TESTES PARA A IDENTIFICAÇÃO DE GLÍCIDOS INTRODUÇÃO Os glícidos constituem uma classe de compostos biológicos que engloba os monossacáridos e moléculas mais complexas obtidas por reacções de condensação de monossacáridos, algumas delas conduzindo a substâncias poliméricas. Do ponto de vista estrutural os monossacáridos ou oses são poli-hidroxialdeídos ou polihidroxicetonas, apresentando-se geralmente sob a forma de hemiacetais ou hemicetais. Estes compostos diferem no número de átomos de carbono existentes nas suas moléculas (trioses, tetroses, pentoses, hexoses) e na natureza do grupo funcional principal (aldeído ou cetona, hemiacetal ou hemicetal). Os restantes grupos funcionais são grupos álcool (grupos hidroxilo ligados a todos os átomos de carbono que não fazem parte do grupo funcional aldeído ou cetona) e as diferenças existentes entre as várias oses com o mesmo número de átomos de carbono e o mesmo grupo funcional principal dizam apenas respeito à configuração (ordem pela qual se dispõem os grupos hidroxilo, átomos de hidrogénio e outros grupos em torno de cada átomo de carbono que seja um centro quiral na molécula). É possivel distinguir glícidos de outros tipos de compostos explorando a sua reactividade química. Os ácidos fortes (4 a 6 N a 100 ºC ou mais concentrados a temperaturas mais baixas) causam a desidratação dos monossacáridos e também de oligossacáridos ou polissacáridos devido à hidrólise ácida das ligações glicosídicas. As pentoses são convertidas em furfural por acção do ácido sulfúrico concentrado e as hexoses, em hidroximetilfurfural. Estes aldeídos cíclicos podem sofrer reacções de condensação com um elevado número de fenóis e aminas aromáticas originando produtos corados. A velocidade de desidratação e a cor do produto formado depende da natureza do açúcar, pelo que é possível usar este tipo de reacções para efectuar testes qualitativos para a caracterização de glícidos (testes de Molisch, do fenol-ácido sulfúrico, de Seliwanoff, de Bial). Outro tipo de reacção química útil para a caracterização de glícidos é a sua oxidação por certos reagentes, o que permite classificá-los em redutores ou não redutores (testes de Fehling, de Benedict, do espelho de prata) e, tendo em conta a velocidade da reacção, em monossacáridos ou dissacáridos redutores (teste de Barfoed). Nestas reacções o grupo aldeído das aldoses, ou o grupo carbonilo das cetoses actuam como redutores. As aldoses são assim convertidas em ácidos aldónicos e as cetoses em α-dicarbonilos. É ainda possível a identificação de certos monossacáridos recorrendo a testes enzimáticos que utilizem enzimas de elevada especificidade para esses monossacáridos. Um exemplo é a glucose oxidase [E.C. 1.1.3.4], enzima que catalisa a oxidação da β-d-glucose. O peróxido de hidrogénio produzido como consequência desta reacção pode ser detectado, por exemplo, pela sua capacidade de oxidar o ião iodeto a iodo. (Obs.: Ver o trabalho intitulado Cinética reaccional da glucose oxidase e Separação de duas enzimas por cromatografia de permuta iónica). OBJECTIVO DO TRABALHO O objectivo do trabalho consiste na realização de um conjunto de testes qualitativos para a caracterização de alguns glícidos.
Para concretizar o trabalho será feita a identificação de um conjunto de soluções aquosas a 1 % (p/v) rotulados com as letras A, B, C, D, E, F, G, H e I e que correspondem aos seguintes compostos biológicos, não necessariamente pela ordem indicada: glicina, D-xilose, D-galactose, D-glucose, metil-α-d-glucósido, D-frutose, lactose, sacarose e amido (suspensão com uma concentração de 0,2 % p/v). REAGENTES Reagente de Molisch (dissolução de 5 g de α-naftol em 100 ml de etanol) Ácido sulfúrico concentrado Solução aquosa de fenol a 5% (p/v) Reagente de Seliwanoff (dissolução de 0,5 g de resorcinol em 330 ml de ácido clorídrico concentrado e diluição a 1 L com água) Reagente de Bial (dissolução de 3 g de orcinol em 1 l de ácido clorídrico concentrado e adição de 3mL de uma solução de FeCl 3 a 1 % p/v) Solução de Fehling A (dissolução de 34,65 g de CuSO 4.5H 2 O em água e diluição a 500 ml) Solução de Fehling B (dissolução de 125 g de KOH e 173 g de NaKC 4 H 4 O 6.4H 2 O tartarato duplo de sódio e potássio, sal de Rochelle em água e diluição a 500 ml) Reagente de Benedict (dissolução de 173 g de Na 3 C 6 H 5 O 7.2H 2 O citrato de sódio e 100 g de carbonato de sódio anidro em água e diluição a cerca de 850 ml, adição a esta solução de uma outra solução preparada por dissolução de 17,4 g de CuSO 4.5H 2 O em 100 ml de água e diluição a 1 L) Solução aquosa de nitrato de prata a 5% (p/v) Amónia diluída (1:2) Reagente de Barfoed (dissolução de 66 g de CuC 4 H 6 O 4 acetato de cobre (II) em 10 ml de ácido acético glacial e em água e diluição a 1 L) Solução 0,01 M em iodo e a 3 % (p/v) em iodeto de potássio Solução aquosa de glucose oxidase (~0.5 mg/ml) Solução aquosa concentrada de iodeto de potássio (IK) contendo uma pequena quantidade de molibdato de sódio. MATERIAL tubos de ensaio Diversas pipetas banho de água a 100 ºC banho de água a 70 ºC cronómetro TÉCNICA 1) Escrever as fórmulas químicas estruturais (de Fischer e de Haworth para monossacáridos e de Haworth para dissacáridos e derivados de monossacáridos) para os glícidos D-xilose, D- galactose, D-glucose, metil-α-d-glucósido, D-frutose, lactose e sacarose.
2) Classificar os glícidos indicados em 1) em: aldose ou cetose ou derivado de aldose ou de cetose; pentose ou hexose ou derivado de pentose ou de hexose; monossacárido ou dissacárido ou derivado de monossacárido ou de dissacárido; redutor ou não redutor. Para os dissacáridos indicar apenas se são redutores ou não redutores. 3) Elaborar um diagrama do tipo indicado, onde seja apresentada uma ordem de realização dos ensaios descritos a seguir, a indicação das amostras a ensaiar em cada caso e as conclusões que seja possível obter (pela observação dos resultados para cada ensaio) para a identificação das amostras. Ensaio: + Ensaio: Ensaio: + 4) Realizar os ensaios descritos a seguir para as amostras A, B,, I. Logo que identificar inequivocamente uma amostra, não realizar mais ensaios para essa amostra. 5) Preencher uma tabela com os resultados dos ensaios. 6) Concluir sobre a identidade de cada uma das amostras A, B,,I. I TESTE DE MOLISCH ENSAIOS O teste de Molisch permite fazer a distinção entre um glícido e um outro tipo de composto. O H 2 SO 4 concentrado, por uma acção de desidratação sobre os hidratos de carbono, produz compostos que condensam com o α-naftol para formar produtos corados. Um teste negativo é uma muito boa indicação da ausência de um hidrato de carbono. Um teste positivo apenas indica a presença provável de um hidrato de carbono. α-naftol 1) Colocar 1 ml da solução amostra num tubo de ensaio. 2) Adicionar 1 ml de água e agitar.
3) Adicionar 2 gotas do reagente de Molisch e misturar bem. 4) Adicionar lenta e cuidadosamente cerca de 1 ml de ácido sulfúrico concentrado (com pipeta de Pasteur ou outra do mesmo tipo), deixando-o escorrer pela parede interna do tubo (que deverá estar inclinado a 45º), de modo a que este forme uma camada por baixo da solução aquosa. 5) Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor na zona de junção dos dois líquidos. POSITIVO: Cor roxa-vermelha. II TESTE DO FENOL ÁCIDO SULFÚRICO O teste do fenol - ácido sulfúrico permite fazer a distinção entre um glícido ou um composto que contenha uma parte glicídica e um outro tipo de composto. 1) Colocar 10 µl da solução amostra num tubo de ensaio. 2) Adicionar 1 ml de água e agitar. 3) Adicionar 1 ml da solução de fenol e agitar bem. 4) Adicionar cerca de 5 ml de ácido sulfúrico concentrado e misturar bem. TOMAR CUIDADO COM O AUMENTO DA TEMPERATURA PARA EVITAR PROJECÇÕES! 6) Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor alaranjada. III TESTE DE SELIWANOFF O teste de Seliwanoff é um teste para cetoses. A sacarose, que contém uma cetose na sua estrutura, dá um teste positivo. 1) Colocar 2 ml do reagente de Seliwanoff num tubo de ensaio. 2) Adicionar 0,3 ml da solução amostra e agitar. 3) Aquecer à fervura num banho de água durante 1 minuto. 4) Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor laranja ou vermelha (ou intermédia). A sacarose pode dar um teste positivo se sofrer hidrólise parcial (em glucose e frutose). Para outro tipo de açúcares, um aquecimento prolongado pode dar uma cor vermelha. IV TESTE DE BIAL É um teste para pentoses. 1) Colocar 3 ml do reagente de Bial num tubo de ensaio. Cuidado que este reagente tem HCl bastante concentrado. 2) Adicionar 0,15 ml da solução amostra e agitar. 3) Aquecer à fervura num banho de água durante 30 segundos. 4) Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor.
POSITIVO: Cor verde ou azul (ou intermédia) para pentoses ou nucleótidos contendo pentoses. Hexoses ou dissacáridos dão uma cor amarela esverdeada. V TESTE DE FEHLING É um teste para acúcares redutores. O grupo carbonilo é oxidado a carboxilo. O ião metálico é reduzido. Os glícidos que contenham um grupo aldeído ou cetona potencialmente livre existem em solução aquosa em equilíbrio com uma forma enodiol, que é um agente redutor activo. Em meio ligeiramente alcalino esta forma é favorecida e a sua presença assegura a redução de iões cobre (II) a cobre (I) com a formação de hidróxido cuproso que, por aquecimento, se converte em óxido cuproso, um composto insolúvel de cor vermelha que precipita. Para manter os iões cobre (II) em solução em meio alcalino o reagente de Fehling contém um agente complexante, o ião tartarato. 1) Misturar 1 ml da solução de Fehling A com 1 ml da solução de Fehling B num tubo de ensaio. 2) Adicionar 0,5 ml da solução amostra e agitar. 3) Aquecer à fervura num banho de água durante 5 minutos. 4) Tomar nota do eventual aparecimento de um precipitado avermelhado. POSITIVO: Formação de um precipitado avermelhado. VI TESTE DE BENEDICT É um teste semelhante ao teste de Fehling. Para manter os iões cobre (II) em solução em meio alcalino o reagente de Benedict contém um agente complexante, o ião citrato. É uma solução que não se deteriora com tanta facilidadse como as de Fehling. 1) Colocar 3 ml do reagente de Benedict num tubo de ensaio. 2) Adicionar 0,5 ml da solução amostra e agitar. 3) Aquecer à fervura num banho de água durante 5 minutos. 5) Tomar nota do eventual aparecimento de um precipitado avermelhado. POSITIVO: Formação de um precipitado avermelhado. VII TESTE DO ESPELHO DE PRATA É um teste para açúcares redutores, tal como os testes de Fehling e de Benedict. Neste teste são os iões prata (I) que sofrem redução a prata metálica. Os iões prata são mantidos em solução em meio alcalino (amoniacal) sob a forma do complexo diaminoprata (I). 1) Colocar 1 ml da solução de nitrato de prata num tubo de ensaio bem lavado. 2) Adicionar amónia diluída gota a gota com agitação até se dissolver o precipitado formado após a adição das primeiras gotas. 3) Adicionar 0,5 ml da solução amostra e agitar. 4) Aquecer num banho de água à temperatura de 70 ºC durante 5 minutos.
5) Retirar o tubo de ensaio do banho após os 5 minutos e tomar nota do eventual aparecimento de um espelho de prata na parede interna. LAVAR IMEDIATAMENTE O TUBO DE ENSAIO APÓS A REALIZAÇÃO DESTE TESTE! POSITIVO: Formação de um espelho de prata. Nota: este método era (é) usado para fazer espelhos. VIII TESTE DE BARFOED Este teste permite distinguir entre monossacáridos redutores e dissacáridos redutores. Os dissacáridos são redutores mais fracos e reagem mais lentamente. No reagente de Barfoed os iões cobre (II) que vão sofrer a redução a cobre (I) encontram-se em meio ligeiramente ácido. 1) Colocar 2 ml do reagente de Barfoed num tubo de ensaio. 2) Adicionar 0,5 ml da solução amostra e agitar. 3) Aquecer à fervura num banho de água durante 1 minuto. 4) Tomar nota do eventual aparecimento de uma turvação ou precipitado avermelhados. POSITIVO: Turvação ou precipitado avermelhados para monossacáridos redutores. A hidrólise de dissacáridos pode originar algum precipitado. IX TESTE DO IODO É um teste para alguns polissacáridos baseado na formação de um complexo fortemente corado resultante da interacção entre o iodo e o polissacárido. 1) Colocar 0,5 ml da solução amostra num tubo de ensaio. 2) Adicionar 1,5 ml de água e agitar. 3) Adicionar 2 gotas da solução de iodo. 4) Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor azul para amido ou cor vermelha muito escura para glicogénio. X TESTE ENZIMÁTICO COM GLUCOSE OXIDASE É um teste específico para a β-d-glucose. 1) Colocar 2 ml da solução amostra num tubo de ensaio. 2) Adicionar uma gota da solução de glucose oxidase e agitar suavemente. 3) Adicionar 3 gotas da solução de iodeto de potássio. 4) Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor amarela.
TESTES PARA A IDENTIFICAÇÃO DE GLÍCIDOS FOLHA DE RESULTADOS GRUPO: DATA:... TURMA:... Nome... Nº... Nome... Nº... Nome... Nº... 1) Escrever as fórmulas químicas estruturais (de Fischer e de Haworth para monossacáridos e de Haworth para dissacáridos e derivados de monossacáridos) para os glícidos D-xilose, D- galactose, D-glucose, metil-α-d-glucósido, D-frutose, lactose e sacarose. 2) Classificar os glícidos indicados em 1) em: monossacárido ou dissacárido ou derivado de monossacárido ou de dissacárido; aldose ou cetose ou derivado de aldose ou de cetose; pentose ou hexose ou derivado de pentose ou de hexose; redutor ou não redutor. Para os dissacáridos indicar apenas se são redutores ou não redutores. D-xilose D-galactose D-glucose Metil-α-D-glucósido D-frutose lactose Sacarose
RESULTADOS DOS ENSAIOS A B C D E F G H I I II III IV V VI VII VIII IX X Observações:
CONCLUSÕES Amostra Identificação A B C D E F G H I