ELABORAÇÃO DO PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO DO SULFATO DE NEOMICINA MATÉRIA-PRIMA

2 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GÓIAS Pós-Graduação em Vigilância Sanitária ELABORAÇÃO DO PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO DO SULFATO DE NEOMICINA MATÉRIA-PRIMA Laís Xavier Vilela 1 Kleber Vânio Gomes 2 1 Farmacêutica Industrial, Aluna da Pós-Graduação em Vigilância Sanitária pela Universidade Católica de Goiás/IFAR. 2 Orientador: Farmacêutico Industrial pela Universidade Federal da Paraíba, Mestre em Engenharia Química pela Unicamp-SP RESUMO A validação estabelece evidências documentadas que prova um alto grau de garantia a um processo específico, garantindo consistentemente que o produto esteja de acordo com as normas de qualidade. Essas evidências documentadas indicam os passos a serem seguidos de modo a evitar que erros sejam repetidos inadvertidamente e garantir a continuidade da produção com a mesma qualidade. Assim, no presente trabalho, tomando por base os compêndios oficiais farmacêuticos, utilizou-se o método de difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3 X 3, delineamento blocos ao acaso para a elaboração do protocolo de validação do método analítico de doseamento microbiológico do sulfato de neomicina matéria-prima. Para este ensaio, utiliza-se o microorganismo teste Stphylococcus aureus ATCC 6538. Serão abordados todos os parâmetros de validação de métodos quantitativos: especificidade, repetibilidade, precisão intermediária, linearidade, exatidão e intervalo. O protocolo aqui elaborado tem a finalidade de servir como referência para validação do método do Sulfato de Neomicina matéria-prima, podendo ser utilizado para determinação da potência antimicrobiana em preparações farmacêuticas. Palavras-chaves: validação de metodologia analítica, sulfato de neomicina, doseamento microbiológico de antibióticos. ABSTRACT The validation establishes documented evidences that provides a high level of reliability to a specific process, ensuring the product are in compliance with the quality standards. These documented evidence indicate the steps to be followed to avoid recidivism of mistakes made earlier and ensuring the continuity of the production with the same quality. Thus, the aim of this work is to elaborate a validation protocol of the analytical method for the microbiological assay of neomycin sulfate. For this assay, it is common to use the test microorganism Stphylococcus aureus ATCC 6538. We will discuss all the validation parameters of quantitative methods: specificity, repeatability, intermediate precision, linearity, accuracy and range. The protocol developed here is intended to serve as references to validate the method of Neomycin sulphate raw material, can be used to determine the antimicrobial potency in pharmaceutical preparations. Keywords: validation of analytical methodology, neomycin sulfate, microbiological assay of antibiotics.

3 1 INTRODUÇÃO A indústria farmacêutica tem passado, atualmente, por grandes mudanças no que diz respeito à busca pela qualidade total, que tem sido rigorosamente exigida pela legislação mundial. O aumento da concorrência entre empresas e o desenvolvimento tecnológico também motivam as indústrias farmacêuticas a buscar, cada vez mais, a garantia dessa qualidade (AMARAL, 2006). O amadurecimento do país, das empresas e de seus colaboradores permite a introdução de novas tecnologias associadas aos controles mais apurados, e de certa forma, conduzidos de maneira mais científica do que no passado. Os estudos de validação representam estas mudanças de aperfeiçoamento contínuo, e transmitem claramente que os ajustes finos dependem dos esforços em equipe (AMARAL, 2006). A credibilidade nos produtos e controles realizados na indústria é algo desejado por todos, e exigidos pelas normas internacionais de Boas Práticas de Fabricação, e outras específicas para os demais segmentos ligados à saúde (AMARAL, 2006). Validação do método analítico é a confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos, é tornar legítimo, através do estabelecimento de documentações, tudo que envolve o processo de produção e controle de qualidade, desde as condições do ambiente, até os insumos e matérias-primas que entram em sua composição, permitindo demonstrar que o método é adequado ao uso pretendido (SOLANO, 2008; BRASIL, 2003). A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atende às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (BRASIL, 2003). Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação e exatidão adequados à análise. Estas informações aplicam-se aos testes imunológicos, microbiológicos ou físico-químicos desde que observado, o grau de variabilidade usualmente associados a estas técnicas (BRASIL, 2003). O principal desafio, em se tratando de microbiologia, é sem dúvida minimizar o erro existente nas diversas etapas de um método. Este erro pode ser calculado e exceder 30%. O erro associado a técnicas analíticas microbiológicas está intimamente ligado às fases de diluição, amostragem, preparação do inóculo, estágio da curva de crescimento microbiano, qualificação do analista, resíduos inibidores de crescimento microbiano no material utilizado para análises, falta de homogeneidade da contaminação microbiana na amostra, além de outros (AMARAL, 2006).

4 Entretanto, somente com a validação dos ensaios aplicados aos variados produtos existentes é que podemos garantir respostas analíticas confiáveis (BRASIL, 2003; AMARAL, 2006). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi elaborar o protocolo de validação de método analítico de doseamento microbiológico da matéria-prima sulfato de neomicina, de modo a estabelecer os parâmetros e limites de aceitação que assegurem a validade dos doseamentos microbiológicos realizados em matérias-primas. 2 DISCUSSÃO 2.1 Validação de metodologia analítica De acordo com a Resolução nº 899, de 29 de maio de 2003, a validação de procedimentos analíticos deve demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos, o que pode ser visualizados nos quadros 1 e 2. QUADRO 1: Classificação dos testes, segundo sua finalidade Categoria I II Finalidade do teste Testes quantitativos para a determinação do principio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias primas Testes quantitativos ou ensaio limite para determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas III Teste de performance (por exemplo: dissolução. Liberação do ativo) IV Testes de identificação Fonte: BRASIL, 2003. O processo de validação comprova, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Alguns parâmetros fazem parte do escopo da validação analítica, tais como especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, e devem, de acordo com o tipo de deste realizado, serem abordados para garantir a eficácia e segurança dos produtos manufaturados. As análises devem ser realizadas com substâncias referenciadas

5 pela Farmacopéia Brasileira ou, na ausência destas, por outros códigos autorizados pela legislação vigente. No caso da inexistência dessas substâncias, será admitido o uso de padrões de trabalho, desde que a identidade e o teor sejam devidamente comprovados (VALENTINI, 2002). QUADRO 2: Ensaios necessários para a validação de método analítico, segundo sua finalidade Parâmetros Categoria I Categoria II Categoria III Categoria IV Quantitativo Limites Especificidade Sim Sim Sim * Sim Linearidade Sim Sim Não * Não Intervalo Sim Sim * * Não Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não Intermediária ** ** Não ** Não Limite de detecção Não Sim * Não Limite de Não Sim Não * Não quantificação Exatidão Sim Sim * Não Robustez Sim Sim Sim Não Não *pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico. **se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessário à comprovação da Precisão Intermediária. Fonte: BRASIL, 2003. Os métodos gerais da farmacopéia também necessitam de validação. Isso é devido aos diversos fatores que mudam de ensaio a ensaio (AMARAL, 2006). A Farmacopéia Brasileira 5ª edição recomenda que os ensaios microbiológicos sejam realizados por difusão em ágar e turbidimetria para a avaliação da atividade antimicrobiana quantitativa de antibióticos (BRASIL, 2010). 2.2 Doseamento microbiológico de antibióticos No estudo dos antimicrobianos e no tratamento das doenças infecciosas, os conceitos de sensibilidade e resistência bacteriana fundamentam-se na correlação entre a concentração mínima inibitória (CMI) e os níveis plasmáticos alcançados com o antimicrobiano administrado. Para se obterem concentrações plasmáticas que se caracterizem com a atividade biocida e biostática é necessário que a potência do antimicrobiano esteja adequada nas

6 preparações farmacêuticas que serão administrada ao paciente, cuja infecção se deseja combater (PINTO et al., 2010; RANG; DALE 2007). O ensaio microbiológico para a determinação da potência dos antibióticos somente é indicado para substância ou preparações, em que seu teor não pode ser definido por métodos físico-químicos (PINTO et al., 2010). A potência dos antibióticos geralmente é determinada, comparando-se a dose de uma preparação amostra que inibe o crescimento de um microorganismo adequado e susceptível com a dose da preparação do antibiótico de referência nas mesmas condições de trabalho. Uma redução na atividade microbiana pode revelar mudanças não demonstráveis por métodos químicos (THE UNITED, 2008; PINTO et al., 2010). Os dois métodos mais comumentes usados são a difusão em ágar e o turbidimétrico (BRASIL, 2010; PINTO et al., 2010). De acordo com a Farmacopéia Brasileira 5ª edição, o método utilizado para doseamento de sulfato de neomicina é o de difusão em ágar. 2.2.1 Método de difusão em Agar O método de difusão em ágar fundamenta-se na difusão do antibiótico a ser ensaiado, em um meio de cultura sólido e inoculado com um microorganismo padrão sensível, distribuído em placas em sistema mono ou bicamada, através do qual a substância teste se difunde. Após a aplicação da solução teste sobre a superfície deste meio, em uma área restrita, as placas são incubadas por um período de 16 a 18 horas, em uma temperatura de 32ºC a 35ºC. Do processo de difusão, resulta o aparecimento de um halo, onde não há o crescimento do micro-organismo, chamado halo de inibição. O diâmetro deste halo é em função da concentração do antibiótico, a qual pode ser expressa como uma relação linear entre o diâmetro do halo e o logaritmo da concentração do antibiótico (THE UNITED, 2005; PINTO et al., 2010). Para assegurar a validade do ensaio difusão em ágar, emprega-se pelo menos três doses da preparação padrão e da substância que está sendo examinada, as quais, devem ter, presumidamente, a mesma concentração que as soluções do padrão de potência conhecidas. As doses usadas devem estar em progressão logarítmica (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010). Os ensaios são comparativos empregando-se uma preparação padrão de referência, sendo a potência do antibiótico calculada, utilizando-se fórmulas matemáticas para os ensaios

7 quantitativos (2x2, 3x3, ou 5x1) ou o cálculo gráfico ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA 2010; PINTO et al., 2010). 2.2.1 1 Delineamento do Ensaio (3x3) O delineamento retas paralelas 3x3 é o ensaio escolhido pela Farmacopéia Brasileira, é dito simétrico, pois a razão entre as concentrações adjacentes e o número de concentrações ensaiadas do padrão e da amostra são iguais. Ao se plotar as respostas obtidas para o padrão e amostra contra o logaritmo da concentração, duas retas são obtidas. Estas devem ser paralelas, uma vez que padrão e amostra contêm a mesma substância. Além disso, devem apresentar regressão significativa, isto é, o microrganismo deve responder de forma diferente às concentrações do antibiótico. E por fim, a relação entre o logaritmo da concentração e o diâmetro do halo deve ser linear. Baseado nestes três fatores, as fórmulas para o cálculo de potência foram desenvolvidas ( FARMACOPÉIA BRASILEIRA 2010). 2.2.1.2 Preparo do inóculo Os microorganismos são frequentemente fornecidos na forma liofilizada, contidos em ampolas seladas, exigindo recuperação em meio líquido rico, e diversas subculturas para retornar a características fisiológicas normais. Deverão então ser mantidos com repiques de manutenção, em frequência geralmente mensal (BRASIL, 2010; PINTO et al., 2010). Ao se iniciar a aplicação de uma metodologia, a padronização de inóculo que proporcione seu emprego com segurança deverá incluir, para padronização, um teste prévio empregando distintas concentrações de inóculo e diferentes concentrações do antibiótico a ser ensaiado. Alíquotas da suspensão microbiana são adicionadas ao ágar fundido, mantido a cerca de 50ºC, em volumes finais de 10 ml. Após a homogeneização, o ágar é rapidamente vertido para a placa de Petri, colocadas então para solidificar em superfície plana (PINTO et al., 2010). 2.2.1.3 Técnica de ensaio A determinação da potência de antibióticos por difusão em ágar consiste basicamente no preparo de placas contendo meio de cultura sólido (ágar) previamente inoculado com microrganismo sensível, sobre o qual se dispensa solução-teste, conforme delineamento de escolha (PINTO et al., 2010). No ensaio de difusão emprega-se o meio de cultura em bicamada ou monocamada (PINTO et al., 2010). A camada base deve ser preparada através da adição de quantidade

8 apropriada de ágar fundido nas placas de Petri, as quais devem ser especialmente selecionadas, ter um fundo plano, possuir dimensões de 20 por 100 mm e a tampa do material apropriado (BRASIL, 2010; PINTO et al., 2010). O volume recomendado em métodos oficiais é de 21 ml, sendo que aproximadamente 5mL é do meio superfície, mais poderá ser menor, respeitando-se as características da amostra (PINTO et al., 2010). Após a solidificação do ágar, fechar as placas para preparar a camada superfície, adicionar 1mL do volume de inóculo determinado para a quantidade apropriada de meio de cultura que tenha sido fundido e resfriado entre 48ºC e 50ºC (BRASIL, 2010). Agitar o frasco contendo o microorganismo, por rotação, para obter suspensão homogênea e adicionar a quantidade indicada no meio inoculado em cada placa de Petri, contendo a camada base não inoculada. Espalhar uniformemente a camada, fechar as placas de Petri e esperar sua solidificação sobre a superfície plana. Após a solidificação colocar seis cilindros (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010; PINTO et al., 2010). O volume de solução dispensado em cada cilindro é de 0,2 ml, a colocação pode ser manual, com auxílio de uma pinça ou através de dispensadores, que simultaneamente colocam todos os cilindros na placa (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; PINTO et al., 2010). As soluções de amostra e padrão devem ser colocadas no cilindro, dentro do menor tempo possível, a fim de que a difusão se inicie ao mesmo tempo (PINTO et al., 2010). Antes da incubação, quando não se dispõe de placas com tampa porosa, papel absorvente deve ser colocado sobre cada uma. Incuba-se as placas na temperatura indicada, com variação máxima de mais ou menos 0,5ºC, durante o período de 16 a 18 horas (FARMACOPÉIA BRASILEIRA 2010; PINTO et al., 2010). A seguir, mede-se o diâmetro das zonas de inibição de crescimento, através de dispositivos para a leitura dos halos de inibição. A partir dessas leituras, calculam-se a potência da substância, devendo ser determinados os limites de confiança, empregando metodologia estatística (PINTO et al., 2010). 2.2.1.4 Fatores de interferência no doseamento microbiológico Existem vários fatores que influenciam na dosagem microbiológica de antibióticos, tais como: ph, condições de incubação, composição do meio de cultura (extrato de carne 1,5g; extrato de levedura 3,0; peptona 6,0g; dextrose 1,0g e ágar 15g ), espessura e uniformidade do ágar (ESMERINO, 2004; DIFCO). Foi demonstrado que o aumento da acidez do meio diminui a atividade antibacteriana de substâncias básicas e provoca aumento da atividade de substâncias ácidas. O ph do sistema

9 deve ser compatível com o crescimento microbiano e com a atividade e estabilidade das substâncias testadas (PINTO et al., 2010). Em relação a incubação, deve haver uma combinação entre o tempo e a temperatura. A condição de incubação fica definida em função do crescimento do microrganismo. Como regra geral o tempo de incubação pode variar de 3 a 30 horas, dependendo do microorganismo teste (PINTO et al., 2010). A espessura e uniformidade do ágar para uma série de placas são fundamentais e são conseguidos através da seleção de placas com fundo plano, tamanhos uniformes e do controle rigoroso do volume de ágar transferido para cada uma (PINTO et al., 2010). Outra variável é a distribuição do inóculo nas placas de Petri. Existem três formas de distribuição do inóculo nas placas. A primeira é o espalhamento da suspensão microbiana sobre o ágar, seguido de remoção do excesso, a segunda é a inoculação prévia do meio de cultura e posterior distribuição em placas e a terceira é colocação do meio inoculado sobre uma camada de ágar base, sendo que a segunda e a terceira proporcionam uniformidade de carga e a terceira produz halos de inibição mais nítidos, porém com maior dispêndio de tempo (PINTO et al., 2010). Para assegurar a validade do ensaio a ser executado, empregar pelo menos três doses da preparação padrão e da substância que está sendo examinada, as quais devem ter, presumidamente, a mesma concentração que as soluções do padrão de potência conhecidas. As doses usadas devem estar em progressão logarítmica (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010). 3 MÉTODO 3.1 Elaboração do protocolo de validação do método analítico de doseamento do sulfato de neomicina matéria-prima O documento base para validação da metodologia analítica de uma matéria-prima consiste na sua Instrução Analítica e/ou no seu Protocolo de Validação. A Instrução Analítica é o procedimento operacional padrão que estabelece a metodologia de análise de uma matériaprima. Foi elaborado protocolo de validação de acordo com a Farmacopéia Brasileira 5ª edição, utilizando os parâmetros e critérios de validação estabelecidos pela RE 899/2003, que estabelece que o protocolo deve conter os seguintes itens:

10 3.2 Considerações Gerais Todos os equipamentos e materiais devem estar devidamente calibrados e os analistas adequadamente treinados e qualificados. Devem ser utilizadas substâncias químicas de referência e/ou padrões biológicos oficializados pela Farmacopéia Brasileira ou por outros códigos autorizados pela legislação vigente. 3.3 Parâmetros 3.3.1 Especificidade/Seletividade Os ensaios de especificidade verificam se o método empregado não sofre interferência dos excipientes presentes na formulação e do diluente usado na preparação da amostra (BRASIL, 2003). a) Método Deverão ser preparadas as soluções: Controle positivo: soluções padrão nas concentrações empregadas para o ensaio. Controle negativo: solução contendo diluente na maior concentração. Soluções teste do placebo: a partir do placebo, preparar as três soluções problemas, equivalentes às concentrações empregadas para o ensaio 3X3, indireto quantitativo, blocos ao acaso, pelo método de difusão em ágar. Fazer 3 placas comparando-se as soluções padrão (controle positivo) e diluente (controle negativo) e 6 placas comparando-se as soluções padrão (controle positivo) e as soluções teste do placebo, ensaio 3x3. Os resultados devem ser registrados fotografando-se as placas do ensaio e medindo os halos de inibição. b) Critérios de aceitação Controle positivo: padrão formação de halo de inibição Controle negativo: diluente ausência de halo de inibição, ou se houver, será admitida uma interferência de no máximo 2,0%. Soluções teste do placebo: ausência de halo de inibição nas três soluções, ou se houver, será admitida uma interferência de no máximo 2,0%. 3.3.2 Linearidade

11 a) Método Realizar doseamento do padrão de potência conhecida em, no mínimo, cinco concentrações diferentes dentro dos limites percentuais do analito, através do método de difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3X3, delineamento do tipo blocos ao acaso. Traçar a curva experimental e a resultante de tratamento matemático, o coeficiente angular, o intercepto da reta, o coeficiente de correlação linear e calcular a regressão linear. b) Critérios de aceitação Coeficiente de correlação linear deve ser igual ou superior a 0,95. As respostas serão avaliadas em termos de halo de inibição. 3.3.3 Precisão a) Método: Realizar o doseamento a partir do placebo contaminado 100% ou da matéria prima a ser validada, comparando-se com um padrão de potência conhecida, através do método de difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3X3, delineamento do tipo blocos ao acaso. Para repetibilidade serão feitas seis determinações a 100% em um mesmo dia. Cada réplica ou bloco comporta as três concentrações do padrão e da amostra. Para precisão intermediária os ensaios serão realizados em dois dias. Calcular a potência de acordo com Anexo I. Calcular o DPR através da fórmula: DPR = DP x 100 CMD onde, DPR é o desvio padrão relativo, DP é o desvio padrão e CMD é a concentração média determinada. b) Critérios de aceitação Para repetibilidade: DPR 15% para as 6 análises realizadas no mesmo dia. Para precisão intermediária: DPR 15% para as análises realizadas nos dois dias.

12 3.3.4 Exatidão a) Método: Realizar o doseamento a partir do placebo contaminado ou da matéria prima a ser validada, em concentração baixa, média e alta, contemplando o intervalo linear do método, comparando-se com um padrão de potência conhecida, através do método de difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3X3, delineamento do tipo blocos ao acaso. A alíquota de placebo a ser adicionada deverá conter a quantidade de excipientes correspondente à diluição da amostra na concentração de trabalho do método analítico. Calcular a potência e os limites de confiança de acordo com Anexo I. Calcular a recuperação do método através da fórmula: Exatidão = concentração média experimental x 100 concentração teórica b) Critérios de aceitação O método é exato se a média de recuperação se mantiver no intervalo de 95% a 115% e os resultados individuais estiverem compreendidos na faixa de especificação do produto. O método é exato se a média de recuperação se mantiver no intervalo de 95% a 115% e os resultados individuais forem maiores que o limite inferior especificado para matéria-prima. 3.3.5 Intervalo É derivado do estudo de linearidade e estabelecido pela confirmação de que o método apresenta exatidão, precisão e linearidade adequadas quando aplicados a amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado. De acordo com a RE nº 899/2003, os doseamentos microbiológicos são classificados como categoria I: método analítico para a quantificação de matérias-primas ou substâncias ativas em produtos acabados, devendo ser avaliados os parâmetros de especificidade, precisão, exatidão, linearidade, intervalo e robustez.

13 A robustez é definida como sendo a capacidade do método de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em suas condições ambientais e operacionais em análises de amostras supostamente idênticas. Como no doseamento microbiológico de antibióticos a principal causa de erros é o reagente biológico, que no caso é o microrganismo que exige condições específicas para o seu crescimento, não admitem-se variações no método, tornandose imprescindível o emprego de padrões de referência adequados para se obter as potências relativas e o emprego de métodos estatísticos em cada ensaio para a análise dos resultados. A análise estatística é o procedimento matemático aplicado aos resultados experimentais para estimar a potência da amostra e avaliar a validade do ensaio. A cada ensaio microbiológico determina-se a potência relativa de uma amostra comparada a um padrão de potência conhecida, com um intervalo de confiança de 95%. Para que o ensaio seja considerado válido, são verificados os parâmetros estatísticos através da regressão linear e análise de variância. Estes testes verificam a cada ensaio a linearidade, o intervalo e a precisão no nível de repetibilidade. Assim, para que um método microbiológico seja considerado validado devem ser realizados os testes para verificação dos seguintes parâmetros de validação: especificidade, linearidade, exatidão, precisão (repetibilidade e intermediária) e intervalo. 5 RESULTADO E DISCUSSÃO Foi necessário criar o protocolo de validação do Sulfato de Neomicina matéria-prima para adaptar ao novo método exigido pela Farmacopéia Brasileira 5ª edição. O protocolo se encontra em anexo e para o método ser considerado validado deve-se executar o protocolo. REFERÊNCIAS AMARAL, Fernando Daniel. Validação de Métodos Analíticos Microbiológicos. Revista Controle de Contaminação. São Paulo, n.8, jan. 2006. DIFCO,BD. Antibiotic Assay Medium 11. Disponível em: http://www.interlabdist.com.br/dados/produtos/bula/doc/1586048dd3e60b1851.doc, acesso 05 de dezembro. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-RE nº899, de 29 de maio de 2003, que trata de Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. BRASIL. FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 5ª edição, Brasília: 2010.

14 ESMERINO, Luís Antônio et.al 2004. Método microbiológico para determinação da potência de antimicrobianos. Disponível em http http://www.uepg.br/propesp/publicatio/bio/2004_1/06.pdf. Acesso em 04 de dezembro de 2012. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 4.ed. São Paulo: Atheneu, 6 fascículo, 1988. p. 314-314.1. SOLANO, Gabriela Reis. Desenvolvimento de método microbiológicos para doseamento de Gramicidina matéria-prima. 2008. Dissertação (Pós graduação em ciências farmacêutica). Universidade Federal de Minas Gerias. Disponível em http://dspace.lcc.ufmg.br/dspace/bitstream/1843/emco-7smhyx/1/disserta o_final.pdf>. Acesso em: 12 setembro de 2012. PINTO, Terezinha, et al. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2010. p. 634-688. RANG & DALE, et al. Fármacos usados na tratamento das infecções e do câncer. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier 2007. p. 670-671. THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA USP 31 and The National Formulary NF 26. Rockville: The United States Pharmacopeial Convention. 2008. General Chapter <81> p. 681-686. VALENTINI, Sóstenes Rosa, et al. Validação de métodos analíticosna quantificação de comprimidos de Captopril comparação de metodologias para um programa de garantia da qualidade. Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2002. Disponível em http://teses.eps.ufsc.br/defesa/pdf/8241.pdf>. Acesso em: 04 dezembro de 2012. APÊNDICE APÊNDICE A PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO DE DOSEAMENTO DO SULFATO DE NEOMICINA MATÉRIA-PRIMA A. OBJETIVO Descrever as análises a serem realizadas para validação do método microbiológico de doseamento da matéria-prima Sulfato de Neomicina B. APLICAÇÃO Laboratório Analítico de Qualidade Microbiológico C. DEFINIÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS

15 DPR: desvio padrão relativo CV: coeficiente de variação D. DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO 1. LOTES DE AMOSTRAS UTILIZADOS NA VALIDAÇÃO Padrão primário Fabricação: 2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL - Metodologia: O método utilizado para determinação de sulfato de neomicina foi desenvolvido de acordo com a Farmacopéia Brasileira 5ª edição. - Serão avaliados os seguintes parâmetros: Especificidade Precisão (repetibilidade e precisão intermediária) Linearidade Exatidão Intervalo 3. MATERIAIS 3.1 Aparelhos Balança analítica Sartorius modelo CP225D, com precisão de 0,05mg e peso máximo 220g com desvio = 0,01 mg. TAG: Calibrado por: Data calibração: Certificado de Calibração: Balança analítica Sartorius modelo CP224S, com precisão de 0,1mg e peso máximo 220g com desvio = 0,1 mg. TAG: Calibrado por: Data calibração: Certificado de Calibração: Espectrofotômetro UV-vis Shimadzu modelo 1601

16 TAG: Qualificado por: Data qualificação: Termômetro do Banho-maria Fanem modelo 146 TAG: Calibrado por: Data calibração: Estufa de cultura Jouan TAG: Qualificado por: Data qualificação: Agitador de tubos Fanem modelo 251 Vidraria Classe A Pirex com Certificado de Calibração. 08 placas de Petri 01 pinça 48 cilindros em aço inox com diâmetro interno de 6 mm ± 0,1 mm, diâmetro externo de 8 mm ± 0,1 mm e altura de 10 mm ± 0,1 mm. 3.2 Padrões e Reagentes Padrão de sulfato de neomicina Fabricante: Lote do fabricante: Potência: Meio nº11 Fabricante: Lote do fabricante: Fosfato de potássio dibásico Fabricante: Lote do fabricante: Fosfato de potássio monobásico Fabricante: Lote do fabricante: Éter etílico Fabricante:

17 Lote do fabricante: Água purificada 4. METODOLOGIA Método: o método utilizado para determinação quantitativa de sulfato de neomicina matériaprima será o de difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3 X 3, delineamento blocos ao acaso. Microrganismo padrão: Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Leitura: diâmetro dos halos de inibição Especificação: contém, no mínimo, 600UI da quantidade declarada de neomicina. Preparo da solução amostra (previamente dessecada): Pesar, exatamente, o equivalente a 25 mg de neomicina (verificar o exemplo abaixo para cálculo da quantidade de sulfato de neomicina a ser pesada)* e transferir para balão volumétrico de 25mL. Diluir e completar o volume com tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, ph 8,0 (esta solução contém 1000 µg/ml). Homogeneizar. Desta solução pipetar: - 1,0 ml para balão volumétrico de 200,0 ml (A 1 = 5 µg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 100,0 ml (A 2 = 10 µg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 50,0 ml (A 3 = 20 µg/ml) Diluir, completar o volume das soluções com tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, ph 8,0 e homogeneizar. Preparo da solução padrão (previamente dessecado): Pesar, exatamente, o equivalente a 25 mg de neomicina padrão (verificar o exemplo abaixo para cálculo da quantidade de sulfato de neomicina a ser pesada)* e transferir para balão volumétrico de 25mL. Diluir e completar o volume com tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, ph 8,0 (esta solução contém 1000 µg/ml). Homogeneizar. Da solução padrão estoque pipetar: - 1,0 ml para balão volumétrico de 200,0 ml (P 1 = 5 µg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 100,0 ml (P 2 = 10 µg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 50,0 ml (P 3 = 20 µg/ml) Diluir, completar o volume das soluções com tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, ph 8,0 e homogeneizar. * Exemplo do cálculo de sulfato de neomicina a ser pesado em relação à neomicina. Potência do padrão: 752 µg/mg (equivalente a 0,752 mg/mg)

18 Se a cada 1 mg de sulfato de neomicina tem-se 0,752 mg de neomicina, então deve-se pesar 33,24 mg de sulfato de neomicina, o equivalente a 25 mg de neomicina padrão. 0,752 mg neomicina 1 mg sulfato de neomicina 25 mg neomicina X X = 33,24 mg de sulfato de neomicina Preparo do inóculo: A) Manutenção do microrganismo: manter o microrganismo em meio nº 01 inclinado e transferi-lo através de repique mensal. Incubar um novo repique por 24 horas a 32-35 C e guardá-lo sob refrigeração. B) Preparo da cultura de trabalho: repicar o microrganismo em meio nº 01 e incubar por 24 horas a 35 C. C) Preparar suspensão com 25% de transmitância, a 580nm, utilizando salina. Transferir 1,0 ml dessa suspensão para um erlenmeyer contendo 100,0 ml de meio nº11 mantido a 45-50 C. Procedimento: Tomar 08 placas de Petri esterilizadas, adicionar em cada uma 20,0 ml de meio nº11 e deixar solidificar (camada base). Adicionar em cada placa 5 ml de meio inoculado e deixar solidificar (camada superfície). Colocar 6 cilindros esterilizados em cada placa. Adicionar por meio de micropipeta 0,2 ml de cada diluição do padrão (P 1, P 2, P 3 ) e do desconhecido (A 1, A 2, A 3 ) de maneira que se alternem padrão e desconhecido. Incubar as placas a 32 C a 35 C por 16 18 horas. Medir os halos de inibição usando paquímetro. Calcular o teor de neomicina na amostra a partir da potência do padrão e das respostas obtidas com a Solução padrão e com a Solução amostra. 5. TESTES PARA VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA 5.1 Especificidade: As soluções utilizadas no ensaio de especificidade deverão ser preparadas conforme descrito no preparo das soluções padrão e problema do item 4. Controle negativo: solução tampão ph8,0 (D 3 ). Soluções teste do placebo: a partir do padrão primário, preparar as três soluções problemas, equivalentes às concentrações de 5µg/mL (A 1 ), 10 µg/ml (A 2 ) e 20 µg/ml (A 3 ).

19 Controle positivo: solução padrão nas concentrações 5 µg/ml (P 1 ), 10µg/mL (P 2 ) e 20 µg/ml (P 3 ). Preparar 3 placas comparando as soluções padrão P 1, P 2 e P 3 com a solução tampão ph8,0 (D 3 ). Preparar 6 placas comparando as soluções padrão P 1, P 2 e P 3 com as soluções teste do placebo A 1, A 2 e A 3. O ensaio deverá ser conduzido como descrito no item 4. Os resultados devem ser registrados fotografando-se as placas do ensaio e medindo-se os halos de inibição, caso tenha formação de halo a partir do placebo. 5.2 Linearidade Pesar, exatamente, o equivalente a 25 mg de neomicina padrão (verificar o exemplo acima para cálculo da quantidade de sulfato de neomicina a ser pesada)* e transferir para balão volumétrico de 25mL. Diluir e completar o volume com tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, ph 8,0 (esta solução contém 1000 µg/ml). Homogeneizar. Dessa solução pipetar: - 0,25mL para balão volumétrico de 200,0 ml (P 1 = 1,25 μg/ml) - 0,5 ml para balão volumétrico de 200 ml (P 2 = 2,5 μg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 200,0 ml (P 3 = 5 µg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 100,0 ml (P 4 = 10 µg/ml) - 1,0 ml para balão volumétrico de 50,0 ml (P 5 = 20 µg/ml) - 2,0 ml para balão volumétrico de 50 ml (P 6 = 40 μg/ml) Diluir e completar o volume com tampão ph 8,0 e homogeneizar. Selecionar 08 placas de Petri esterilizadas, adicionar em cada uma 20,0mL de meio nº11 e deixar solidificar (camada base); Adicionar em cada placa 5mL de meio nº11 inoculado com 1,0% de Staphylococcus aureus a 25%T a 580nm, e deixar solidificar (camada superfície); Colocar 6 cilindros esterilizados em cada placa, com auxilio de uma pinça; Adicionar, por meio de micropipeta de 0,3 ml, cada diluição do padrão (P 1, P 2, P 3, P 4, P 5 e P 6 ); Incubar as placas a 37 C por 16 18 horas; Medir os halos de inibição usando paquímetro. Traçar as curvas experimental e a resultante de tratamento matemático, o coeficiente angular, o intercepto da reta, o coeficiente de correlação linear e calcular a regressão linear.

20 5.3 Precisão Pesar o equivalente a 25mg de neomicina padrão, transferir para um balão de 25mL (matéria-prima 95%). Realizar o doseamento a 95% comparando com o padrão de potência conhecida através do método difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3 X3, delineamento do tipo blocos ao acaso. Para repetibilidade serão feitas seis determinações a 95% em um mesmo dia. Para precisão intermediária os ensaios serão realizados em dois dias. Calcular a potência de cada determinação e o DPR para repetibilidade e precisão intermediária. 5.4 Exatidão Realizar doseamento a partir do piloto a 75%, 95% e 115%, comparando com um padrão de potência conhecida através do método de difusão em ágar, ensaio indireto quantitativo, retas paralelas 3 X 3, delineamento do tipo blocos ao acaso. Calcular a potência, os limites de confiança e a recuperação. 5.5 Intervalo É derivado do estudo de linearidade e estabelecido pela confirmação de que o método apresenta exatidão, precisão e linearidade adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado.