VARIABILIDADE GENÉTICA DE ACESSOS E CULTIVARES DE MELANCIA BASEADA EM MARCADORES RAPD Ricarte, A. O (1) ; Albuquerque, L. B. (1) ; Antonio, R. P. (2) ; Silveira, L. M. (3) ; Carvalho, K. K. A. (1) ; Silva, M. F. N (1) ; Filho, A. J. R. S (1). anankia-ricarte@hotmail.com (1) Laboratório de Biotecnologia Molecular Vegetal. Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA, Mossoró RN; (2) Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Semi-Árido Mossoró RN; (3) Laboratório de Recursos Genéticos Vegetal. Universidade Federal Rural do Semi- Árido - UFERSA, Mossoró RN. RESUMO Parte da produção de melancia realizada no Nordeste brasileiro é feita principalmente por pequenos produtores, os quais cultivam diversos tipos de frutos. Desta forma, conduziu-se este trabalho com o objetivo de caracterizar a variabilidade genética entre 24 acessos pertencentes à coleção de germoplasma de melancia da UFERSA e duas cultivares comerciais, por meio de marcadores RAPD. As reações foram feitas com base em 26 amostras de DNA, utilizando-se 10 primers RAPD. Foi amplificado um total de 1679 bandas, sendo 706 polimórficas. Com a obtenção do dendrograma, a um corte de 60%, houve a formação de 10 grupos distintos. Dois acessos (M22 e M24) e as duas cultivares utilizadas nas análises ficaram englobados em um mesmo grupo. Os acessos de melancia da coleção pertencente à UFERSA possuem alta diversidade para ser explorada em programas de melhoramento genético para esta espécie. Palavras-chave: Diversidade Genética, Marcadores Moleculares, Germoplasma.
INTRODUÇÃO Parte da produção de melancia cultivada no Nordeste brasileiro é feita basicamente por pequenos produtores que utilizam suas próprias sementes e fazem a própria seleção de frutos, utilizando as sementes para o cultivo no ano seguinte. Desta forma, ano após ano uma seleção continuada destes genótipos é realizada, sendo cultivados diversos tipos de frutos (Ramos; Queiroz, 2005). Para impedir que ocorra a erosão genética destes materiais, torna-se necessário a realização de coletas e a caracterização dos mesmos a fim de se conhecer o grau de variabilidade genética que estes genótipos possuem. Isto deve ser realizado com o intuito de se indicar genótipos mais promissores para os trabalhos de melhoramento e também para melhorar as condições de cultivo e produção dos agricultores, permitindo o uso racional destes genótipos na agricultura familiar. Uma das formas mais eficientes de se caracterizar a diversidade genética entre diferentes genótipos consiste no uso de marcadores moleculares, os quais se baseiam no DNA das plantas (Vidal et al., 2005). Para caracterização da diversidade, há atualmente vários marcadores moleculares disponíveis, sendo os que usam a técnica de PCR 2
(Polymerase Chain Reaction), como os RAPD (Random Amplification of Polymorphic), um dos mais utilizados por ser uma técnica simples, rápida, de baixo custo e aplicável a qualquer tipo de organismo, que se caracteriza (Grattapaglia, 2007). Além disso, não é necessário conhecimento prévio sobre o genoma da espécie avaliada e os primers utilizados são aleatórios com 10 pares de bases de extensão (Vidal et al., 2005). Marcadores RAPD têm sido aplicados com sucesso na caracterização da diversidade genética de acessos de melancia (Silva et al., 2006). No Brasil, têm sido aplicados na diversidade genética de algumas coleções de germoplasma (Faleiro et al., 2001; Conte et al., 2006). No presente trabalho, objetivou-se, caracterizar a variabilidade genética entre vinte e quatro acessos e duas cultivares de melancia da coleção de germoplasma da UFERSA, por meio de marcadores RAPD. MATERIAL E MÉTODOS Sementes de 26 genótipos de melancia, sendo duas cultivares e 24 acessos oriundos da coleção de germoplasma de melancia da UFERSA,oriundos de diferentes cidades do estado do Rio Grande do Norte, foram plantados em casa de vegetação e 15 dias após a 3
germinação suas folhas foram coletadas para a extração de DNA, conforme o protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990). A quantificação foi feita em gel de agarose a 0,8% (p/v) comparando-se visualmente a intensidade das bandas do DNA dos genótipos extraídos, com bandas de peso molecular conhecido de 1 kb. Cada um dos genótipos teve o seu material genético diluído à uma concentração de 10 ηg.µl -1. Para a realização de reações de amplificação com os primers RAPD foi usado um coquetel preparado para um volume final de 13 µl, contendo 4,2 µl de água ultrapura, 1,3 µl de Buffer (10x), 2,0 µl de MgCl 2 (25mM), 1,3 µl de dntp (2,5mM), 0,2 µl de Taq DNA Polimerase (5U.µL -1 ) (Kit da Fermentas Life Sciences/USA), 1,0 µl de primer (5 µm), e 3,0 µl de DNA (10ηg). As reações foram conduzidas em termociclador Axygen Axygene, cujo programa de ciclagem foi padronizado para todos os primers RAPD e apresentou a seguinte programação: pré-desnaturação à 96 C por 1 minuto, seguido de 40 ciclos à 92 C por 1 minuto, 40 ºC por 1 minuto e 72 C por 2 minutos, com extensão final de 5 minutos à 72 C com base em (SILVA et al., 2006), com posterior manutenção da temperatura à 4 C, até que fossem submetidas a eletroforese horizontal. 4
Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% (p/v), usando tampão TBE (Tris - Ácido Bórico - EDTA) ph 8,0 1X. Os géis foram corados com quatro µl de brometo de etídeo (10 mg ml -1 ) e fotodocumentados em transluminador, através de luz ultravioleta. O padrão de peso molecular de 1 kb (New England Biolabs/USA) foi utilizado visando comparação com os fragmentos amplificados. Uma matriz binária baseada na presença (1) ou ausência (0) de bandas RAPD, foi gerada e utilizada para estimar a similaridade genética entre os genótipos. A estimativa de similaridade genética entre cada par de genótipos foi calculada pelo coeficiente de Sorence-Dice. Os genótipos foram agrupados pelo método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method), obtendo-se dessa forma, um dendrograma. Todas as análises foram realizadas com o auxílio do programa Genes versão 2013.5.1 (Cruz, 2006) RESULTADOS E DISCUSSÃO Foi realizada uma triagem entre 12 primers RAPD testados inicialmente, dos quais 10 apresentaram bom perfil de amplificação e destes, nove detectaram e revelaram polimorfismo entre os 26 genótipos de melancia. 5
De acordo com os dados obtidos pela amplificação, o maior número de bandas foi gerado pelos primeres OPAA 04 e OPO-10, com 11 bandas cada e o menor número foi gerado pelo primer OPAA 07 com 6 bandas. A avaliação realizada utilizando o marcador RAPD mostrou que esta é uma importante ferramenta para estudos de polimorfismo em acessos e cultivares de melancia. Do total de 1679 bandas amplificadas com os 10 primers, 973 bandas apresentaram-se monomórficas e 706 apresentaram polimorfismo. Elevados níveis de polimorfismo também foram encontrados por (Silva et al., 2006) ao utilizarem seis primers RAPD em genótipos de melancia, sendo 42 acessos e uma cultivar. Todos os 10 primers selecionados pela triagem apresentaram bom perfil de amplificação permitindo a identificação de bandas consistentemente polimórficas. Devido ao excelente padrão apresentado, apenas as bandas mais intensas foram analisadas (Figura 1). 6
Figura 1. Gel de agarose a 1%, contendo fragmentos de DNA amplificados com o marcador RAPD OPAA 03, a partir do DNA de 24 acessos e 2 cultivares de melancia. Mossoró RN, UFERSA, 2013. Os resultados de diferenciação das amostras avaliadas dos 26 genótipos de melancia foram analisados, a partir de distâncias genéticas derivadas dos perfis de amplificação gerados pelos primers RAPD. A análise de agrupamento pelo método UPGMA com base nesses marcadores, distribuiu os acessos e as duas cultivares em 10 grupos a um corte de 60% (Figura 2). 7
Figura 2. Análise de agrupamento dos 26 genótipos de melancia por meio do marcador RAPD, obtida pelo método de agrupamento UPGMA, utilizando o índice de Dice. Mossoró-RN, UFERSA, 2013. O grupo I foi constituído pelos acessos M1 e M7. O grupo II foi formado pelos acessos M6, M17, M3 e M16. Já os grupos III e IV englobaram apenas um único acesso cada, os quais foram M9 e M11 respectivamente, este resultado demonstra que estes genótipos são 8
geneticamente diferentes de todos os demais. O grupo V foi formado pelos acessos M18, M23, M12 e M20, enquanto que o grupo VI foi constituído pelos acessos M2 e M15. Já os grupos MVII e MVIII foram formados pelos acessos M3, M13 e M5; M10, M19 E M8 respectivamente, enquanto que o grupo IX englobou os acessos M14 e M21. O último grupo formado, ou seja, o grupo X englobou as duas cultivares (Crimson Sweet e Olímpia), bem como os acesso M22 e M24, vale salientar que de acordo com o dendrograma o acesso M22 e a cultivar Olímpia partilham muitos genes idênticos assim como, o acesso M24 e a cultivar Crimson, sendo provavelmente materiais geneticamente iguais. CONCLUSÃO Os marcadores RAPD foram satisfatórios em permitir a detecção de polimorfismo entre acessos e cultivares de melancia. Existe variabilidade genética entre os genótipos pertencentes a coleção de acessos de melancia da UFERSA. Os acessos da coleção de germoplasma de melancia da UFERSA possuem alta diversidade para ser explorada em programas de melhoramento. 9
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