Diagnóstico de infecções virais

Diagnóstico de infecções virais

Diagnóstico de infecções virais Duas formas: -buscar o vírus ou seu genoma Ou - buscar a resposta do organismo (especialmente anticorpos)

Problema/suspeita levantada a campo Diagnóstico presuntivo Encaminhamento ao laboratório Diagnóstico convencional Diagnóstico molecular Confirmação do diagnóstico Análises filogenéticas Tomada de decisão

1- na busca do vírus Diagnóstico de viroses Sinais clínicos Detecção do vírus, antígenos ou genomas Isolamento (+ detecção imunológica) Hemaglutinação (HA) ELISA PCR Deteção imunológica (IPX, IF) Microscopia eletrônica

Cultivo e identificação de vírus - inoculação em animais - inoculação em ovos embrionados - microscopia eletrônica - cultivos celulares -

CULTURA DE CÉLULAS Cultura de células é o processo pelo qual células são mantidas vivas e em multiplicação fora de seu tecido original, em condições controladas.

Cultivos celulares - cultivos primários (células diplóides) - linhas celulares (diplóide, 40 passagens ) - células de linhagem (número de passagens indefinido)

CULTIVO DE CÉLULAS Cultivo Primário - Preparadas diretamente das células obtidas de um tecido de um organismo - Sensível a vírus - Resiste poucas passagens ( máximo 20)

CULTURA DE CÉLULAS Células de linhagem Capacidade ilimitada de crescimento em cultura Derivadas de células tumorais Sofreram transformação espontânea ou induzida Cultivo primário senescente Algumas células sobrevivem Seguem multiplicando-se Tornam-se imortais

CULTIVO DE VÍRUS IN VITRO - Garrafas de Vidro - Garrafas de Plástico - Garrafas fechadas ou abertas (CO 2 ) -Garrafas estacionárias ou rolantes -Tubos de vidro ou plástico -Tubos com lamínulas (tubos de Leighton) - Placas de microtécnica com 6, 12, 24, 96 orifícios

Tubos de cultivos celulares em equipamento rotativo Microplacas de cultivos celulares

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): É o dano que o vírus causa à célula! - infelizmente, nem todos os vírus causam danos às células! - a maioria não causa dano nenhum!

BVDV Rotavírus FCV RSV

Adenovírus HSV

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): - lise - arredondamento - vacuolização - formação de sincícios - inclusões - picnose - apoptose

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: violeta de genciana)

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: carbazol)

Microscopia eletrônica

Hemaglutinação (HA) com vírus hemácias se entrelaçam e aderem às paredes Sem vírus Hemácias livres sedimentam

HEMAGLUTINAÇÃO

HEMAGLUTINAÇÃO Interpretação Reação positiva: presença de vírus Reação negativa: ausência de vírus

Hemaglutinação (HA) Infelizmente, Nem todos os vírus hemaglutinam! Alguns: Influenza (gripe) Rubéola Parvovírus Coronavírus Vários arbovírus Adenovírus e vários outros Parvo B19 Rubéola Arbovírus

Hemaglutinação (HA)

Hemaglutinação Diluição 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 Sem vírus prozona título

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA DE CAPTURA) Amostra a ser testada para a detecção de vírus Enzima +Substrato solúvel= cor no líquido vírus Anticorpo Detector Anticorpo de captura

Exemplos de ELISAs

Imunoperoxidase (IPX) Soro com anticorpos contra o vírus Enzima Anticorpo Detector Substrato insolúvel células coradas Microscópio Células infectadas com vírus

Imunoperoxidase Herpesvírus (coloração por imunoperoxidase)

Imunoperoxidase

Tabela 1. Perfís de reatividade de amostras brasileiras do vírus da raiva com um painel de anticorpos monoclonais anti-lyssavirus Anticorpos monoclonais Amostras 5A3 5G2 CVS-2 L3 L18 DB1 DB3 DB4 D3 DB9 M11 Bovinos (42) Morcegos (6) Felino (1) NA (1) CVS Caninos (8) Humano (1) Cachorro-do mato* (1) Morcegos (3) Canino (1) Cachorro-do-mato* (1) Reação positiva, Reação negativa

Imunofluorescência Direta anticorpo marcado sobre material infectado material infectado (suspeito) + anticorpo específico marcado com FITC + luz UV reação colorida

Imunofluorescência direta - raiva

Imunofluorescência Indireta Material infectado (células ou tecidos) + soro específico (ex: soro humano) + conjugado anti-igg específico (ex. anti-igg humana/fitc) + luz UV = reação colorida

Imunofluorescência- Herpes

Western blot (para a detecção de antígenos)

Reação da polimerase em cadeia (PCR) primers DNA viral Primeiro ciclo Segundo ciclo 20-40 ciclos Milhões de cópias

Amplificação pela reação da polimerase em cadeia (PCR) DNA FITA DUPLA DESNATURAÇÃO 4 PRIMEIROS CICLOS 4 primeiros DA PCR: ciclos fragmento a amplificar HIBRIDIZAÇÃO POLIMERIZAÇÃO 5-3 ADN nº de cadeias duplicadas 4 de comprimento correto: ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo 0 0 2 8

REA com Bgl II 1,5 kb 0,6 kb PV 022 Hum 568 Can 3558 Can 3462 Bov 189 Bov M03 Bov 97 Fel 1024 Morc 2138 Morc 2217 C.mato

MODIFICAÇÕES da PCR RT-PCR Nested-PCR Multiplex ADN fs RNA DNA fd RT PCR AAAAA AA ADN fd PCR 1 er par de primers PCR 2 do par de primers ADN fd PCR Possíveis múltiplos pares de primers

Análise do DNA viral com enzimas de restrição A B D E A B C D E F G, H, I J K L 30 20 15 10 6 Kbp M N 4 3 2 1

Kb HERPESVÍRUS RFLP BHV 1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a Kb 23,1 23,1 9,4 - RFLP 9,4 6,5 6,5 4,4 4,4 2,3 2,0 2,3 2,0 BamHI BstEII EcoRI HindIII

Análises filogenéticas BRfx2217 Cachorro-do-mato (2217) BRfx2263 Cachorro-do-mato (2263) Canino (585) BRdg585 rvu22862 Canino (rvu22862) AF070449Dr Morcego H (AF070449) Bovino 189 BRbv189 AF070450Tb Morcego NH (AF070450) BRbt576 Morcego NH (576) Felino (97) BRct97.1 BRbt686 Morcego NI (686) 4 2 0 Figura 4. Árvore filogenética baseada na sequência de aminoácidos deduzidas do sequenciamento de 225 pb do gene N. Origem da amostras: 2217 e 2263 (Cachorro-do-mato; Cerdocyon thous), 585 (canino), 189 (bovino), 576 (morcego não hematófago Molossus molossus), 97 (felino), 686 (morcego, espécie não identificada), rvu22862 (canino), AF070449 (morcego hematófago Desmodus rotundus), AF070450 (morcego não hematófago Tadarida brasiliensis).

Neuraminidase > aqui fica clara a origem do segmento 6 em suíno > amostras com quadrado vermelho

Hemaglutinina > sem valor filogenético, possível origem só com amostras de suíno Aqui as amostras recentes

Até aqui, só vimos métodos de detecção do agente! Como podemos detectar anticorpos?

Diagnóstico sorológico: Amostras de soro pareadas Nível de Anticorpos D o e n ç a IgM IgG Anticorpos IgG 0 30 60 90 Dias

Efeito da vacinação e doses de reforço nos níveis de anticorpos Anticorpos 2 a 3 a 4 a 1 a

A presença de anticorpos indica: - contato prévio com o agente! ou - Vacinação!!!

2- na busca de anticorpos Diagnóstico de viroses Quando os sinais clínicos já passaram Quando houve algum contato com o vírus Detecção de anticorpos: (usualmente no soro raramente no líquido céfalo-raquidiano (LCR) Soro-neutralização Imunodifusão Inibição da hemaglutinação (IH) Hemaglutinação passiva Imunoperoxidase para anticorpos Imunofluorescência indireta ELISAs (diversos) Western blot outros

Detecção de exposição ao vírus (sorologia= detecção de anticorpos) Soro/Vírus neutralização Diluir o soro seriadamente: ex: 1/2 1/4 1/8 1/16.1/512 Adicionar volume igual de vírus (100 DICC 50 ) a cada tubo ( ou orifício da placa) Incubar a 37 o C Colocar mistura sobre células Última diluição que evita multiplicação viral é o título -- 1/2 1/4 1/128 1/256 1/512 Sem soro

IMUNODIFUSÃO - Influenza + Soro c/anticorpos anti- H 3 N 2 (reação cruzada parcial Antígeno Soro c/anticorpos ou s/anticorpos Antígenos Identidade

IMUNODIFUSÃO Sem identidade Soro controle + +? + Ag? Soros em teste? + Identidade

Hemaglutinação (HA) com vírus hemácias aglutinam e aderem às paredes Sem vírus Hemácias livres sedimentam no orifício côncavo

Inibição da Hemaglutinação (HI) Hemácias vírus Anticorpos Inibição da HA (ou IH)

INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (HI) Resultado positivo PRESENÇA DE ANTICORPOS INIBIDORES DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA) Resultado negativo AUSÊNCIA DE ANTICORPOS INIBIDORES DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA)

Inibição da Hemaglutinação (HI) Controle de Vírus HA Anticorpos HI em animal vacinado 1 semana 8 semanas Negativo Positivo Diluições do soro 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 Controle de Vírus (sem soro)

AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX Diluente Látex com Ag adsorvido Soro com Acs POSITIVO soro + NEGATIVO soro -

ELISA INDIRETO (para anticorpos) Soro a ser testado para anticorpos Enzima => cor Anticorpo Detector Antígeno aderido à placa

ELISA de bloqueio (para anticorpos) Soro suspeito +? -? onde ligar?? Enzima Anticorpo Detector Substrato solúvel sem cor Microscópio Células infectadas com vírus

ELISA Indireto para anticorpos anti-hiv 1ª GERAÇÃO Lisado de Virus Ag celular Ac paciente Substrato Cor Ac anti IgG humana Marcado com Enzima E Reações Falso positivas Artrite reumatóide Anti- HLA Não detecta baixos títulos de anticorpos Somente detecta IgG Suporte sólido

ELISA 4ª GERAÇÃO Proteinas recombinantes HIV-2 env HIV-1 env HIV-1gag Peptidos sinteticos HIV-O HIV-2 Substrato Ac paciente Ag viral Ac conjugado Muito boa especificidade Detecta baixos títulos de anticorpos E HIV-2 E Boa sensibilidade para Ac. anti HIV-2 e Ac anti-grupo M e O de HIV-1 Detecta IgG e IgM Detecta antígenos virais também (HIV-1 y HIV-2) Suporte Solido

Western blot (para a detecção de anticorpos) Western Blot Critérios: WB Positivo: p24,gp41,gp120/160 (pelo menos 2 bandas) WB Negativo: Ausencia total de bandas

Testes imunocromatográficos ex.: teste oral HIV

Limitações da sorologia Detecta exposição (ou vacinação), mas não quando ela ocorreu!!! Para correlação com a doença: Soros pareados IgM Líquido céfalo raquidiano

Fim deste bloco Disponível em: labvir

Infecções Persistentes - após infecções in útero - vírus não é reconhecido como estranho - hospedeiro dissemina vírus - hospedeiro pode não desenvolver anticorpos

O QUE É INFECÇÃO LATENTE? - ocorre nas infecções por herpesvírus - vírus aloja-se no gânglio nervoso ou células do sistema imune - sem lesões aparentes - periodicamente reativado - periodicamente dissemina vírus ao meio ambiente