Revista Eletrônica de Biologia

. REB Volume 3 (3): 1-13, 2010 ISSN 1983-7682 Revista Eletrônica de Biologia Determinação da Ocorrência de Shigella/Salmonella Através do Exame de Coprocultura em Pombal Situado no Interior da Escola Estadual Joaquim Izidoro Marins, Sorocaba/SP Incidence of Shigella / Salmonella through examination of stool culture in loftlocated within the state school Joaquim Izidoro Marins, Sorocaba-SP Valcilei Corrêa e Marcela Pelegrine Peçanha Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde. Pontifícia Universidade Católica de São Paulo. Campus Sorocaba E-mail: valcilei@bol.com.br Resumo Dentre as mais diversas enfermidades contagiosas ao ser humano e a outros animais, estão as enterobactérias, como a Salmonella spp e a Shigella spp que possuem afinidade pelo sistema digestório e causam problemas intestinais. Sabe-se que aves ( Columba livia) podem transmitir doenças através de suas fezes, sendo assim, coletou-se 30 amostras em diferentes pontos da respectiva escola e submeteu-se à análise de Coprocultura, onde o procedimento bacteriológico consistiu das etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento em caldo seletivo, plaqueamento, teste bioquímico e confirmação sorológica.o enriquecimento seletivo foi feito com caldo Tetrationato e iodo e os meios de cultura para plaqueamento foram o Agar SS, Agar MC e Agar VB. Através do método empregado, não foi detectada a presença de Salmonella spp e sim de Shigella dysenteriae e Shigella Flexneri nas amostradas analisadas. Palavras chave: Salmonela, Shigela, Escola, Pombos. 1

Abstract Among the many contagious diseases affecting humans and other animals we find enterobacteria, such as the Salmonella spp. and Shigella spp., which present affinity with the digestive system and cause intestinal problems. It is known that pigeons (Columba livia) can carry diseases through their feces; this being so, 30 samples were collected in different points of the school concerned and submitted to coproculture analysis, where the bacteriological procedure consisted of the stages of pre-enrichment, enrichment in selective broth, plating, biochemical test, and serological confirmation. The selective enrichment was carried out with tetrathionate broth and iodine, and the means of culture for plating were Agar SS, Agar MC, and Agar VB. Through the method employed, Salmonella spp. was not detected in the samples analyzed, but Shigella dysenteriae and Shigella flexneri were observed there. Keywords: Salmonela, Shigella, school, pigeons. 1) Introdução O pombo doméstico Columba livia, da ordem dos Columbiformes, família Columbidae (Schauensee, 1982; Harrison, 1994), foi domesticado há mais de 5000 anos e o uso desta ave tem se ampliado desde então como alimento para consumo humano, como pombo-correio para comunicações, como animal de laboratório para experimentação científica e como aves ornamentais criadas em diversas cores (Belton, 1993; Harrison, 1994).São nativas da Europa e foram trazidas para o Brasil pela família real portuguesa, no século XIX, onde adaptaram-se rapidamente ao nosso clima e geografia (Montenegro, 1998). A capacidade reprodutiva em ambiente urbano é um dos principais fatores para a proliferação do pombo em grandes cidades (Montenegro, 1998), além de existir oferta abundante de abrigo, ausência de predadores e grande quantidade de fontes de alimentação disponíveis (Nunes, 2001). Sua preferência alimentar recai sobre grãos e sementes, mas também come pão, ração de animais e sobras alimentares no lixo (Araújo, 1999; Souza, 1987). 2

A população dessas aves ( Columba livia ) vem crescendo e trazendo transtornos ao ambiente e à saúde pública (Parodi, 2001) e com isso surgem problemas como enfermidades pela presença de agentes em substratos de excrementos, ocorrência de agravos, danos materiais, danos ao patrimônio público e a monumentos (Nunes, 2001). Dentre as mais diversas enfermidades contagiosas ao ser humano e a outros animais, estão as enterobactérias, como a Salmonella spp. e a Shigella spp. que possuem afinidade pelo sistema digestório e causam problemas intestinais (FORTES,1997). As Salmonelas são bacilos móveis, Gram-negativos, que caracteristicamente, não fermentam lactose, sacarose ou salicina; produzem àcido, e geralmente gás, a partir de glicose, maltose, manitol e dextrina, sendo patogênicas por via oral, para o homem ou animais(roitman,1998), são bacilos não esporulados, de tamanho variável, crescem facilmente nos meios de cultura comuns, são resistentes à congelação em água, e a certos agentes químicos, por exemplo, verde brilhante, tetrationato de sódio e desoxicolato de sódio, tais componentes inibem os bacilos coliformes, sendo, portanto, úteis para o isolamento de salmonelas a partir de fezes(weigel,2004).em todas as formas de infecção por Salmonella, os germes penetram por via oral, podendo causar tanto infecções clínicas, como subclínicas, sendo que podem produzir 3 tipos principais de doenças: febres intestinais, septicemias e gastrenterite(maciorowski,2005). A contaminação fecal é especialmente perigosa quando as pessoas que eliminam os germes são manipuladores de alimentos, sendo que muitos animais como bovinos, roedores e aves podem estar naturalmente infectados com diversas salmonelas, contendo os microorganismos nos seus tecidos (carne), nas excreções, ou nos ovos(dos Santos,2004). As Shigelas são bacilos imóveis, Gram-negativos, aeróbios, que com poucas exceções, não fermentam a lactose, mas fermentam outros carboidratos, produzindo àcido sem gás(jawetz, 1970), as vezes são anaeróbias facultativas, porém crescem melhor em aerobiose, formam colônias transparentes, convexas, circulares 3

de bordos inteiros, que alcançam um diâmetro de cerca de 2mm, após 24 horas de incubação(henry,1991).são geralmente identificadas nos meios indicadores, por sua incapacidade de fermentar a lactose, permanecendo, assim, incolores, enquanto que as fermentadoras de lactose adquirem cor vermelha(levine,1991). As infecções por shigelas praticamente estão sempre limitadas ao trato gastrintestinal, sendo muito rara a invasão da corrente sanguínea, sendo que o principal aspecto patológico é uma inflamação da parede do intestino grosso e do íleo terminal, levando à necrose da mucosa, ulceração superficial, hemorragia e formação de uma pseudomembrana nas áreas ulceradas,onde após um curto período de incubação (1 a 4 dias), há um início abrupto, com dor abdominal, cólicas, diarréia e febre, e as fezes são líquidas e, após as primeiras evacuações, apresentam muco e sangue. São transmitidas pelos alimentos, dedos, fezes e moscas, de homem para homem(silva,2002). A transmissão direta fecal-oral é freqüente em ambientes institucionais, tais como creches, hospitais mentais e enfermarias(trabulsi,1998).nas infecções bacterianas transmitidas por água e alimentos, os microorganismos são veiculados ao organismo humano por meio do consumo de água e alimentos contaminados com fezes humanas ou de animais( Pelczar,1997). As espécies de salmonelas e shigelas podem ser identificadas por provas bioquímicas e por análise antigênica(erenst,1982). O estudo tem como objetivo verificar a presença de bactérias patológicas, do tipo Salmonella spp./shigella spp. nas fezes dos pombos situados na Escola Estadual Joaquim Izidoro Marins, visto que os pombos são transmissores de doenças e podem causar grande ameaça à saúde pública(fortes,1997), em virtude do perigo que as mesmas podem causar, estabeleceu-se a necessidade de coletar o material excretado em diversos pontos e submetê-lo à análise de coprocultura. 4

2) Metodologia As amostras utilizadas no presente estudo que constam na Tabela 1 foram coletadas entre os meses de Agosto à Outubro de 2006 na escola estadual Joaquim Izidoro Marins no município de Sorocaba SP, totalizando assim, 50 amostras, que foram submetidas ao procedimento bacteriológico consistindo das etapas de enriquecimento à confirmação sorológica. As excretas das aves (Columba Livia) foram semeadas em solução glicerinada tamponada, onde fez se a suspensão e semeiou-se em placa com meio de cultura agar SS e agar MC e ainda da solução glicerinada, pipetou-se 1ml e semeiou-se em um tubo contendo caldo de enriquecimento de tetrationato e colocouse 5 gotas de iodo, sendo incubados na estufa de 36 C à 37 C por 24h. No dia seguinte, colheu-se do tetrationato e semeiou-se em placa com meio de cultura Verde Brilhante para a pesquisa de Salmonela spp. (Figura1) e colocou-se na estufa novamente por 24h. Segundo (Berchieri Jr,1983), o rendimento do agar MC é similar ao observado para o agar VB; já (MCCAIN,1990) recomenda o agar SS, embora não seja possível estabelecer qual seria o meio de plaqueamento ideal segundo ( PETERSEN,1997);(YUNO ET AL,1995). As colônias das placas com meio de cultura Agar VB que apresentaram colônias de aspecto vermelho foram suspeitas de Salmonella spp.; já as placas com meio de cultura agar SS e agar Mac Conkey com aspecto diferente, como por exemplo, colônias claras, indicativo de lactose negativa, colônias vermelhas, indicativo de lactose positiva e colônias com presença de H 2 S, ou seja, colônias pretas, suspeitas de salmonela(figura2), semeou-se em tríplice açúcar e colocou-se na estufa por 24h, onde fez-se a identificação da série Bioquímica(Figura3) e Sorológica das respectivas colônias suspeitas. 5

3) Resultados e Discussão Através da metodologia adotada, não foi possível detectar Salmonella spp. em nenhuma das amostras coletadas na escola estadual Joaquim Izidoro Marins, sendo que dos 50 isolados bacterianos analisados, 20 foram identificados como Klebsiella spp.,15 como, 10 como, 4 como Shigella spp. e 1como Pseudomonas spp. apresentados na Tabela 1. Das 50 culturas obtidas, no diz respeito ao meio de isolamento, 19 isolados foram obtidos a partir do agar Salmonella Shigella (SS), 30 isolados do agar Mac Conkey (MC) e 1 isolado do agar Verde Brilhante (VB) como consta na Tabela 1. Porém, 25 culturas isoladas no presente trabalho apresentaram características bioquímicas idênticas ou muito próximas às exibidas por Salmonella spp./shigella spp., conforme apresentado na Tabela 2, sendo que foram confirmadas as sorotipagens do tipo Shigella flexneri e Shigella dysenteriae através da prova sorológica.em Pseudomonas spp realizou-se teste em Glicose (negativa), pois ela não fermenta glicose e teste da oxidase + (positiva), onde comprovou que é Pseudomonas spp não fermentadora. A metodologia, a qual foi utilizada, sendo a mais indicada para o isolamento de Shigella/Salmonella spp propiciou nos meios de isolamento seletivo o crescimento de certos coiliformes fermentadores de lactose, como a, além de bactérias não fermentadoras de lactose, como Pseudomonas spp, as quais apresentaram colônias suspeitas semelhantes a exibidas por Salmonella spp, sendo assim, o meio seletivo ideal para o isolamento de Salmonella spp deveria ser inibidor, tanto de coliformes que fermentam a lactose rapidamente, como daquelas bactérias que não fermentam a lactose. Contudo, a variação de resultados, observada na literatura especializada, pode ser devido à concorrência com outros microrganismos e o tipo de material analisado (June et al.,1996). As amostras coletadas junto ao Pilar próximo da merenda, do canto da escada próximo à porta merenda, do pilar próximo da porta de materiais de higiene e do pilar próximo da porta cozinha funcionários como consta na Tabela 1 revelam a 6

presença de Shigella spp, bactérias enteropatogênicas, que podem ser disseminadas através de moscas, alimentos e água contaminadas, onde nos alerta para a remoção do pombal situado próximo ao refeitório, devido ao grande risco de contaminação aos materiais, alimentos e principalmente as pessoas que manipulam os mesmos. Conforme (Nascimento et al, 2000), a presença de enterobactérias dificulta a ação dos caldos de enriquecimento (Tetrationato, p. ex.) sobre os microorganismos competidores. Todos estes fatores podem explicar a ausência de Salmonella nesta análise, se porventura as amostras analisadas estivessem contaminadas. TABELA1- Resultado das amostras coletadas apresentando os isolados bacterianos nos respectivos meios de isolamento. AMOSTRAS Agar SS Agar Mac Conkey Agar Verde Brilhante Porta da merenda ; Klebsiella spp. Porta da sala materiais higiene Centro refeitório escada Centro do pátio Pilar próximo da porta merenda Canto escada próximo à porta merenda Pilar próximo da porta materiais higiene Canto escada próximo à quadra Pilar próximo da porta cozinha funcionários Porta cozinha funcionários Shigella dysenteriae Shigella Flexneri Shigella dysenteriae Shigella dysenteriae ; ; Enterobacter spp ; Klebsiella spp. ; Klebsiella spp. ; ; Klebsiella spp Enterobacter spp.. Pseudomonas spp. 7

Figura1: Solução Glicerinada tamponada nos tubos de ensaio, onde semeiou-se nas placas contendo os meios de cultura agar SS, agar MC e agar Verde Brilhante. Figura 2: Placas com colônias suspeitas, onde semeiou-se em tríplice-açúcar. 8

Figura 3: Análise da prova bioquímica. TABELA 2- Resultados dos testes bioquímicos apresentados pelos isolados bacterianos. Enterobacter Klebsiella Shigella Salmonella Gás glicose + + + - + Lactose + + + - - VM - - + + + VP + + - - + Citrato + + - - d Indol - - + +/- - Motilidade + - +/ - - + Fenilalanina - - - - - Uréia - + - - - Lisina + + d - + * d = Tipos bioquímicos diferentes. 9

4) Conclusões Nota-se que os resultados obtidos no presente estudo, a escola estadual Joaquim Izidoro Marins, apresenta positividade de bactérias enteropatogênicas nas amostras analisadas que constam natabela1,onde geralmente, a infecção se dissemina pela via fecal-oral, de pessoa a pessoa, através de mãos ou objetos contaminados; ocasionalmente, a água e os alimentos podem se constituir em veículos das shigelas(strohl,2004). É por essa razão que a shigelose está intimamente associada às deficientes condições higiênicas, presente em áreas densamente povoadas e sob precárias infra-estruturas de saneamento básico. Sabese ainda que as moscas são importantes veículos na disseminação da bactéria, com isso, verifica-se a necessidade de remanejar os pombos (Columba livia) que representam uma fonte relativamente importante de contaminação através de suas excretas(nascimento,2001) deixadas neste ambiente que é freqüentado por centenas de pessoas diariamente. A infecção provocada por Shigella dysenteriae é mais severa do que a acarretada pelas outras espécies, sendo caracterizada por um súbito início de dores abdominais agudas, tenesmos, pirexia e prostração, com diarréia pronunciada, acompanhada de perda de sangue e muco; náuseas e vômitos também podem ocorrer(murray,2000). Portanto, será necessário uma intervenção sanitária, junto aos órgãos competentes, para que não haja um surto de Shigelose neste local. Agradecimentos À Professora de microbiologia do CCMB da PUC, Dr. Marcela Pelegrine Peçanha. À Bióloga Amantina Aparecida Costa, do laboratório de microbiologia do CCMB da PUC, que ensinou-me os métodos laboratoriais entre outras coisas. 10

5) Referências Bibliográficas ARAÚJO, H. Aves. Edição da Campanha Nacional de Materiais de Ensino; DNE; MEC,1999. BELTON, W. Aves Silvestres do Rio Grande do Sul. 3ª edição.porto Alegre,1993. BERCHIERI Jr. A. Contaminação por Salmonella em farinhas de origem animal utilizadas no preparo de rações. [Dissertação]. São Paulo (SP): Universidade de São Paulo; 1983. DOS SANTOS, L.R.; DICKEL, E.L.; RODRIGUES, L.B. Identificação de Salmonella enteriditis fagotipo 6a em amostras de alimentos, humanos e materiais de origem avícola. Hig. Aliment., v. 18, n. 119, p. 64-67, 2004. ERENST, J.; et al. Microbiologia médica, 15ª ed., 1982. FORTES, E. Parasitologia Veterinária, 3ª ed., Ed: Ícone, 1997. HARRISON, C.; GREENSMITH, A. Aves del Mundo. Barcelona: Ediciones Omega, Sª, p.159, 1994. Henry FJ. The epidemiologic importance of dysentery in communities. Review of Infectious Diseases 13: S238-S244, 1991. JAWETZ, E.; Melnick, J.L; Adelberg, E. A.; Microbiologia Médica, 2ªedição, RJ: Guanabara Koogan, 1970. JUNE GA, SHERRODS PS, HAMMACK TS, AMAGUANA RM, ANDREWS WH. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth and Rappaport-Vassiliadis medium for recovery of Salmonella from raw flesh, highly contaminatinated foods and poultry feed: collaborative study. Journal of AOAC International 79:1307-23,1996. LEVINE, O.S; Levine, M.M. Houseflies (Musca domestica) as mechanical vetors of Shigellosis. Review of Infectious Diseases 13:688-689, 1991. 11

MACIOROWSKI, K.G.; PILLAI, S.D.; JONES, F.T.; RICKE, S.C. Polymerase chain reaction detection of foodborne Salmonella spp. in animal feeds. Crit. Rev. Microbiol., v. 31, n. 1, p. 45-53, 2005. MCCAIN CS, POWELL KC. Asymptomatic salmonellosis in healthy adult horses. Journal Veterinary Diagnostic Investigation 2:236-7,1990. MONTENEGRO NETO, H; NUNES, V. F. P. A problemática dos pombos em áreas urbanas. Vetores & Pragas, v.1, n.3, p.11-14, 1998. MURRAY, P.R; et al. Microbiologia Médica, 3ª edição, RJ: Guanabara Koogan, 2000. NASCIMENTO MS, BERCHIERI Jr A, BARBOSA MD, ZANCAN FT, ALMEIDA WAF. Comparação de meios de enriquecimento e plaqueamento utilizados na pesquisa de Salmonella em carcaças de frango e fezes de aves. Revista Brasileira de Ciência Avícola 2(1): 85-91,2000. NASCIMENTO, L. Manejo de pombas urbanas. In: I Fórum do controle de pombos em ára urbana. São Paulo: Centro de Controle de Zoonoses, pp. 3-6,2001. NUNES, V. F. P. Manejo de pombas urbanas. In: I Fórum do controle de pombos em área urbana. São Paulo: Centro de Controle de zoonoses, p.21, 2001. PARODI, E. S. M. Manejo de pombas. In: I Fórum do controle de pombos em área urbana. São Paulo: Centro de Controle de zoonoses, pp.07-010, 2001. PELCZAR; et al. Microbiologia conceitos e aplicações. São Paulo: Makron, 2 v, 1997. PETERSEN L. A comparison of EF-18 and modified brilliant green agar with lutensit for isolation Salmonella from poultry samples. Acta Veterinary Scandinavica 38:79-85,1997. ROITMAM,I.; Travassos, L.R; Azevedo; J.L. Tratado de Microbiologia, v1. Ed.Manole LTDA, 1988. 12

SCHAUENSEE, R. M. A guide to the birds of South America. Philadelphia: Academy of Naturl Sciences of Philadelphia, p.90, 1982. SILVA, E.N.; DUARTE, A. Salmonella enteriditis em aves: retrospectiva no Brasil. Rev. Bras. Ciênc. Avíc., v. 4, n. 2, p. 85-100, 2002. SOUZA, D. Aves do Brasil. Belo horizonte, Itatiaia.1987. STROHL, W.A.;HARRIET,R.; BRUCE,D.F.Microbiologia ilustrada. Porto Alegre: Artmed,2004. TRABULSI, L.R; Alterthum F. Microbiologia. São Paulo: Atheneu, 1998. WEIGEL, R.M.; QIAO, B.; TEFEREDEGNE, B.; SUH, D.K.; BARBER, D.A.; ISAACSON, R.E.; WHITE, B.A. Comparison of pulsed field gel electrophoresis and repetitive sequence polymerase chain reaction as genotyping methods for detection of genetic diversity and inferring transmission of Salmonella. Vet. Microbiol., v. 100, n. 3-4, p. 205-217, 2004 YUNO MMI, TERZOLO HR, FERNANDEZ HD, MA LENA RC, AUTUNA ME. Evalution of seletive culture media for isolation of Salmonella from poultry. Revista. Argentina de Microbiologia 27:57-69,1995. 13