Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos Profa. Dra. Irene Soares (isoares@usp.br) FCF/USP - 2010
Isolamento de DNA Clonagem de DNA Transformação pelo DNA Seleção e análise de recombinantes Expressão de proteínas recombinantes Purificação de proteínas recombinantes Aplicações da tecnologia do DNA recombinante
Ferramentas básicas Gene de interesse Célula hospedeira (bactérias) Vetores de clonagem e expressão DNA ligases Enzimas de restrição Aparato de eletroforese de DNA Sondas de DNA, Primers
Isolamento de DNA DNA genômico cdna Produto de PCR Gene sintético Podem ser utilizados para construção de Bibliotecas de DNA
Vetores de clonagem Plasmídios: fragmentos de até 10 Kb Fago lambda: fragmentos de 5-20 Kb Cosmídios: fragmentos de 20-50 Kb BAC (Bacterial Artificial Chromosomes): 100-500 Kb YAC (Yeast Artificial Chromosomes): 100 Kb 1Mb
Componentes de um plasmídio Região promotora DNA exógeno DNA genômico, cdna, Produto de PCR, Gene sintético Plasmídios comerciais puc pgem pmos Sítio de Clonagem De 1.000 até 20.000 pares de bases Origem de replicação Gene que codifica resistência a antibiótico
Plasmídio para clonagem de produtos de PCR Sítio de Clonagem (polilinker)
Ligação Plasmídio linearizado Gene a se clonado DNA ligase Transferência do plasmídio para uma linhagem de bactéria DNA cromossômico Plasmídios recombinantes
Métodos de Transformação pelo DNA Tratamento com Cloreto ou Fosfato de Cálcio Bactérias (Escherichia coli) E. coli competente + DNA plasmidial Incubação no gelo Choque térmico (42ºC) Transformação direta por eletroporação
Métodos de seleção de recombinantes (bactérias transformadas) Bactérias: Baseado na resistência a antibiótico Bactéria SEM DNA plasmidial Bactéria COM DNA plasmidial Plasmídio religado (sem inserto) Plasmídio com inserto
Seleção azul e branca Gene lacz Gene lacz Inserto IPTG + X-gal Expressão da -galactosidase Não há expressão da -galactosidase Colônias azuis Colônias brancas
Seleção com sondas de DNA
Obtenção de DNA plasmidial Cultura bacteriana: E. coli contendo o plasmídio Lise alcalina: Fase estacionária (overnight)
Análise de restrição Enzima Sítio de restrição Fonte EcoRI G AATT C Escherichia coli RY13 C TTAA G NcoI C CATG G Nocardia corallina G GTAC C XbaI T CTAG A Xantomonas badrii AGATC T SmaI CCC GGG Serratia marcescens GGG CCC
5 - fosfato 3 - OH 5 - fosfato 3 - OH
Gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo (exposto a luz UV)
Eletroforese em gel de agarose HindIII (-) Plasmídio Inserto Plasmídio não digerido
Mapeamento de restrição BstF5I SfaNI BbvI HpyCH4III TseI Fnu4HI BseMII MnlI AvaII EcoO109I BstYI PpuMI Sau3AI Sau96I DpnI NlaIV BsmFI Bsu36I Hpy188I DdeI AlwI ATGAGGGCATCCATCTTTCTCGCTCTTGCCATTCTCGTTATTACCGTTGTCGCTGCCCCTACCGATGATAAGGGACCTGAGGATCTGAAG 90 TACTCCCGTAGGTAGAAAGAGCGAGAACGGTAAGAGCAATAATGGCAACAGCGACGGGGATGGCTACTATTCCCTGGACTCCTAGACTTC È Ò Å Î É Â Å Â Å Â Ê È Ñ Ê Ê Å Å Ì Ñ Í Í Ò Ö Ì Í Í Â Ï Ó Ö Ç Ì Î É Í É Ì ˆ ˆ ˆ Ì ˆ Î Í Ì Â Ì È È Ò Í Â Ò È Œ Ò Í Ö Â Â Œ   Œ  Œ Ì Â Ó Á Ö Ñ Œ Ö Î Í Í
Sequenciamento do DNA T G G G G G T A C A T G 40 50 C T C T C A C G T G 60 T T G CT GCA G T C A T G G C A T C C C G C A A A C A C A 70 80 90
Expressão de proteínas recombinantes Transformação Produção do antígeno in vitro Bactérias, leveduras ou baculovirus Purificação
Sistemas heterólogos de expressão Bactérias: Escherichia coli Leveduras: Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Células de inseto (infectadas com baculovirus) Células de mamíferos Plantas Animais
Elementos genéticos essenciais em um vetor de expressão
Vetores indutíveis por IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside) Operon Lac Na ausência de IPTG Na presença de IPTG
Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com GST Promotor Lac: Expressão em bactéria na presença de IPTG
Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com His-tag
Expressão de proteínas recombinantes em bactérias Considerações gerais: Bactéria: Escherichia coli (diversas linhagens) Vantagens: fácil manipulação, rápido crescimento, alto rendimento de proteínas e baixo custo Otimização da expressão: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de indução - Utilização de cepas de bactérias códon plus
Expressão de proteínas recombinantes em bactérias Considerações gerais: Desvantagens: Formação de corpos de inclusão proteínas insolúveis e não funcionais - Solubilização Proteínas solúveis - Refolding de proteínas Proteínas de fusão - Melhoram a solubilidade - Facilitam a purificação Corpos de inclusão
Cultura de bactérias (E. coli) Indução com IPTG Fase log: DO=0,4-0,6nm Expressão da Proteína recombinante Padronizar: Tempo, temperatura, curva-dose resposta de IPTG Lise (cong./descong., sonicação, French press) Avaliar em SDS-PAGE: extrato total, precipitado e sobrenadante Purificação
Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida
Análise da expressão da proteína recombinante em SDS-PAGE PM 1 2 3 116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 1. Extrato total (lisado bacteriano) 2. Sobrenadante 3. Precipitado (corpos de inclusão)
Métodos de detecção de clones recombinantes Reconhecimento por anticorpos específicos (ou anti-gst, anti-his) Função da proteína (ensaio enzimático) Seleção por PCR
Métodos de purificação de proteínas recombinantes Afinidade Troca iônica Fase reversa Gel filtração
Etapas de purificação de proteínas recombinantes Extrato bacteriano Etapa final de purificação 1ª. Etapa de purificação
Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em leveduras (Pichia pastoris)
Expressão de proteínas recombinantes em leveduras Considerações gerais: Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Otimização da expressão: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de indução - Otimização do códon: mutagênese Vantagens (Pichia pastoris): altos níveis de expressão, modificações pós-traducionais (glicosilação, pontes dissulfeto), secreção da proteína
Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: terapêutica - Hormônio de crescimento humano e bovino (somatotrofina); - Insulina humana; - Calcitonina; - LH-RH - Somatostatina; - Gonadotrofina coriônica (HCG) e sérica (PMSG); - LH - Hormônio luteinizante bovino e suíno; - FSH Hormônio folículo estimulante humano e bovino; - IGF-I (Fator de crescimento insulina dependente); - Interferon alfa, Interferon beta e Interferon gama -Toxina Botulinica; - Eritropoietina; - Glucagon - Fatores de coagulação: VIII e IX
Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: diagnóstico laboratorial - HIV, HCV, HBV, HEV, HTLV, EBV, CMV, Rubéola - H. pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, Chlamydia - Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi
Hepatite B Gene Ag S Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas Purificação Vetor Vacina Proteína Levedura Antígeno S Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha
Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas Engerix-B Recombivax HB GenHevac B SmithKline Beecham/US Merck/USA Pasteur/France Instituto Butantan
Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas HPV HPV Os subtipos 16 e 18 estão implicados como causa de 70% dos cânceres de colo de útero
Dept. of Immunology Walter Reed Army Institute of Research Washington, DC