mantêm preservadas as habilidades de linguagem, apesar do déficit no processamento numérico e viso-espacial (PATERSON et al., 2006; O HEARN & LUNA, 2009). A SVCF resulta de uma microdeleção na região 22q11.2. É considerada a mais comum síndrome de microdeleção com uma prevalência de aproximadamente 1:6.000 nascido-vivos (DeSMEDT et al., 2009). Os indivíduos afetados frequentemente apresentam dificuldade de aprendizagem, sendo relatado o desempenho melhor na leitura e escrita do que na aritmética (WANG et al., 2000). Além disso, podem apresentar deficiência na representação de magnitude (DeSMEDT et al., 2007) As síndromes de Prader-Willi e Angelman podem ser causadas pela mesma deleção na região 15q11-q13. Os efeitos são dependentes da origem parental do cromossoma deletado. Na Síndrome de Prader-Willi, a grande maioria dos casos é devida à deleção no cromossoma de origem paterna. Na Síndrome de Angelman, a etiologia é mais complexa, podendo envolver deleção do cromossoma de origem materna (70-75% dos casos), dissomia uniparental materna do cromossoma 15 (20-25%), ou um defeito no centro de impressão genômica (2%) (BUTLER E THOMPSON, 2000). Ela tem uma prevalência estimada em cerca de 1:8000-1:16,000 nascido-vivos. Todos os pacientes sofrem algum

20 grau de comprometimento intelectual. Há relatos de dificuldades desproporcionais com tarefas matemáticas (BERTELLA et al. 2005; SEMENZA et al., 2008). A Síndrome de Gerstmann é um transtorno do desenvolvimento ou adquirido, causado pela lesão do giro angular esquerdo. Os indivíduos afetados apresentam déficits em quatro domínios funcionais distintos: cálculo, escrita, agnosia digital e orientação esquerdo-direita (RUSCONI et al., 2009). Considerando o fato de que a dificuldade da aprendizagem da Matemática faz parte do fenótipo cognitivo de diversas doenças genéticas, surgiram estudos com o objetivo de investigar as bases moleculares da DAM. 1.1.4 Estudos moleculares Compreender a etiologia da habilidade e da dificuldade da Matemática se pode revelar um passo essencial na luta contra o fracasso matemático, e, além disso, fornecer novos insights sobre o funcionamento do cérebro humano (DOCHERTY et al., 2009). O único estudo recente de associação do genoma completo (genome wide association study, GWAS) desenvolvido até o momento para habilidades e dificuldades matemáticas, detectou 10 polimorfismos de nucleotídeos únicos (single nucleotide polymorphism; SNPs) significativamente associados com o desempenho na Matemática em uma amostra de 2356 pares de gêmeos. Esses SNPs, quando combinados, foram responsáveis por 2,9% da variância fenotípica, sugerindo que as influências genéticas para as habilidades e dificuldades na Matemática sejam causadas por múltiplos loci de características quantitativas de pequenos efeitos através de um espectro de habilidades (DOCHERTY et al., 2010). Quatro dos dez SNPs de maior significância estatística, encontrados nesse estudo, foram localizados nos genes DNAH5 (dynein, axonemal, heavy chain 5), NRCAM (neuronal cell adhesion molecule), MMP7 (matrix metaloproteinases) e GRIK1 (receptor de glutamate ionotropic kainate 1). Estes genes se expressam no período do desenvolvimento e atuam nos processos de reparo de tecidos, distribuição celular e na formação das estruturas do sistema nervoso. Desse modo, podem contribuir como genes candidatos para as habilidades e dificuldades matemáticas. No entanto, seria necessário para confirmar estes achados, o sequenciamento das regiões exônicas, intrônicas, dos sítios de splicing, elementos regulatórios e sítios de ligação de moléculas de interesse, na busca de variantes causais, e estudos de expressão em nível de RNA e proteína. Dessa forma, vemos a necessidade de novos estudos a fim de identificar os genes ou variações genômicas envolvidas na DAM.

21 1.2 Estratégia de investigação das bases genético-moleculares em desenvolvimento pelo grupo de pesquisa Com o objetivo de investigar as bases moleculares da DAM estão sendo desenvolvidos alguns trabalhos pelo nosso grupo de pesquisa. Vianna (2011) avaliou a contribuição das microdeleções/microduplicações em 22q11.2 para o fenótipo DAM. Foram genotipadas, com a técnica de Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification; MLPA) 82 crianças com DAM e 130 controles normais, testados, pareados por sexo, idade e turma, da população escolar de Belo Horizonte. Foi observada uma frequência de microdeleções de 1:82 indivíduos com DAM/DAME sugerindo a SD22q11.2 como a etiologia genética mais comum identificada até o momento para dificuldade de aprendizado da Matemática. Miranda (2011), com o objetivo de investigar as bases genéticas da DAM, avaliou a história familiar de 34 crianças com DAM e 24 controles normais da amostra referida no parágrafo anterior. Foi encontrado agregação familiar e alguns heredogramas foram compatíveis com herança autossômica dominante com penetrância incompleta, outros com herança recessiva ligada ao cromossoma X. Em outros, ainda, havia apenas um afetado, não sendo possível inferir padrão de herança. Atualmente, está sendo desenvolvido um projeto pela mestranda Aline Aparecida Martins com o objetivo de analisar a frequência de pré-mutação e mutações completas, caudadas pela expansão do trinucleotídeo CGG na 5 UTR do gene FMR1 em indivíduos que apresentam DAM. Serão utilizados três métodos de diagnóstico, que foram selecionados com o intuito de que, juntos, fossem confiáveis e pouco onerosos e permitissem detectar mesmo alelos com expansão completa e fora da faixa de amplificação da PCR (Polymerase Chain Reaction) convencional. O primeiro método é baseado em uma PCR gene-específica, e permite identificar o alelo normal. O segundo método é uma tri-primer PCR, e permite a detecção dos alelos expandidos. O terceiro e último método é uma análise de metilação baseada em real-time PCR através do uso de TaqMan, que permite inferir o padrão expressão do gene FMR1 e é importante para a confirmação diagnóstica em meninos, quando as duas PCRs descritas acima não gerarem amplificação. As evidências apresentadas acima, em conjunto, sugerem que a DAM apresente uma base genética heterogênea. Neste trabalho, optamos por investigar a contribuição das síndromes de microdeleções/microduplicações intersticiais para o fenótipo DAM, através da MLPA.

22 1.3 A técnica de MLPA A técnica denominada MLPA é um método sensível, econômico, rápido e simples. Através da MLPA, é possível estudar mais de 50 sequências de ácidos nucléicos em uma única reação de PCR e assim detectar, simultaneamente, microdeleções e microduplicações de diversos genes ou mutações de ponto já conhecidas (SCHOUTEN et al., 2002; SØRENSEN et al., 2008). A MLPA foi descrita inicialmente por Schouten et al. (2002) e posteriormente comercializada pela empresa holandesa MRC-Holland. A técnica descrita é constituída por quatro passos: desnaturação, hibridização do DNA, reação de ligação, amplificação por PCR. E para interpretação dos resultados ainda são realizadas as etapas de separação dos produtos por eletroforese capilar e a análise dos dados pro programas específicos (SCHOUTEN et al., 2002).. Inicialmente, a amostra de DNA é desnaturada e em seguida hibridizada a uma mistura de sondas específicas para cada região. Cada sonda é formada por dois oligonucleotídeos sintéticos, que são contíguos ao se anelarem ao DNA. Esses oligonucleotídeos são compostos por três regiões: uma que se anela ao segmento de DNA de interesse, um segmento espaçador, que não possui homologia com o DNA alvo, e uma cauda de M13 (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005) (Figura 4). O oligonucleotídeo A tem tamanho variável de 50-60 pb e contém um marcador fluorescente (para reconhecimento à eletroforese capilar), seguido de uma sequência homóloga ao primer universal X (correspondendo à região pela qual esses primers universais serão anelados, posteriormente) (em preto; Figura 4 ), além da sequência de hibridização homóloga ao DNA alvo (em azul; Figura 4). O oligonucleotídeo B, com tamanho variável entre 60-450 pb, contém um fragmento homólogo ao primer universal Y (em cinza, Figura 4), seguido de uma sequência-coringa (com extensão diferente para cada sonda, o que definirá o tamanho do fragmento final) (em laranja, Figura 4) e também a sequência de hibridização homóloga ao DNA-alvo (em azul, Figura 4). Esses oligonucleotídeos, ao serem submetidos à temperatura de anelamento, hibridizam-se a sequências complementares no DNA alvo e, em seguida, são unidos por uma enzima DNA-ligase termoestável, formando um único fragmento (Figura 5) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005). Como resultado da reação de ligação, são obtidos fragmentos únicos, dispostos da seguinte forma: fluoróforo região de ligação ao primer universal sequência complementar ao DNA alvo sequência coringa região de ligação ao primer universal (Figura 6) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).

23 Figura 4 - Constituição dos oligonucleotídeos das sondas da MLPA Legenda- Oligo A, em verde o marcador fluorescente seguido de uma sequência homóloga ao primer universal X em preto e de azul a sequência de hibridização homóloga ao DNA alvo; Oligo B, em cinza o fragmento homólogo ao primer universal Y, seguido de uma sequênciacoringa em laranja, com extensão diferente para cada sonda, e também possui uma sequência de hibridização homóloga ao DNA alvo em azul Fonte: Modificado de Willis et al., 2012 Figura 5 - Etapa de anelamento e ligação da MLPA Legenda: Anelamento dos oligonucleotídeos na sequência de DNA e posterior ligação pela enzima DNA-ligase dependente de temperatura Fonte: Modificado de Willis et al., 2012 Figura 6 - Fragmento único resultado da reação de ligação da MLPA Legenda - Disposição do fragmento único resultado da reação de ligação, intermediada pela enzima ligase Fonte: Modificado de Willis et al., 2012

24 Em seguida, inicia-se a fase de amplificação. Nessa etapa, os fragmentos formados pelas duas sondas, agora unidas, são amplificados por PCR, utilizando-se o par de primers universais, que se anelam às sequências não homólogas, situadas nas duas extremidades dos produtos de ligação (Figura 7) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005). Ao final da MLPA, os produtos amplificados são separados e visualizados em eletroforese capilar (SCHOUTEN et al., 2002). A interpretação dos resultados é feita comparando-se os picos obtidos nos eletroferogramas dos pacientes aos picos dos controles, usando-se programas específicos para análise de dados de genotipagem ou planilhas específicas, sendo possível a quantificação relativa ao número de cópias gênicas (Figura 8) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005). Figura 7 - Etapa de amplificação da MLPA Figura 7 - Resultado da amplificação de diferentes produtos de ligação, através de PCR, com a utilização de primers universais Fonte: Modificado de Willis et al., 2012 Figura 8 - Eletroferograma para interpretação dos resultados finais da MLPA Legenda Exemplo da imagem dos picos do eletroferograma obtidos para um indivíduo, produzida com o Software GeneMarker. As setas indicam os picos alterados do individuo avaliado (em azul) quando comparado à média do pico dos controles (em vermelho). Fonte: Adaptado de Softgenetics

25 A técnica de MLPA possui algumas vantagens em relação a outras metodologias já utilizadas para detecção de alterações genômicas. Dentre elas, destacam-se: baixo custo, alto rendimento, simplicidade e facilidade de operação, rapidez, reprodutibilidade e sensibilidade. Além disso, o método não requer exame dos pais, pois a detecção de deleções e duplicações é feita baseada em um sistema de controles internos (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005). Diversos estudos de investigação de microdeleções/microduplicações, usando a técnica de MLPA, tiveram resultados similares àqueles baseados em outros métodos, como PCR quantitativa (qpcr) ou hibridização genômica comparativa baseada em microarranjos (array-based comparative genomic hybridization - acgh) (KOOLEN et al., 2004; LAM et al., 2006; ROOMS et al., 2006). Um estudo com MLPA analisando 258 indivíduos com deficiência intelectual, que apresentavam cariótipo convencional normal, identificou alterações cromossômicas em 5,8% dos casos. Entre esses pacientes, 10 apresentaram as síndromes de deleção 1p36, deleção 22q11, síndromes de Angelman/Prader-Willi, Miller- Dieker, Smith-Magenis, Sotos e Williams-Beurens, e outros cinco tinham duplicações. Tais resultados são indicativos de que a técnica de MLPA quando utilizada para identificação de alterações específicas, pode ser uma ferramenta importante na investigação diagnóstica inicial (KIRCHHOFF et al., 2006). Outras técnicas, como o a-cgh, seguramente podem aumentar a detecção de anomalias, mas devido ao seu alto custo, a técnica de MLPA se apresenta como a melhor alternativa disponível na triagem de microdeleções/microduplicações (AHN et al., 2007). 1.4 Justificativa e relevância Classificada por diversos autores como uma síndrome genética (GEARY, 1993; RUBINSTEN & HENIK, 2009), a DAM é uma desordem que merece atenção, pois afeta cerca de 7% das crianças e adolescentes em idade escolar (BADIAN, 1983; SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; KOUMOULA et al., 2004). Até o momento, não se sabe ao certo quais os genes e os mecanismo moleculares envolvidos na etiologia da doença. Compreender a heterogeneidade genética da DAM é importante para estimar a contribuição dos diversos fatores de risco. Além disso, os perfis encontrados podem ser úteis no auxílio de equipes interdisciplinares para delineamento de estratégias de reabilitação dessas crianças e para o aconselhamento genético. O diagnóstico etiológico precoce da DAM é importante para fornecer intervenções eficazes, como programas de reabilitação, e até mesmo para um planejamento mais adequado do processo educativo. Além disso, permitiria aos indivíduos um acompanhamento multidisciplinar, que pode proporcionar-lhes um impacto positivo nas

26 habilidades matemáticas e contribuir para elevar a autoestima das crianças (BUTTERWORTH e YEO, 2004; GERSTEN, JORDAN & FLOJO, 2005). O método de MLPA tem sido amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa e de diagnóstico, por ser uma técnica de baixo custo, simples, rápida, sensível e de fácil operação (SHEN, 2009). Além disso, é possível detectar tanto deleções quanto duplicações de até 50 sequências de DNA em um único ensaio (SCHOUTEN et al., 2002; SØRENSEN et al., 2008). Sendo assim, a MLPA pode ser considerada a técnica de melhor custobenefício para a identificação de alterações cromossômicas numa triagem inicial, quando não há uma suspeita clínica específica. Por se tratar de uma condição frequentemente encontrada na população, alguns estudos vêm sendo realizados a fim de compreender as bases genéticas da DAM. Há trabalhos relacionando a associação entre síndromes genéticas e as dificuldades de aprendizagem (KOPERA-FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; SOTOS, 1997; MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; PATERSON et al., 2006; SEMENZA et al., 2008; DeSMEDT et al., 2009; RUSCONI et al., 2009). Entretanto, nenhum deles investigou a frequência das síndromes de microdeleção/microduplicação, que se associam a DAM, entre indivíduos averiguados com dificuldade de aprendizagem da Matemática. Os relatos quanto à etiologia indicam que pode haver ao menos duas formas de DAM, uma associada a síndromes ambientais ou genéticas e outra forma etiológica é relacionada a mecanismos multifatoriais, havendo interação de pequenos efeitos de múltiplos genes com fatores ambientais (HAASE et al, 2012). A principal hipótese desse projeto é de que na amostra de crianças com DAM pode haver casos causados pelas síndromes mencionadas acima. Neste caso, o transtorno de aprendizagem da Matemática constitui parte do fenótipo ampliado das síndromes genéticas. As síndromes de microdeleção/microduplicação intersticial foram selecionadas para análise porque constituem o grupo das síndromes mais frequentes na população e que apresentam dificuldades relativamente específicas de aprendizagem da Matemática como parte do fenótipo (Velocardiofacial/DiGeorge, Williams-Beuren, Prader-Willi/Angelman, Sotos, Neurofibromatose tipo 1). 1.5 Objetivos 1.5.1 Objetivo geral Averiguar, através da MLPA, a frequência de microdeleções/microduplicações intersticiais em crianças de idade escolar com dificuldade de aprendizagem na Matemática.

27 1.5.2 Objetivos específicos Padronizar a técnica MLPA; Validar do kit SALSA MLPA P245-A2; Genotipar crianças de idade escolar com DAM e controles; Analisar os resultados através do programa GeneMarker; Calcular a frequência de microdeleção/microduplicação intersticiais em ambas as amostras; Confirmar as microdeleções/microduplicações encontradas.

28 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Aspectos éticos Este trabalho é parte de dois projetos de pesquisa intitulados: Discalculia do Desenvolvimento em crianças de idade escolar: triagem populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genéticos moleculares, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG (COEP-MG) através do parecer nº ETIC 42/08 (Anexo I) e Avaliação de estratégia de diagnóstico neuropsicológico e genético-molecular dos transtornos do desenvolvimento cognitivo (retardo mental), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG através do Parecer nº ETIC 0091.0.203.000-10. A participação no estudo foi condicionada à leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo II). 2.2 A amostra A amostra analisada no presente estudo tem duas origens: parte dela foi averiguada em um estudo de base populacional e parte de um ambulatório especializado em dificuldade de aprendizagem da Matemática, conforme descrito abaixo. 2.2.1 Amostra ambulatorial Ao longo deste estudo, foi criado um ambulatório específico para atendimento de crianças com dificuldade de aprendizado da Matemática, o Número, na FAFICH/UFMG, sob supervisão do Prof. Vitor Haase, do Departamento de Psicologia da UFMG. Neste ambulatório, são atendidas crianças/adolescentes, encaminhados por psicólogos, psicopedagogos ou professores, com a suspeita específica de dificuldade de aprendizagem da Matemática. Esta amostra foi submetida ao mesmo conjunto de testes descrito abaixo. Os critérios de diagnóstico usados também foram similares. 2.2.2 A amostra de base populacional Trata-se de um estudo epidemiológico, que teve como objetivo identificar as crianças, que apresentavam dificuldades de aprendizagem na Matemática. A fim de evitar vieses, foi selecionada uma amostra aleatória da população de crianças matriculadas entre a 1ª e a 6ª séries (2º ao 7º ano) do ensino fundamental de Belo Horizonte MG. Esses dados fizeram parte do trabalho de doutorado da Psicóloga Fernanda de Oliveira Ferreira,

29 defendido junto a Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente, da Faculdade de Medicina da UFMG, sob orientação do Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase, Departamento de Psicologia, UFMG (FERREIRA, 2010; FERREIRA et al., 2012) A amostra foi composta por estudantes de dez escolas públicas e duas escolas particulares de Belo Horizonte e foi coletada em duas etapas: triagem pelo Teste do Desempenho Escolar (TDE) e avaliação cognitiva e neuropsicológica. 2.2.3 Triagem pelo TDE Na primeira etapa, as crianças foram avaliadas quanto ao desempenho escolar em linguagem e aritmética através de dois instrumentos de rastreio: o TDE (STEIN, 1994) e a tarefa de transcodificação numérica (MOURA, 2010). O TDE é um teste individual de aplicação coletiva, que compara o desempenho médio dos estudantes por série e idade. O teste classificou as crianças em três categorias de acordo com o percentil de aproveitamento (P). Foram elas, inferior (P<25), médio (P25<X<P75%) e superior (>P75) (STEIN, 1994, p.19). A tarefa de transcodificação numérica tem como objetivo avaliar a habilidade do aluno em escrever, na forma arábica, o algarismo apresentado oralmente pelo experimentador. 2.2.4 Testagem neuropsicológica e cognitiva Nessa etapa, foram avaliados: inteligência, habilidades somatosensoriais como orientação direito-esquerda e percepção tátil, habilidades viso construtivas e viso espaciais, memória e funções executivas, conforme descrito na Tabela 1. Além disso, as habilidades numéricas foram avaliadas por uma bateria experimental (Tabela 2) Os testes cognitivos e neuropsicológicos foram realizados pelos estudantes da Pós- Graduação de Neurociências ou da Saúde da Criança e do Adolescente e da Graduação em Psicologia da UFMG, em treinamento no Laboratório de Neuropsicologia do Desenvolvimento da FAFICH-UFMG, sob supervisão do Prof. Vitor Haase.

30 Tabela 1 - Tarefas de avaliação cognitiva e domínios avaliados DOMÍNIO AVALIADO TESTE Inteligência RAVEN Destreza motora 9-Hole Peg Test Habilidades somatosensoriais Gnosias digitais e Orientação direita-esquerda Habilidades viso construtivas Memória de curto prazo e memória de trabalho Funções executivas Figura Complexa de Rey Dígitos do WISC-III e Cubos de Corsi Fluência verbal, Fluência de desenhos e TMT A e B Processamento fonológico Repetição de pseudopalavras, Leitura de pseudopalavras e Supressão de fonemas Fonte: Adaptado de Haase et al., 2008; Costa et al., 2011 Tabela 2 - Tarefas de avaliação neuropsicológica e domínios avaliados DOMÍNIO AVALIADO Tempo de reação Senso numérico Cálculo aproximado TESTE Tempo de reação simples Comparação de magnitudes não simbólica, Comparação de magnitude simbólica e Estimação não simbólica. Adição não simbólica e Subtração não simbólica Fatos aritméticos Cálculos Cálculos verbais Problemas matemáticos Fonte: adaptado de COSTA et al., 2011

31 2.3 Sistemática de classificação dos pacientes DAM O grupo DAM foi constituído pelas crianças, que apresentaram classificação inferior ao P25 no TDE e superior a P15 no Teste das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven e que, ao final da avaliação cognitiva e neuropsicológica, apresentaram dificuldades de aprendizagem de Matemática, podendo ser também de Matemática e escrita. CONTROLE NORMALTESTADO O grupo controles normais testados foi composto por crianças, que apresentaram um aproveitamento superior a P25 no subteste de aritmética do TDE e superior a P15 no Teste das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven. Essas crianças não apresentaram dificuldade de aprendizagem e preencheram os critérios padrões para um bom desempenho escolar, de acordo com a média esperada para a série escolar e idade nos subtestes de aritmética do TDE. Para cada criança, que apresentava DAM, foi selecionada uma criança controle, da mesma série, idade e preferencialmente da mesma sala de aula, sempre que possível. Essas crianças também foram submetidas à testagem neuropsicológica completa. CRITÉRIO DE EXCLUSÂO Os participantes que obtiveram resultado significativamente baixo no Teste das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven (P15) foram classificados com deficiência intelectual e por esse motivo foram excluídos desta amostra. Estas crianças passaram a integrar a amostra do projeto de pesquisa Avaliação de estratégia de diagnóstico neuropsicológico e genético-molecular dos transtornos do desenvolvimento cognitivo (retardo mental), referido acima. Além disto, receberam o laudo de avaliação neuropsicológica e foram referenciados a outros profissionais, para investigação ou assistência, conforme necessário. CONTROLE POSITIVO DO KIT SALSA MLPA P245-A2 O grupo controle positivo foi composto por cinco pacientes de ambos os sexos previamente diagnosticados com alguma síndrome genética detectável pelo kit Salsa MLPA P245-A2. Assim, foram dois pacientes com SWB e a SVCF, um de cada sexo, e um menino afetado pela síndrome de WARG. CONTROLE INTERNO DA TÉCNICA DE MLPA Foram selecionados cinco indivíduos de cada sexo de uma amostra sem alteração (deleção/duplicação), já disponível no Laboratório de Genética Humana e Médica (LGHM)

32 da UFMG, que constituiu o grupo controle interno exigido para padronização da técnica de exame molecular utilizada na pesquisa, a MLPA. Na Figura 9, estão ilustrados os grupos acima descritos e as estratégias de averiguação utilizadas. Figura 9 - Estratégias de avaliação utilizadas e grupos de estudo Legenda - Das 1520 crianças avaliadas na triagem por TDE e teste de transcodificação numérica foram diagnosticadas 78 crianças com dificuldade de aprendizagem em Matemática e selecionadas 90 controles com avaliação neuropsicológica normal, pareados por sexo e idade; e excluídos os indivíduos diagnosticados com Deficiência Intelectual. Para padronização da técnica e validação do kit P245-A2 foram utilizados cinco controles internos de cada sexo e cinco controles positivos. Fonte: Elaborada pela autora

33 2.4 Métodos moleculares 2.4.1 Extração de DNA Foram coletados 5mL de sangue em tubo com EDTA ou saliva, para os casos em que as crianças apresentavam resistência à coleta de sangue. A extração de DNA foi realizada pelo método de precipitação salina (MILLER et al., 1988), método usado rotineiramente no laboratório, para quaisquer tipos de material biológico. Os DNA foram quantificados, utilizando-se o espectrômetro NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, EUA) sendo que a razão das absorbâncias 260 nm e 280 nm, assim como a razão das absorbâncias 260 nm e 230 nm foram avaliadas a fim de verificar a qualidade do DNA e garantir que fossem utilizados em uma concentração uniforme. 2.4.2 A técnica MLPA Para a padronização da técnica de MLPA, foi utilizado o kit SALSA MLPA P245-A2 Microdeletion Syndromes-1 (MRC HOLLAND, Amsterdã, Holanda), e posteriormente para detecção de microdeleções/microduplicações intersticiais foi utilizado o mesmo kit. Esse kit permite o diagnóstico de 21 síndromes de microdeleção, sendo estas as mais comuns em humanos. A composição do kit, em termos de sondas, posições cromossômicas e doenças investigadas são apresentadas na Tabela 3.

34 Tabela 3 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-A2 Fonte: MRC - Holland

35 O kit SALSA MLPA P245-A2 é composto por 49 sondas, que geram fragmentos entre 130 a 484 pb. O kit inclui ainda dez fragmentos-controle, com produtos de amplificação menores do que 120 pb: quatro fragmentos específicos para a análise da quantidade de DNA (DQ) com 64, 70, 76 e 82 pb; três para controle de desnaturação de DNA (DD) com 88, 92 e 96 pb, um fragmento específico para o cromossoma X com 100 pb e dois fragmentos específicos para o cromossoma Y, com 105 e 118 pb (MRC Holland b. v., Amsterdã, Holanda). O protocolo utilizado encontra-se em conformidade ao descrito por Schouten et al., 2002, com mínimas modificações. As reações da MLPA foram realizadas no termociclador (Applied Biosystems Veriti 96-Well Thermal Cycler) e realizadas em quatro passos: desnaturação e hibridização do DNA, reação de ligação, amplificação por PCR. DESNATURAÇÃO E HIBRIDIZAÇÃO Na desnaturação e hibridização cada amostra de DNA utilizada foi diluída em TE na proporção de 120 200 ng para 2,5 μl e mantida em termociclador a temperatura de 98 C por cinco minutos. Posteriormente, as amostras foram resfriadas a 25 C, e foram acrescentados 0,75 μl de SALSA Probe-mix e 1,5 μl de MLPA buffer. Em seguida, foram mantidas a 95ºC por um minuto e incubada a 60 C durante 16-20 horas. LIGAÇÃO Após a hibridização, foi realizada a etapa de ligação. A princípio foi preparado o Mix Ligase com 1,5 μl de Ligase-65 buffer A, 1,5 μl Ligase-65 buffer B, 12,5 μl de água Milli-Q e por último 0,5 μl da enzima Ligase-65. Logo após, a temperatura do termociclador foi reduzida a 54 C, e acrescentados 16 μl de Mix Ligase-65 a cada amostra. Em seguida, a mistura foi incubada a uma temperatura de 54 C por 15 min e a 98 C por 5 min. PCR E finalmente, em um novo tubo, foi preparado o Mix de PCR com 1,0 μl SALSA PCR primer, 0,25 μl de SALSA DNA Polymerase e 3,75 μl de água Milli-Q e em seguida, foram adicionados 5 μl dessa solução em cada amostra no termociclador. Por fim, foi iniciada a reação de PCR segundo o protocolo descrito na Figura 10.

36 Figura 10 - Ciclo utilizado na MLPA para amplificação dos fragmentos Fonte: Produzida pela autora 2.4.3 Analise dos resultados As amostras foram genotipadas pela MLPA, para detecção de possíveis microdeleções/microduplicações intersticiais, conforme a técnica descrita e posterior padronização. Nesta etapa, também foram utilizados os controles internos, como recomenda o fabricante. Os produtos amplificados na MLPA foram separados e visualizados em aparelho de eletroforese capilar ABI 3130 ou ABI 3137 (Applied Biosystems-Applera Corporation, Estados Unidos). Foi adicionado 0,5 µl do padrão de peso molecular ROX 500 (ABI 3130) ou LIZ 500 (ABI 3137) e 8,5 µl de Formamida Hi-Di (Applied Biosystems-Applera Corporation, Estados Unidos) para 1,0 µl dos produtos amplificados. Essa mistura foi submetida a choque térmico a 95 o C por 3 min e resfriada rapidamente a 4 o C antes da eletroforese capilar. A interpretação dos perfis gerados foi feita com o software GeneMarker V2 2.0 (Softgenetics, LLC, EUA). Os dados foram normalizados dividindo-se o valor da altura do pico de cada sonda pela soma dos picos de todas as sondas presentes em cada amostra. Esta etapa é denominada de normalização intra-amostral. Em seguida, o valor prénormalizado é dividido pela média da altura do pico da sonda correspondente nas amostras controles. Esta segunda etapa é denominada de normalização inter-amostral. Para valores de picos entre 0,7 e 1,3 foram considerados normais. Valores superiores a 1,3 foram considerados indicativos de microduplicação cromossômica nas regiões cobertas pelas sondas e valores inferiores a 0,7 foram considerados indicativos de microdeleção.

37 2.5 Confirmação dos resultados De acordo com o fabricante, para confirmação dos resultados é indicado utilizar outro kit de MLPA confirmatório ou outra técnica de biologia molecular. Sendo assim, para a confirmação, foi usado a versão atualizada do mesmo kit, o kit SALSA MLPA P245-B1 MICRODELETION SYNDROMES-1 (Tabela 4) e também o kit SALSA MLPA P070-B2 HUMAN TELOMERE-5 (MRC Holland, Amsterdã, Holanda), que contém uma sonda para cada região subtelomérica dos cromossomas autossômicos 1 ao 22, além das regiões pseudo-autossômicas dos cromossomas X e Y (Tabela 5). Outro método utilizado para confirmação foi o acgh. Essa técnica foi realizada pelo Centro de Estudos do Genoma Humano, no Instituto de Biociências Universidade de São Paulo, utilizando a plataforma Human Genome CGH Microarray 60K (Agilent Technologies, Santa Clara CA, EUA), contendo cerca de 60.000 oligonucleotídeos distribuídos pelo genoma humano).

38 Tabela 4 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-B1 Fonte: MRC Holland

39 Tabela 5 - Descrição do kit SALSA MLPA P070-B2 Fonte: MRC Holland