Toxigenomics: Principles and aplication Dr. André D. Luchessi andre.luchessi@outlook.com
NATAL
DACT - PPgCF
PROGRAMA DO CURSO
TOXIGENÔMICA
DEFINIÇÃO Em termos gerais toxigenômica são os estudos que envolvem a pesquisa de mecanismos ou estudos de predisposição a efeitos tóxicos.
GENES Toxicogenomics is not a promise for the future, it is a tool that is available to us now
GENOMA
GENÔMICA
A CÉLULA
VARIABILIDADE GENÔMICA
VARIABILIDADE GENÔMICA MARIA JOÃO PAULO ANDRÉ
SNPs HUMANOS
SNPs x DOENÇAS Anemia Falciforme
SNPs x DOENÇAS
HAPMAP
CYP2C9
CYP2C9 - HAPMAP
CYP2C9 - HAPMAP
CYP2C9 - HAPMAP
DADOS DE SNPs
POPULAÇÃO
RESULTADO
RESULTADO
BLOCOS HAPLOTÍPICOS
TAG SNPs MARIA JOÃO PAULO ANDRÉ
POPULAÇÃO BRASILEIRA Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11:65-89. doi: 10.1146/annurev-genom-082509-141523.
POPULAÇÕES MISCIGENADAS Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11:65-89. doi: 10.1146/annurev-genom-082509-141523.
MARCADORES Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11:65-89. doi: 10.1146/annurev-genom-082509-141523.
A VIDA CELULAR
DO GENE A PROTEÍNA Luchessi AD, Curi R, Costa-Neto CM. Revealing the translation control by transcriptome analysis. Einstein. 2006 Jul-Sep;4(3):237-40
INTERAÇÃO GÊNICA Drake et al.,mamm Genome, 2006.
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO Mecanismos Organização do DNA Nucleossomos Ilhas CpG Região promotora Metilação do DNA Pré transcricional 5 CAP Splicing Cauda poli A Degradação RNAm - mirnas Transcricional Pós transcricional Formação do RNAt Pré traducional Formação cadeia peptídica Traducional
EXPRESSÃO DIFERENCIAL Músculo Pele Neurônio Gene A Gene B Gene C + + + + + + + + + + + +
CONTROLE TRANSCRICIONAL Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al
ORGANIZAÇÃO DO DNA DNA Recombinante. 3 ed. James D. Watson. et al
NUCLEOSSOMO DNA Recombinante. 3 ed. James D. Watson. et al
ILHAS CpG Espada J, Esteller M. Semin Cell Dev Biol. 2010. DNA methylation and the functional organization of the nuclear compartment.
APLICAÇÃO
REGIÃO PROMOTORA Comparação da sequência nucleotídica da região TATA de 60 genes diferentes de vertebrados Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, H. et al
FATORES DE TRANSCRIÇÃO Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al
RECOMPOSIÇÃO Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, H. et al
RECOMPOSIÇÃO ALTERNATIVA Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al
mirna Esquela-Kerscher et al. Nature Reviews Cancer 6, 259 269 (April 2006) doi:10.1038/nrc1840
TRADUÇÃO
RECONHECIMENTO AUG
SUBUNIDADE 60s
COMPLEXO 80s
PCR EM TEMPO REAL
APLICAÇÕES
PCR x TEMPO REAL Baixa precisão Baixa sensibilidade Baixa resolução Não automatizado Discriminação pelo tamanho dos fragmentos Resultados não expressos em números Amplificação pode ser monitorada em tempo real Sem processamento pós-pcr Menor quantidade de amostra Mais sensível e específica que a PCR convencional Mais reprodutível que a PCR convencional Custo/benefício
Log Target DNA TAXA AMPLIFICAÇÃO P = T x (1+E) n Teórico 100% = 2 n P: produto final T: template E: eficiência n: número de ciclos Real Fase exponencial alta eficiência Ciclo
PCR convencional x PCR em tempo real
EFICIÊNCIAS DE AMPLIFICAÇÃO Fatores Preparo da reação (pipetagem, bolhas) Qualidade do DNA/cDNA molde Presença de inibidores Seqüência dos iniciadores Programa de amplificação Concentração dos reagentes Tamanho do amplicon
O SISTEMA ÓTICO www.biorad.com
UNG Enzima uracil-n-glicosilase (UNG) Amplicon gerado contém dutp Específica para deoxiuridina 50 0 C ativa; > 55 0 C inativa
SISTEMAS AMPLIFICAÇÃO Químicas fluorescentes existentes: SYBR Green TaqMan Molecular Beacons LUX Scorpion Probes Hybridizations Probes Etc...
SISTEMAS AMPLIFICAÇÃO A: Molecular Beacon; B: TaqMan Probe; C: Hybridizations Probes; D: LightUp Probe; E: Simple Probe; F: Scorpion Primer; G: Sequence non-specific dyes (SYBR Green/Boxto)
SYBR GREEN Intercalante de DNA dupla fita Fluoróforo em suspensão no master mix Inespecífico Permite curva de dissociação (melting) Não permite multiplex Quanto mais longa a cadeia de DNA, maior a fluorescência
REAÇÃO
GRÁFICO
CURVA DE DISSOCIAÇÃO
RESULTADO
GENOTIPAGEM POR HRM TM = 85 C TM = 85 C TM = 85 C TM = 83 C
SISTEMA TAQMAN Baseia-se na atividade 5-3 exonuclease da Taq polimerase Funciona com sondas fluorescentes Altamente específico e sensível Não permite curva de dissociação Permite multiplex
MARCADORES Referência Passiva: ROX Reporters: FAM NED VIC JOE HEX Quenchers: TAMRA NFQ Sonda: Localiza-se ~1-5 bases do primer sense Tm deve ser ~10ºC maior que Tm dos primers 1ª base não pode ser G (efeito Quencher) Não pode ter mais Gs do que Cs Não pode ter > 3 bases consecutivas iguais Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (NFQ) Pode ter ~30-40 bases (sonda TAMRA) ou ~15-20 bases (sonda com cauda MGB) junção exon-exon
TIPOS DE QUANTIFICAÇÃO Absoluta: unidades palpáveis, determinando número de cópias, curva standard necessária para cada gene Relativa: Análise comparativa de um gene alvo por meio dos Cts das amostras, gerando resultados relativos
CURVA PADRÃO
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA deltact controle : 31 19 = 12 deltact caso : 26 19 = 7 = 1,71
RESULTADOS Quantificação Absoluta Fácil de entender os dados, porém muito mais caro e difícil de desenvolver os padrões de curva standard 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 500 1000 Amostra 1 Amostra 2 Quantificação Relativa Dispensa a curva standard, muito mais barato, porém mais difícil de entender os dados relativos (sem unidades) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 Amostra 1 Amostra 2
GENOTIPAGEM SNP C>A C A
Fluorescência FAM RESULTADO TT GT Controle negativo GG Fluorescência VIC
MICROARRANJOS DE DNA Arranjos ordenados de fragmentos de DNA imobilizados sobre uma superfície sólida em alta densidade. Em geral, cada ponto no arranjo corresponde a um gene específico, podendo existir dezenas de milhares de pontos em uma lâmina.
SÍNTESES 1- Oligo espotado 2- Oligo sintetizado tipo Jato de tinta 3- Fotolitografia
SISTEMAS DE CORES
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LAG/UFRN www.affymetrix.com
ARRAY EXPRESSÃO
EXPRESSÃO X RESPOSTA
VIAS DE INTERAÇÃO
NEXT GENERATION SEQUENCING
ESTRATÉGIAS
CUSTO POR GENOMA
Sequenciadores
(R)Evolução
SANGER
SANGER
QUIMICA ILLUMINA
CÉLULAS DE FLUXO
INSERTO DE DNA Inserto de DNA Dois tipos de Oligos
HIBRIDIZAÇÃO
AMPLIFICAÇÃO
DESNATURAÇÃO
FORMAÇÃO DAS PONTES
AMPLIFICAÇÃO FITA SENSE FITA ANTISENSE
NOVA PONTE
AMPLIFICAÇÃO DAS PONTES
CONJUNTOS DE SEUQENCIAS
REMOÇÃO ANTISENSE
BLOQUEIO 3
SEQUENCIAMENTO OLIGO DE SEUQUENCIAMENTO MOLDE
DETECÇÃO
FORMAÇÃO DOS CLUSTER
INÍCIO
PRIMEIRA HIBRIDIZAÇÃO
DETECÇÃO
BLOQUEIO
SEGUNDA HIBRIDIZAÇÃO
SEGUNDA DETECÇÃO
SEGUNDO BLOQUEIO
TERCEIRA HIBRIDIZAÇÃO
FORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA
RESULTADOS
UNIÃO DE SEQUÊNCIAS
SEQUÊNCIAS
REFERÊNCIAS ALINHAMENTO
ILLUMINA
ION TORENT
SISTEMA DE DETECÇAÕ
1000 GENOMAS
BROWSER CYP2C9
VARIAÇÕES
TABELA DE VARIAÇÃO
MISSENSE
DADOS
SEQUÊNCIAS EM FASTA