TRANSFERIBILIDADE DE MARCADORES MICROSSATÉLITES DE MELÃO PARA MELANCIA Maia, A. K. S (1) ; Albuquerque, L. B. (1) ; Antonio, R. P. (2) ; Silveira, L. M. (3) ; Nunes, G. H. S (1) ; Silva, A. E. A (1) ; Dantas, A. C. A (1) anakellyblz@hotmail.com (1) Laboratório de Biotecnologia Molecular Vegetal da Universidade Federal Rural do Semi-Árido UFERSA, Mossoró - RN, Brasil; (2) Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Semi Árido, Mossoró - RN, Brasil; (3) Laboratório de Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA, Mossoró - RN, Brasil; RESUMO A família curcubitaceae possui diversas espécies economicamente importantes para a região Nordeste do Brasil, como a melancia. Para melhorar as condições de cultivo dos produtores, programas de melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos para esta espécie. Sendo uma de suas etapas a análise da variabilidade genética entre as variedades cultivadas. Considerando o elevado custo necessário para o desenvolvimento de primers microssatélites, a transferibilidade dos mesmos entre espécies aparentadas é bastante apropriada. Diante disso, o objetivo desta pesquisa foi analisar a transferibilidade de 30 primers microssatélites de melão para melancia. De todos os primers analisados, 77% foram transmissíveis, desta forma, os mesmos
podem ser utilizados como ferramentas de auxílio em programas de melhoramento para a melancia. Palavras- chave: Marcadores moleculares, acessos, SSR INTRODUÇÃO A família Cucurbitaceae é formada por 118 gêneros e contém aproximadamente 825 espécies. Com significativa presença no agronegócio brasileiro, e de bastante importância na agricultura familiar, esta família apresenta espécies em cultivo como o melão (Cucumis melo) e a melancia (Citrullus lanatus), entre outros que colaboram para o seu destaque na economia brasileira (LEITE et al., 2007). Atualmente, programas de melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos para esta espécie com o objetivo de se desenvolver variedades mais promissoras quanto ao aumento de produtividade e resistência a doenças. Uma das etapas dos programas de melhoramento consiste na análise de variabilidade genética entre as variedades cultivadas da espécie em questão através do uso de marcadores moleculares. 2
Existem atualmente diversas classes de marcadores moleculares, dentre eles, podemos destacar os marcadores microssatélites. Os marcadores moleculares microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats) são amplamente utilizados em estudos genéticos de plantas e animais, devido a sua expressão codominante e multialélica, contendo a mais elevada informação de polimorfismo entre todos os marcadores moleculares. Devido seu alto polimorfismo o SSR é extremamente empregado em estudos de diversidade e mapeamento genético de características de interesse agronômico (FERREIRA; GRATTAPAGLIA,1998). Entre muitas espécies esse marcadores se encontram bem relacionados, tornando possível a transferência de uma espécie para outra, podendo visualizar o grau de semelhança entre estas (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Muitas transferências de marcadores microssatélites realizados tiveram resultados positivos, dentre estas a transferibilidade para espécies da mesma família como o melão e a melancia (LAMAS et al., 2006). Diante disso, o objetivo deste trabalho foi verificar a transferibilidade de 30 primers SSR desenhados para melão em melancia. 3
MATERIAL E MÉTODOS Trinta primers SSR desenvolvidos para melão foram testados em dois acessos de melancia oriundos de uma coleção pertencente a UFERSA, sendo os mesmos divergentes quanto a diversas características morfoagronômicas. Dois acessos de melancia, coletados em diferentes cidades do estado do Rio Grande do Norte, pertencentes a coleção de acessos de melancia da UFERSA, foram plantados em casa de vegetação e suas folhas foram colhidas para extração de DNA 15 dias após a germinação das sementes, conforme protocolo de Doyle e Doyle (1990) com modificações. A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose a 0,8% (p/v), comparando visualmente a intensidade das bandas do DNA dos genótipos extraídos com bandas de peso molecular conhecido de 100pb. Após a quantificação, as amostras foram diluídas em água ultrapura e padronizada em 10ng/µl para serem utilizadas nas reações de PCR. Cada amostra de DNA genômico total foi amplificada com os 30 pares de primers SSR, os quais foram otimizados para então serem testados nesses genótipos. Para cada reação de PCR foi utilizado um mix contendo 20 g de DNA, 100 µm de cada um dos dntps, 1U de taq 4
DNA polimerase, tampão composto de 50 mm de TRIS ph 8,3, 20mM de KCl, 2mM de MgCl 2, 10µg de BSA, 0,25% de Ficoll 400, 10mM de tartrazine, 5mM de primer (2,5 mm de Forward e 2,5 mm de Reverse) e água ultrapura. O volume final para cada reação foi de 12µl. A amplificação foi realizada em termociclador modelo Mastercycler Eppendorf, no qual foi empregado o seguinte programa: cinco minutos, a 95ºC, para desnaturação do DNA; oito ciclos, em que foram usados 20 segundos, à temperatura de 94ºC para desnaturação; 20 segundos para anelamento do primer, cujas temperaturas foram de 46ºC a 68ºC de acordo com o primer; 1 minuto a 72ºC para extensão de DNA; 24 ciclos que diferiram dos primeiros apenas na temperatura de anelamento que variaram de 52ºC a 65ºC e uma extensão final, por quatro minutos, a 72ºC. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese horizontal por uma hora a 80 V em gel de agarose a 3%, corados com brometo de etídio (0,5µg/ml), visualizados em transluminador de luz ultra-violeta e fotografados com câmera digital para verificação do perfil eletroforético obtido. Para análise dos géis, adotou-se os critérios estabelecidos por Kuleung et al. (2004). Desta forma, procedeu-se a construção de um score para os primers que amplificaram fragmentos de tamanho esperado de 5
acordo com a intensidade do sinal e a facilidade de avaliação, sendo (1) sinal forte e facilidade de avaliação; (2) sinal fraco e facilidade de avaliação; (3) sinal fraco e difícil avaliação e (4) ausência de sinal. RESULTADOS E DISCUSSÃO Para o conjunto de primers de melão (C. melo) otimizados até o momento para melancia (C. lanatus), 77% mostraram-se promissores. Esse valor de transferibilidade é maior que o encontrado por (Lama et al., 2006) de aproximadamente 49% testando a transferibilidade de primers entre essas mesmas espécies. Outros trabalhos estimaram a transferibilidade de melão para outras espécies da família Curcubitaceae e obtiveram taxas de transferibilidade de 21, 50, 60% respectivamente (LIRA et al., 2008; DANIN-POLEG et al., 2001; LEITE et al., 2007). Tais resultados demonstram que o nível de transferibilidade no gênero Cucumis se assemelha a outras comparações intra-genus como em trigo onde observou-se que até 17% de microssatélites desenvolvidos para esta espécie foram transferidos para centeio (KULEUNG et al., 2003). Nesta pesquisa, somente os scores 1 e 2 foram considerados como amplificação positiva. Na análise realizada, aproximadamente 80% dos primers testados produziram um perfil de bandas em pelo menos um 6
dos genótipos de melancia. A grande maioria das bandas amplificadas apresentaram um excelente padrão de amplificação. Somente as bandas mais nítidas foram analisadas. Figura 1 Padrão eletroforético de genótipos de melancia amplificadas com SSR de C. melo em gel de agarose a 3%. Os resultados deste trabalho facilitarão estudos de variabilidade, mapeamento e genética comparativa. Da mesma forma, a possibilidade de utilização de marcadores SSR de melão para acesso ao polimorfismo de DNA em espécies de curcubitáceas representa uma redução significativa de custo e tempo no desenvolvimento de marcadores. CONCLUSÃO Os resultados obtidos neste trabalho são promissores para estudos de melhoramento genético de espécies da família das curcubitáceas. 7
Todos os primers que foram transferíveis podem ser utilizados como ferramentas para auxiliar programas de melhoramento. REFERÊNCIAS LEITE, T. L.; MARCO, A. F.; TARCHETTI, B. D.; FERREIRA, M. A. J. F.; AMARAL, Z. P. S.; BUSO, G. S. C. Análise de transferibilidade de primers microssatélites de Cucumis melo para Curcubita moschata e Luffa cylindrica. Brasília, 2007. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.Ed. Brasília: EMBRAPA/CENARGEN, 1998. 220p. DOYLE, I.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant from fresh tissue. Focus, Rockville, v.12, p.13-15, 1990. KULEUNG, C. ; BAENZIGER, P. S. ; DWEIKAT, I. Transferability of SSR markers among wheat, rye, and triticale. Theoretical Applied Genetics, v. 108, p. 1147-2004. LAMAS,N.S. ;FERREIRA, M. A. ; AMARAL, Z. P. De S. ; VIEIRA, J. V. ;FERREIRA, M. A. J. da F. ; BUSO, G. S. C. Detecção de polimorfismo em melancia com primers microssatélites de melão. In : 47 CONGRESSO BRASILEIRO DE OLERICULTURA, 2007, PORTO SEGURO. Revista da Associação Brasileira de Horticultura. Brasília : Associação Brasileira de Horticultura, 2007. V. 25, p. 94-94. OLIVEIRA, M. S. P., et al. Variabilidade genética entre acessos de açaizeiro utilizando marcadores microssatélites. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.34, p. 1253-1260, 2010. LIRA, M. T. R. ; PEIXOTO, A. A. P. ; FERREIRA, M. A. ; FERREIRA, M. A. J. F. ; LAMAS, N. S. ; AMARAL, Z. P. S. ; BUSO, G. S. C. ; 2008. transferibilidade, otimização e caracterização de marcadores microssatélites de melão para bucha. 8