Genética IV: Genética Bioquímica

de 6 Genética IV: Genética Bioquímica 1. Genética Populacional Este campo avançou em virtude das leis propostas por dois indivíduos: Hardy e Weinberg (1908) Suponha que em uma população existam 2 alelos para um determinado gene, A e a. Alelos: A a Freqüência: p q há apenas dois alelos para o gene, então p + q = 1 A freqüência com que o alelo "A" estará no óvulo (em fêmeas) = p A freqüência com que o alelo "a" estará no óvulo = q AA = p 2 Aa = 2pq AA : Aa : aa Aa = q 2 p 2 2pq q 2 Esta é a distribuição de equilíbrio chamada de equilíbrio de Hardy-Weinberg Se você conhece as Freqüências de Alelos, você pode calcular as freqüências de genótipo: (p+q) 2 = 1 p 2 + 2pq + q 2 = 1 No Equilíbrio Hardy-Weinberg: AA = p 2 Aa = 2pq Aa = q 2 Presumindo um equilíbrio, as freqüências de alelos (e assim, as freqüências genotípicas) não se alteram

de 6 ao longo do tempo. As freqüências de alelos tendem a manter-se constantes nas populações. Exemplo: fibrose cística (doença autossômica recessiva) Freqüência de indivíduos em uma população com fibrose cística é 1/2000 Onde A = alelo normal ou de tipo selvagem e a = alelo de fibrose cística (doença) q 2 (indivíduos afetados) = 1/2000 então q = = 1/44 portanto p = 43/44 Freqüência de Portadores: 2pq = 2(43/44)(1/44) ~.044 = 1/22 Assim, cerca de 5% da população é portadora Por que doenças como a fibrose cística (fc) ainda são prevalentes em certas populações? Os heterozigotos que carregam o alelo mutante podem ter uma certa vantagem, como maior resistência a infecção por cólera, assim um alelo ainda se encontra na população. 2. Genética Bioquímica Archibald Garrod uniu uma falha genética a uma falha enzimática. A Genética Bioquímica usa a genética experimental para dissecar a bioquímica Sistema Experimental: Levedura: fungo unicelular, eucariota (possui núcleo) Pegue uma suspensão de células de levedura e espalhe em um meio sólido de ágar em uma placa de Petri que contenha nutrientes. Ao longo do tempo, essas unicélulas crescem no ágar em aglomerados visíveis chamados colônias. Cada colônia representa uma pilha de células idênticas, cada uma um descendente da unicélula colocada nessa posição. Ciclo de Vida da Levedura A levedura pode crescer como diplóide (2n) ou haplóide (n) n=16 cromossomos na levedura

de 6 Requisitos de Crescimento A levedura pode crescer em um meio mínimo: meio líquido ou sólido que contenha: uma fonte de carbono (um açúcar fermentável como glicose, frutose ou lactose), nitrogênio, fósforo, sais. A levedura possui vias biossintéticas pelas quais pode criar todos os componentes biológicos requeridos a partir dos nutrientes simples fornecidos em um meio mínimo. A levedura também pode crescer em meio enriquecido: meio sólido ou líquido que contém nutrientes complexos e macromoléculas. As células de levedura irão retirar os nutrientes do meio em vez de sintetizá-los. A levedura pode desabilitar suas vias sintéticas e usar o que estiver disponível no meio ao regular as enzimas envolvidas nas vias. A levedura pode sintetizar aquilo que precisa A levedura também pode obter nutrientes do meio Para entender essas vias biossintéticas, precisamos caracterizar leveduras que não possuem certas enzimas e assim não podem crescer sob certas condições. Por exemplo Como você isolaria os genes/proteínas envolvidos na síntese de aminoácidos (por ex., a síntese de arginina)? Você poderia encontrar leveduras que não podem sintetizar a arginina. Você iria em busca dos mutantes (procura pelas leveduras mutantes que não podem crescer sem a adição de arginina ao meio de crescimento) Estratégia de Busca aos Mutantes comece com células de levedura de tipo selvagem mutagenize essas células com produtos químicos ou radiação para danificar o DNA coloque uma fina camada de células mutagenizadas em placa de ágar em meio enriquecido transfira as colônias de levedura para uma placa com meio mínimo procure por colônias que não podem crescer em meio mínimo mutantes que possuam algum tipo de defeito em uma via biossintética a forma em que você projeta uma busca por mutantes irá determinar os mutantes que encontrará Assim que você obtiver uma coleção de mutantes que não podem crescer em um meio mínimo sem um suplemento, é preciso determinar qual componente (suplemento nutricional) os mutantes precisam para crescimento em meio mínimo. Por exemplo, procure por uma cepa mutante que não possa sintetizar a arginina: Coloque uma fina camada de células em placa com meio enriquecido transfira para meio mínimo + arginina transfira para meio mínimo Todas as células crescem em meio enriquecido. Todas as colônias crescem em meio mínimo, exceto as que possuem deficiência em uma via biossintética. As que forem deficientes na via sintética de arginina crescerão no meio mínimo com arginina. (Você também poderia fazer a seleção em meio enriquecido arginina. As colônias que não crescessem nesse meio seriam mutantes com relação à síntese de arginina) Se testássemos o crescimento de levedura em meio enriquecido vs. meio mínimo, poderíamos obter uma

de 6 variedade de mutantes chamados auxótrofos Definições: Prototrofos: cepa de tipo selvagem que pode crescer em meio mínimo Auxótrofos: Cepa mutante que perdeu a capacidade de crescer em meio mínimo Os mutantes isolados acima que não crescem em meio mínimo, mas em meio mínimo + arginina, são chamados auxótrofos de arginina. Mas para analisar um grande número de células precisamos de uma maneira melhor para avaliar o crescimento sob certas condições e fazer triagem de mutantes. Uma técnica chamada réplica de placas foi desenvolvida por Esther Lederberg (usando seu aplicador de pó compacto facial) A Réplica de Placas é a transferência de todas as colônias na mesma ordem entre duas placas pressionando as placas levemente sobre um pedaço de veludo. Você pode fazer esse tipo de triagem para isolar mutantes com perda de função. Dois tipos de Ensaios para procurar colônias que possuem uma propriedade ou função desejada 1. Triagem Genética: Procure por todas as colônias que crescem e então procure as que não cresceram em determinado meio. A triagem por mutantes que perderam uma função sua capacidade de crescer sob certas condições. 2. Seleção Genética: Procure por colônias que possam crescer em determinado meio. Selecione os mutantes que ganharam uma função a capacidade de crescer sob certas condições (condições que normalmente não permitiriam o crescimento, como resistência às drogas) Para estudar os mutantes que são incapazes de crescer em arginina é preciso fazer uma coleção de

de 6 auxótrofos de arginina mutantes que precisam apenas de arginina para crescer em meio mínimo. Para obter esses mutantes é preciso usar células de levedura haplóides possuem apenas 1 cópia (n) de cada gene. Não é possível usar levedura diplóide (2n) pois uma mutação em 1 dos 2 genes não é suficiente para a auxotrofia. Isto ocorre pois o nível de enzimas produzido por 1 cópia do gene (metade dos níveis normais) é suficinte para a função normal Observe a levedura haplóide vs. diplóide: Haplóide: 1 mutação no gene da arginina leva a auxotrofia de arginina Diplóide: 1 mutação no gene da arginina não leva a auxotrofia de arginina porque o outro gene é de tipo selvagem Para que fossem auxotróficos de arginina, ambas as cópias do gene da arginina precisariam ser mutantes; é raro encontrar leveduras diplóides que possuam duas mutações no mesmo gene 3. Caracterização de Mutantes Colete diversas cepas mutantes de levedura auxotróficas em arginina chame-as de Arg1, Arg2, Arg3 etc. Então, pergunte-se se esses indivíduos são mutantes no mesmo gene ou em genes diferentes? Para fazer isto, primeiro teste se as mutações estão causando um fenótipo recessivo. 1. Teste de Recessividade: a perda de função enzimática é normalmente recessiva ao fenótipo de tipo selvagem normalmente, 50% do produto de um gene é suficiente para se exibir um fenótipo de tipo selvagem para uma falha enzimática é comum que apenas 1 cópia de tipo selvagem do gene seja suficiente para exibição do fenótipo de tipo selvagem. Cruze duas cepas haplóides: Arg1 com tipo selvagem para gerar uma célula diplóide. Se o fenótipo da célula diplóide resultante for do tipo selvagem, então o fenótipo associado com o mutante Arg1 é recessivo em relação ao tipo selvagem. 2. Teste de Complementação Faça um teste de complementação para determinar se duas mutações diferentes estão no no mesmo gene ou em genes diferentes. Cruze dois mutantes haplóides para gerar uma célula diplóide e analisar o fenótipo de diplóide. a) Se as mutações estiverem no mesmo gene (i. e., o gene defeituoso no mutante Arg1 é o mesmo no mutante Arg2), então o diplóide resultante não poderá crescer em meio mínimo. Como ambos os mutantes carregam mutações no mesmo gene, o diplóide não possui uma enzima funcional o diplóide não pode crescer sem a adição de Arginina ao meio. **Quando Arg1 e Arg2carregam mutações no mesmo gene e o diplóide resultante exibe um fenótipo mutante, então os mutantes Arg1 e Arg2 não se complementam. Diz-se que estão no mesmo grupo de complementação.

de 6 b) Se as mutações estiverem em genes diferentes (i. e., o gene defeituoso no mutante Arg1 é diferente do gene defeituso no mutante Arg2), então o diplóide resultante crescerá em meio mínimo. Cada mutante possui uma mutação em um gene diferente, assim o diplóide possui todas as enzimas funcionais e pode crescer em meio mínimo. **Quando Arg1 e Arg2 carregam mutações em genes diferentes e o diplóide resultante exibe um fenótipo de tipo selvagem, então os mutantes Arg1 e Arg2 se complementam. Diz-se que estão em grupos de complementação diferentes. Em geral, as mutações em genes diferentes complementam-se, restaurando a protrofia no diplóide (cada mutante resgata o defieto do outro). Pode-se fazer um teste de complementação entre haplóides diferentes e criar uma tabela: Tipo selvagem Arg1 Arg2 Arg3 Arg4 Tipo selvagem + + + + + Arg1 + - - + + Arg2 + - - + + Arg3 + + + - - Arg4 + + + - - + significa complementação, o diplóide possui o fenótipo de tipo selvagem - significa sem complementação, o diplóide possui o fenótipo mutante *Observe que Todos os mutantes são recessivos em relação ao tipo selvagem Os mutantes 1 e 2 não se complementam: assim, estão no mesmo grupo de complementação e presumese que sua mutação esteja no mesmo gene Os mutantes 3 e 4 não se complementam: assim, estão em grupos de complementação diferentes e presume-se que sua mutação esteja no mesmo gene. Os mutantes 1 e 4 complementam-se: assim, presume-se que sua mutação esteja em genes diferentes. A tabela cima sugere a existência de dois grupos de complementação ou, provavelmente, dois genes envolvidos na síntese da arginina.