Genética IV: Genética Bioquímica 1. Genética da População Este campo alcançou seus avanços pelas leis propostas por duas pessoas, Hardy e Weinberg (1908). Vamos supor que em uma população haja dois alelos para um determinado gene, A e a. Alelos: A a Freqüência: p q há apenas dois alelos por gene, então p + q =1 Com que freqüência o alelo "A" estará no óvulo (em mulheres) = p Com que freqüência o alelo "a" estará no óvulo = q Óvulo Tabela de freqüência Esperma AA = p 2 Aa = 2pq AA : Aa : aa Aa = q 2 p 2 2pq q 2 Weinberg Essa é a distribuição do equilíbrio chamada de equilíbrio de Hardy- Se você souber as Freqüências do Alelo, é possível calcular as freqüências do genótipo: (p+q) 2 = 1 p 2 + 2pq + q 2 = 1 No Equilíbrio de Hardy-Weinberg: AA = p 2 Aa = 2pq Aa = q 2 Assumindo o equilíbrio, as freqüências dos alelos (e portanto as freqüências do genótipo) não são alteradas com o tempo. As freqüências do alelo tendem a "permanecer constantes" nas populações. Exemplo: fibrose cística (doença recessiva autossômica) A freqüência de indivíduos com fibrose cística em uma população é 1/2000 Deixe A = alelo normal ou selvagem e a = alelo da fibrose cística (doença) q 2 (indivíduos afetados) = 1/2000, portanto = 1/44, assim p = 43/44 Freqüência de Portadores: 2pq = 2(43/44)(1/44) ~ 0,044 = 1/22 Portanto, cerca de 5% da população é composto por portadores
Por que doenças como a fibrose cística (fc) ainda são prevalentes em certas populações? Os heterozigotos carregam o alelo mutante podem ter uma certa vantagem, digamos que uma resistência maior à infecção por cólera, portanto o alelo "a" ainda está na população. 2. Genética Bioquímica - Archibald Garrod uniu um defeito genético a um defeito enzimático. - A Genética Bioquímica usa a genética experimental para dissecar a bioquímica Sistema Experimental: Leveduras: leveduras unicelulares, eucariotes (possui um núcleo) Pegue uma suspensão de células de levedura e coloque em um meio sólido em uma placa de Petri, que contém nutrientes. Com o tempo, essas células únicas crescem no ágar até formarem grupos visíveis, chamados de colônias. Cada colônia representa uma pilha de células idênticas, cada descendente da célula única que foi colocada nessa posição. Ciclo de Vida da Levedura A levedura pode crescer como diplóide (2n) ou haplóide (n) na levedura célula haplóide n=16 cromossomos célula diplóide esporulação meiose acasalamento célula diplóide mitose mitose mitose Requerimentos de Crescimento - A levedura pode crescer em um meio mínimo: meio líquido ou sólido que contenha uma fonte de carbono (açúcar fermentável como glicose, frutose ou lactose), nitrogênio, fósforo, sais. - A levedura possui vias biossintéticas nas quais ela pode fazer todos os componentes biológicos requeridos a partir de nutrientes simples fornecidos em um meio mínimo - A levedura também pode crescer em um meio rico: meio líquido ou sólido contendo nutrientes complexos e macromoléculas. As células de levedura pegarão esses nutrientes do meio em vez de sintetizá-los. A levedura pode fechar suas vias sintéticas e usar o que está disponível no meio ao regular as enzimas envolvidas nas vias - a levedura pode sintetizar o que é necessário - a levedura também pode coletar nutrientes do meio Para compreender essas vias biossintéticas, precisamos caracterizar a levedura na qual estão ausentes certas enzimas e que, assim, não consegue crescer sob certas condições. Por exemplo
Como você isolaria os genes/proteínas que estão envolvidos na síntese de aminoácido (como a síntese da arginina)? Você pode encontrar levedura que não consegue sintetizar a arginina. Você entraria em uma busca mutante (procura por leveduras mutantes que não conseguem crescer sem arginina adicionadas ao meio de crescimento) Estratégia da Busca Mutante - comece com células de levedura do tipo selvagem - faça a mutação dessas células com substâncias químicas ou radiação para danificar o DNA - coloque as células com mutação em um meio rico - transfira (usando a técnica de replicação da placa) as colônias de levedura para um meio mínimo - procure por colônias que não conseguem crescer em meio mínimo este é um mutante que tem algum tipo de defeito na via sintética - o modo com que você projetar a busca mutante determinará quais mutantes você encontrará Assim que você obtiver uma coleção de mutantes que não conseguem crescer em meio mínimo sem suplemento, é necessário determinar quais componentes (suplemento nutricional) os mutantes requerem para crescimento em meio mínimo. Por exemplo, procure por uma cepa mutante que não consegue sintetizar a arginina: Placa em meio rico transfira para meio mínimo transfira para meio mínimo + arginina Todas as células crescem em meio rico. Todas as colônias, exceto aquelas deficientes na via biossintética, crescem no mínimo. As que forem deficientes na via sintética de arginina conseguem crescer no meio mínimo + arginina (você também pode fazer a seleção em meio rico arginina. As colônias que não crescerem nesse meio seriam mutantes da síntese de arginina). Se houvéssemos testado o crescimento de levedura em meio rico vs. meio mínimo, teríamos obtido vários mutantes chamados auxotróficas Definições: Prototróficas: cepa do tipo selvagem que consegue crescer em meio mínimo Auxotróficas: cepa mutante que perdeu a habilidade de crescer em meio mínimo As mutantes que foram isoladas acima e que não crescem em meio mínimo, mas crescem em meio mínimo + arginina, são chamadas de auxotróficas para arginina. Mas para analisar um grande número de células, precisamos de uma maneira melhor de testar o crescimento em conduções e de fazer a triagem de mutantes. Uma técnica chamada de replicação de placa foi desenvolvida por Esther Lederberg (ela usou um lenço de limpeza facial) A Replicação de Placa ocorre quando você transfere todas as colônias na mesma disposição entre duas placas ao pressionar as placas levemente em um pedaço de veludo. Você pode fazer esse tipo de triagem para isolar os mutantes de perda de função.
superfície coberta por veludo placa-mestre placa de replicação incubar armazenar Dois tipos de Ensaio para procurar por colônias que têm uma propriedade ou função desejada 1) Triagem Genética: Analise todas as colônias que crescem e, depois, procure por cones que não conseguem crescer em determinado meio. A triagem de mutantes que "perderam uma função" a habilidade de crescer sob certas condições. 2) Seleção Genética: Procure por colônias que conseguem crescer em determinado meio. Seleção de mutantes que "ganharam uma função" habilidade de crescer sob determinadas condições (condições que normalmente não permitiriam o crescimento, como a resistência a drogas). Para estudar mutantes que têm uma incapacidade de crescer em arginina, é necessário fazer uma coleta de auxotróficas para arginina mutantes que precisam apenas de arginina para crescer em meio mínimo. Para obter esses mutantes, é necessário usar as células de levedura haplóides (têm apenas uma cópia (n) de cada gene). Não é possível usar levedura diplóide (2n) porque uma mutação em um dos dois genes não é suficiente para a auxotrofia. Isso se deve ao fato de o nível de enzima produzido a partir de uma cópia do gene (metade dos níveis normais) ser suficiente para a função normal. Analise a levedura haplóide vs. diplóide: Haplóide: uma mutação no gene arg leve à auxotrofia para arginina Diplóide: uma mutação no gene arg não leva à auxotrofia porque outro gene é do tipo selvagem Para ser auxotrófica para arginina, as duas cópias do gene arg precisam ser mutadas. Não é comum encontrar leveduras diplóides que possuam duas mutações no mesmo gene 3. Caracterização de Mutantes Colete várias cepas de leveduras mutantes auxotróficas para arginina chame-as de Arg1, Arg2, Arg3, etc. Em seguida, pergunte: esses mutantes estão no mesmo gene ou em genes diferentes? Para fazer isso, primeiro teste se as mutações estão causando um fenótipo recessivo. 1) Teste de Recessividade:
- a perda da função da enzima normalmente é recessiva para o fenótipo do tipo selvagem - normalmente 50% de um produto do gene é suficiente para mostrar um fenótipo do tipo selvagem para um defeito enzimático normalmente apenas 1 cópia do tipo selvagem do gene é suficiente para mostrar o fenótipo do tipo selvagem. Junte duas cepas haplóides: Arg1 com tipo selvagem para gerar uma célula diplóide. Se o fenótipo da célula diplóide resultante for do tipo selvagem, então o fenótipo associado com o mutante Arg1 é recessivo para o tipo selvagem. 2) Teste de Complementação Faça um teste de complementação para determinar se as duas mutações diferentes estão no mesmo gene ou em genes diferentes. Combine dois mutantes haplóides para gerar uma célula diplóide e analise o fenótipo diplóide. a) Se as mutações estiverem no mesmo gene (ou seja, se o gene defectivo no mutante Arg1 for o mesmo gente que estiver defectivo no mutante Arg2), o diplóide resultante será incapaz de crescer em um meio mínimo. Como os dois mutantes carregam mutações no mesmo gene, no diplóide há a ausência de uma enzima funcional o diplóide não consegue crescer se que arginina seja adicionada ao meio. **Quando Arg1 e Arg2 carregam mutações no mesmo gene e o diplóide resultante mostra um fenótipo mutante, os mutantes Arg1 e Arg2 não conseguem complementar um ao outro. Diz-se que eles estão no mesmo grupo de complementação. b) Se as mutações estiverem em genes diferentes (ou seja, o gene defectivo no mutante Arg1 é um gene diferente daquele que está defectivo no mutante Arg2), então o diplóide resultante crescerá em meio mínimo. Cada mutante possui uma mutação em um gene diferente, portanto o diplóide possui todas as enzimas funcionais e consegue crescer em meio mínimo. **Quando Arg1 e Arg2 carregarem mutações em genes diferentes e o diplóide resultante mostrar um fenótipo do tipo selvagem, os mutantes Arg1 e Arg2 complementam um ao outro. Diz-se que eles estão em grupos de complementação diferentes. Em geral, as mutações em genes diferentes complementam uma à outra e restauram a protrofia no diplóide (cada mutante resgata os outros defectivos). É possível fazer um teste de complementação entre haplóides diferentes e fazer uma tabela: Tipo Selvagem Tipo Selvagem Arg1 Arg2 Arg3 Arg4 + + + + + Arg1 + - - + + Arg2 + - - + +
Arg3 + + + - - Arg4 + + + - - + significa complementação, o diplóide possui um fenótipo do tipo selvagem - significa que não há complementação, o diplóide possui um fenótipo mutante *Observe que todos os mutantes são recessivos para i tipo selvagem Os mutantes 1 e 2 não conseguem complementar: portanto, eles estão no mesmo grupo de complementação e assume-se que eles estão no mesmo gene Os mutantes 3 e 4 não conseguem complementar: portanto, eles estão em grupos de complementação diferentes e assume-se que eles estão no mesmo gene Os mutantes 1 e 4 complementam: portanto, assume-se que estão em genes diferentes. A tabela acima sugere que há dois grupos de complementação ou é provável que haja dois genes envolvidos na síntese de arginina.