MARINA SOUSA REZENDE VANESSA TIEKO MARQUES DOS SANTOS

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO FUNDAP MARINA SOUSA REZENDE VANESSA TIEKO MARQUES DOS SANTOS AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DO CONTROLE MICROBIOLÓGICO DOS HEMOCOMPONENTES DO HEMOCENTRO DE RIBEIRÃO PRETO DO PERIODO DE 2000 Á 2009. RIBEIRÃO PRETO 2010

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO FUNDAP MARINA SOUSA REZENDE VANESSA TIEKO MARQUES DOS SANTOS AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DE CONTROLE MICROBIOLÓGICO DOS HEMOCOMPONENTES DO HEMOCENTRO DE RIBEIRÃO PRETO DO PERIODO DE 2000 Á 2009. Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP e FUNDAP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo USP/ Departamento- Centro Regional de Hemoterapia. Área: Técnicas laboratoriais aplicadas em hemoterapia Orientadora: Maria Angela Pignata Ottoboni Supervisora Titular: Vanderléia Bárbaro Valente RIBEIRÃO PRETO 2010

RESUMO A transfusão de sangue e hemocomponentes com presença de bactérias de significado clínico relevante, em determinadas concentrações, pode levar a um quadro de sepse e até a óbito. A principal causa de contaminação dos hemocomponentes ocorre no momento da coleta do sangue por antissepsia inadequada durante o processo de flebotomia, com contaminação da bolsa pela bactéria procedente da pele. Outros possíveis mecanismos incluem bacteremia do doador não detectada na triagem clínica e a contaminação da bolsa de sangue durante o processo de fracionamento dos hemocomponentes. Várias estratégias têm evoluído para reduzir a contaminação dos hemocomponentes, como o aprimoramento da seleção de doadores e melhoria da antissepsia da pele, o desvio do primeiro volume de sangue na coleta para evitar contaminação por bactérias residentes na camada profunda da pele, folículos pilosos e glândulas sebáceas. Além desses cuidados também é realizado um controle microbiológico rotineiramente para assegurar a qualidade dos hemocomponentes produzidos. No presente trabalho foi avaliada a frequência de contaminação microbiológica nos hemocomponentes, determinado o hemocomponente mais susceptível a contaminação bacteriana e qual microorganismo mais frequentemente encontrado. Foram utilizados dados obtidos do Hemocentro de Ribeirão Preto por meio de testes de rotina nos hemocomponentes no período de 2000 a 2009, utilizando método de hemocultura em frascos com meios aeróbios e anaeróbios (BacT/ALERT, biomérieux). Foram analisados 7.191 concentrados de hemácias (CH), 661 concentrados de hemácias lavadas (CHL), 3.110 concentrado de plaquetas por aférese (CPA), 4.618 concentrado de plaquetas randômicas (CPR). Os dados obtidos mostraram maior contaminação em concentrados de plaquetas e concentrados de hemácias com maior predominância de bactérias da flora normal de pele. Dentre as bactérias identificadas como verdadeiros positivos a de maior frequência foi Propionibacterium acnes (0,06%) e nos casos inconclusivos foram Propionibacterium acnes (0,20%), Bacillus sp. (0,09%) e Staphylococcus epidermidis (0,06%).

Palavras chave: contaminação bacteriana de hemocomponente, controle microbiológico

SUMÁRIO 1. Introdução... 6 1.1. Objetivo... 14 2. Metodologia...16 3. Resultado...17 4. Discussão...24 5. Conclusão...26 Referências bibliográficas...27

6 1. INTRODUÇÃO A contaminação bacteriana relacionada à transfusão de hemocomponentes é uma das principais preocupações na prática hemoterápica, sendo atualmente a principal causa de infecção relacionada à transfusão de sangue (FONSECA et al., 2009), excedendo a incidência de transmissão de infecções virais por mais de duas ordens de magnitude (STÖRMER; KLEESIEK; DREIER, 2008). A reação transfusional por contaminação bacteriana é determinada pela presença de bactéria na bolsa de hemocomponente transfundida. A contaminação bacteriana nas bolsas de plaquetas é considerada como a de maior frequência dentre as infecções associadas às transfusões de sangue. Conforme relatado pelo Food and Drug Administration (FDA) 16% das fatalidades entre 1986 e 1991 descritas foram decorrentes de contaminação bacteriana. A cada ano, novos casos são diagnosticados e a maioria tem origem na bolsa de concentrados de plaquetas randômicas ou por aférese (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Na década de 1980, o aparecimento do vírus da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e a sua relação com a transfusão fizeram com que a atenção dos profissionais desta área fosse voltada, na sua quase totalidade, para a investigação e para a prevenção das transmissões virais pela transfusão (NASCIMENTO, 2002). Mesmo com a redução da transmissão sanguínea das infecções virais como hepatite B, hepatite C, HTLV e HIV, a transmissão dessas doenças por transfusão permanece presente na mídia e como a maior preocupação do público. Entretando, acredita-se que a contaminação bacteriana de hemocomponentes seja a fonte infecciosa de morbidade mais comum relacionada à transfusão. A utilização de técnicas assépticas na coleta e processamento do sangue, refrigeração de hemácias, congelamento de plasma, além da introdução do sistema de bolsas interligadas que permitem fracionamento em sistema fechado, vieram reduzir os incidentes de contaminação bacteriana de hemocomponentes, e somente na década de 1990 voltaram à literatura relatos de situações de sepse,

7 choque e morte de origem bateriana, associados a transfusão de componentes de sangue (UBIALI; DE SANTIS, 2007). Na reunião anual Center for Biologics Evaluation and Research / American Association of Blood Banks, realizada em 15 de Novembro de 2001, a contaminação bacteriana foi considerada a principal causa de morte associada à transfusão, com 63 mortes no decurso de 2001, correspondendo a 15,3% dos acidentes fatais. O aumento destas situações, quando comparadas com relatos anteriores, pode corresponder à maior atenção que lhes tem sido dada (NASCIMENTO, 2002). Em 1993, um estudo de Barrett e colaboradores, utilizando a coloração de Gram e culturas bacterianas, determinaram a incidência de contaminação bacteriana em todos os componentes celulares que deram origem a reações transfusionais. Neste estudo, realizado ao longo de um período de cinco anos e abrangendo 51.278 transfusões, foram relatadas 2.208 (4,3%) reações transfusionais. Unicamente sete casos foram atribuídos a contaminação bacteriana: um caso entre 31.385 transfusões de concentrados eritrocitários (0,003%), um caso em 712 transfusões de pools de plaquetas (0,14% dos pools plaquetários) e cinco casos em 17.928 transfusões de concentrados unitários de plaquetas obtidos por aférese, o que corresponde a 0,03% (BARRETT; ANDERSEN; ANDERSON, 1993). Em outro estudo, Chiu e colaboradores determinaram a prevalência de bacteremia sintomática, após a transfusão de plaquetas, em 161 doentes submetidos a transplante de medula óssea. Em 3.584 transfusões de pools de plaquetas ocorreram 37 reações febris, das quais 10 (0,28%), incluindo quatro choques sépticos, correspondiam a infecções bacterianas (CHIU et al., 1994). Yomtovian e colaboradores, num estudo efetuado ao longo de 12 meses, em 14.481 unidades de plaquetas (correspondendo a 3.141 pools) e em 2.476 concentrados unitários de plaquetas obtidas por aférese, verificaram a existência de contaminação bacteriana em 0,19% dos pools plaquetários, não tendo confirmado a contaminação em nenhuma unidade de plaquetas obtida por aférese (YOMTOVIAN et al., 1993). Os hemocomponentes podem ser contaminados no momento de flebotomia, e, eventualmente, por bacteremia assintomática presente no doador. Métodos para

8 prevenção da contaminação bacteriana do sangue coletado no momento da coleta se baseiam principalmente na antissepsia cutânea do doador e no desvio do fluxo inicial do sangue durante a coleta (FONSECA et al., 2009). O descarte do primeiro volume de sangue total coletado reduz o risco das bactérias associadas à flebotomia e da rolha de pele retirada pela agulha serem lançadas na bolsa, diminuindo em 80% a contaminação proveniente da flora residente na pele. As bactérias não removidas com o desvio do jato inicial podem ser encontradas no descarte de uma segunda amostra, e por essa razão recomenda-se que o volume desviado da bolsa de coleta seja de 10 a 40 ml, geralmente em torno de 30 ml. Já existem bolsas de coleta com dispositivo adequado para permitir o desvio dos primeiros mililitros coletados, com seu aproveitamento para realização dos exames sorológicos e imuno-hematológicos, sem abertura do sistema de coleta (UBIALI; DE SANTIS, 2007). A contaminação do hemocomponente pode ocorrer a partir da introdução de baixa concentrações de bactérias da pele no momento da flebotomia (STÖRMER; KLEESIEK; DREIER, 2008), que durante a estocagem passa de uma baixa concentração inicial de bactérias de reduzido risco para o receptor para uma alta população bacteriana com elevado potencial de provocar sérias reações sépticas, eventualmente letais, se associadas à produção de toxinas(ubiali; DE SANTIS, 2007). As bactérias que contaminam os hemocomponentes podem também ter origem endógena, envolvendo bactérias da corrente circulatória do doador com bacteremia oculta ou infecção pré-existente em situações tais como: fase de incubação ou recuperação de gastroenterite (Yersinia enterocolitica e Campylobacter jejuni), infecção respiratória alta assintomática (Streptococcus pyogenes), feridas cutâneas com infecção inaparente (Serratia liquefasciens), osteomielite (Salmonella choleraesuis) e manipulação dentária recente. Esses casos podem ser minimizados por uma rigorosa triagem clínica dos candidatos a doação de sangue (UBIALI; DE SANTIS, 2007). Várias estratégias evoluíram para reduzir a contaminação de componentes do sangue, por exemplo, seleção de doador para excluir os doadores com risco de bacteremia, melhoria da desinfecção da pele, desvio do fluxo inicial de sangue durante a coleta, e otimização de procedimentos de processamento do sangue. O

9 uso de concentrado de plaquetas de aférese (CPAs), em vez de pool de plaquetas de sangue total, também diminui a taxa de contaminação bacteriana, o que pode ser demonstrado pela alta incidências de reações sépticas em transfusão de pool de plaquetas (SCHREZENMEIER et al., 2007). Entretanto, pela impossibilidade de descontaminar totalmente a pele humana, ou mesmo em razão de realização de inadequado procedimento de antissepsia, organismos comensais ou da flora transistória da pele podem permanecer no local da punção venosa e ocorrer contaminação exógena de componentes. Além disso, há que se ressaltar o risco de bacteremia assintomática no doador e contaminação dos produtos durante o processamento (UBIALI; DE SANTIS, 2007). A transfusão de componentes do sangue com espécies bacterianas clinicamente relevantes e em certas concentrações pode conduzir a sepse ou um resultado fatal em pacientes que receberam a transfusão. Isto é particularmente verdade para concentrado de plaqueta, produtos que são armazenados à 22 ±2 C (SATAKE et al., 2009). A contaminação bacteriana dos concentrados de hemácias é muito mais baixa, sendo quase zero no plasma congelado e no crioprecipitado, porém Pseudomonas aeruginosa já foi encontrada nesses componentes (UBIALI; DE SANTIS, 2007). A taxa de contaminação é de 1/38.000-1/3000 para unidades de concentrado de plaquetas e 1/172.000-1/25.000 para concentrado de hemácias. Considerando as plaquetas (de doador único ou em pool ) a taxa de bacteremia pode alcançar 1/100.000 unidades relacionadas (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Estudos relatam que a taxa de letalidade é de 1/8 milhões para concentrado de hemácias podendo chegar a 1/500.000-1/7.500 unidades para concentrado de plaquetas, dependendo do tipo do hemocomponente envolvido, da espécie e da quantidade de bactéria presente e das condições clínicas do paciente (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Todos os hemocomponentes são passíveis de contaminação bacteriana, porém os concentrados de plaquetas, por possuírem composição biológica e meios ideais, e serem armazenados entre 20 C e 24 C em bolsas que permitem troca de

10 gases, são especialmente susceptíveis à proliferação de germes tanto Grampositivos quanto Gram-negativos (UBIALI; DE SANTIS, 2007). No Japão, 100% dos concentrados de plaquetas são obtidos pelo sistema de aférese e o tempo de armazenamento foi limitado a 72 horas, o que contribuíu para diminuição da frequência de sepse pós-transfusão de concentrado de plaqueta (SATAKE et al., 2009). Nos concentrados de hemácias (CH) com estocagem acima de 21 dias podem muito infrequentemente ser encontradas bactérias Gram-negativas. Transfusões de unidades de hemácias fortemente contaminadas por bactérias Gram-negativos produzem eventos de início rápido e desfechos catastróficos nos receptores (UBIALI; DE SANTIS, 2007). Nos concentrados de plaquetas podem ser encontradas bactérias Grampositivas e Gram-negativas da flora cutânea normal como os microorganismos predominantes da flora da pele, Staphylococcus epidermidis, bacilos difteróides aeróbios e anaeróbios (Corynebacterium, Propionibacterium), estreptococos e bacilos Gram-negativos ou bactérias que contaminam o ambiente (Pseudomonas sp., Flavobacterium sp. Bacillus sp.) no entanto, os organismos Gram-positivos são os mais comumente encontrados (UBIALI; DE SANTIS, 2007). A sepse na transfusão pode gerar grandes custos ao sistema de saúde. A apresentação clínica da infusão de hemocomponente com contaminação bacteriana geralmente é grave, ocorrendo durante ou imediatamente ao término da transfusão e raramente depois de sua finalização. Os sinais e sintomas são mais agudos e graves com os concentrados de hemácias e são mais tardios e leves com a infusão de concentrados de plaquetas (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Clinicamente, a maioria das contaminações transfusionais é mascarada pela doença de base do receptor. Pacientes neutropênicos, susceptíveis a infecções de repetição, podem apresentar quadros clínicos conflitantes e dificultar o diagnostico (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Os sinais e sintomas mais comumente observados são febre em geral alta, calafrios, tremores, hipotensão, taquicardia, náuseas, vômitos e choque. Outras

11 sintomatologias são ruborização, pele seca, dispneia, dores, diarreia, hemoglobinúria, coagulação intravascular disseminada (CIVD) e insuficiência renal. Deve-se ter atenção redobrada ao se observar febre e hipotensão durante ou imediatamente ao término da transfusão, pois podem ser considerados como sinal de uma possível contaminação bacteriana. Febre, choque e coagulação intravascular disseminada estão presentes nos casos mais graves (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). O aumento de temperatura pode atingir 1 a 2 C acima da referida no inicio da transfusão. Níveis elevados de temperatura podem estar associados com a maior positividade de culturas das bolsas, como foi observado em alguns trabalhos. Taxas de positividade de 27% nas culturas de bolsa e da amostra de sangue de paciente foram observadas quando a temperatura elevou 1 C e taxa de 42% quando atingiu 2 C (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Os casos fatais são comumente observados quando os organismos Gram negativos produzem endotoxina durante a estocagem principalmente dos concentrados de hemácias (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). Métodos para detecção/ diminuição da contaminação Além de minimizar o risco de contaminação bacteriana nos hemocomponentes, é importante utilizar métodos que possam detectá-la, especialmente antes que o hemocomponente seja utilizado em tranfusão. O monitoramento microbiano ou inativação do patógeno está sendo implementado por um número crescente de serviços no mundo inteiro para reduzir os riscos de transfusão associada à morbidade e mortalidade por contaminação de componentes do sangue. Em vários países, incluindo o Estados Unidos (AABB Standard 5.1.5.1), o acompanhamento microbiano para concentrado de plaqueta randômica tornou-se obrigatório (HUNDHAUSEN; MÜLLER, 2005).

12 Os métofos indiretos são pouco eficazes na detecção de contaminação bacteriana de hemocomponentes (teste do swirling, medida de ph, glicose, assim como são pouco sensíveis os métodos de coloração, como o Gram. Os métodos baseados em cultura microbiológica são mais sensíveis, portanto têm um potencial de detecção de cargas bem menores de bactérias (sistema BacT/ALERT, BDS, etc). Recentemente, o sistema de detecção microbiana BacT/ALERT (biomérieux, Marcy l'etoile, França) foi redesenhado combinando frascos de policarbonato em vez de frascos de vidro para a segurança do laboratório com um líquido de segunda geração de sensor de emulsão (LES-2). A nova configuração já foi avaliada pela sua sensibilidade para detectar a bactéria em concentrado de plaquetas. A especificidade do ensaio é outra qualidade fundamental do sistema modificado. A frequência de resultados falso-positivos da configuração anterior BacT/ALERT variaram entre 0,05 e 0,06% de todos os testes e até 6% dos testes inicialmente positivos (HUNDHAUSEN; MÜLLER, 2005). O sitema de detecçao microbiana BacT/ALERT utiliza um sensor colorimétrico e luz refletida para monitorar a presença e a produção de dióxido de carbono (CO 2 ) dissolvido no meio de cultura. Se houver microrganismo presente na amostra de teste, o dióxido de carbono é produzido à medida que os organismos metabolizam os substratos no meio de cultura. Quando o crescimento de microrganismos produz CO 2, a cor do sensor permeável a gás instalado no fundo de cada frasco de cultura muda do azul esverdeado para o amarelo. As cores mais claras resultam em um aumento das unidades de refletância monitoradas pelo sistema. A cada 10 minutos, o aparelho monitora e registra a refletância do frasco (BIOMÉRIEUX, 2006). Um outro sistema de cultura existente é o BDS (Pall Bacterial Detection System) cujos dispositivos de cultura utilizam a redução do oxigênio como marcador do crescimento de germes aeróbios (UBIALI; DE SANTIS, 2007). Como prevenção da contaminação bacteriana dos hemocomponentes podese realizar a exclusão de doadores de sangue com história ou pródromos de infecção, principalmente do trato intestinal e/ou dentária. A investigação, entre os doadores de alguma história prévia de internações ou de cirurgias e/ou utilização de antibiótico, é considerada um dos passos mais importantes do processo. Outras medidas preventivas são os cuidados com antissepsia dos braços de doadores de

13 sangue no momento da flebotomiaevitando áreas repetidamente puncionadas; ao se puncionar o doador de sangue, reservar os primeiros mililitros para análise laboratorial; cuidados no preparo, transporte e na administração do sangue seguindo as normas técnicas vigentes e de acordo com as boas práticas de produção; realização de culturas das bolsas, de acordo com o protocolo de cada serviço; inspeção dos concentrados de plaquetas a procura de swirling (ondas); inspeção visual cuidadosa das bolsas de sangue a procura de coágulos, turvação, bolhas ou de coloração preta ou purpúrica (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2007). A leucorredução por filtração tem sido apontada como um dos meios de prevenir a infecção bacteriana quer por remoção direta através do filtro, quer ainda, por remoção indireta através da redução de leucócitos (NASCIMENTO, 2002). Holden e colaboradores demonstraram que a filtração conduz à redução de Staphylococcus coagulase negativos dos concentrados eritrocitários e plaquetários, mas não a sua erradicação. O mesmo estudo demonstrou que o plasma pode atuar como um reservatório destes microorganismos (HOLDEN et al., 2000). Contudo, nas primeiras horas após a colheita ou quando o sangue total permanece por algumas horas à temperatura ambiente, como é o caso do sangue total mantido em placas de butano-diol, o crescimento das bactérias pode ser retardado na presença de leucócitos, que são posteriormente removidos na camada leuco-plaquetária. Se as bactérias não puderem ser removidas, devem ser inativadas (NASCIMENTO, 2002). O Plasma Fresco Congelado é o único componente do sangue total que é inativado por métodos considerados seguros e comercializados como tal. Durante a última década foram investigados vários métodos de inativação de concentrados de plaquetas e de eritrócitos (NASCIMENTO, 2002). Os métodos de inativação de concentrados de plaquetas podem ser divididos em dois grupos: psoralenes e métodos fotodinâmicos. A conjugação de psoralene com luz Ultra Violeta A (UVA) inibe a replicação dos leucócitos e dos agentes infecciosos. Uma nova classe de amino psoralenes, nos quais se inclui o S-59, mostrou ser altamente eficaz na inativação de vírus, bactérias e leucócitos dos

14 concentrados plaquetários, encontrando-se atualmente na fase final de ensaio clínico (NASCIMENTO, 2002). A inativação dos concentrados eritrocitários por métodos fotodinâmicos tem apresentado mais dificuldades, embora a utilização de azul de metileno pareça mais promissora que qualquer outro método fotodinâmico e se encontre atualmente em fase de pré-ensaio clínico. Dentre os compostos mais promissores, que não utilizam os processos fotodinâmicos, e de acordo com ensaios clínicos de fase I, os tratamentos dos concentrados de eritrócitos com S-303 fornece uma inativação eficaz para agentes patogênicos, com recuperação pós-transfusional superior a 75% da quantidade de células transfundidas, após 35 dias de armazenamento (NASCIMENTO, 2002). Quando forem identificadas quaisquer bactérias Gram-negativas ou bactérias Gram-positivas clinicamente significantes (ex: Staphylococcus aureus, Streptoccocus pneumoniae), recomenda-se a convocação dos doadores das bolsas envolvidas para avaliação, orientação, coleta de amostra para hemocultura e encaminhamento do doador para pesquisa de infecção ou bacteremia oculta. Nos casos de identificação nos hemocomponentes de germes sugestivos de flora cutânea normal (Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acne), os procedimentos de seleção e antissepsia do local de coleta, técnica de flebotomia, bem como a ocorrência de incidentes na coleta devem ser reavaliados e estes processos serem submetidos à revisão, se necessário (UBIALI; DE SANTIS, 2007). 1.1 OBJETIVOS O objetivo geral deste estudo é avaliar a contaminação bacteriana nos hemocomponentes produzidos no Hemocentro de Ribeirão Preto.

15 1.1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar a freqüência de contaminação bacteriana nesses hemocomponentes; Determinar o hemocomponente mais susceptível à contaminação bacteriana; Avaliar quais bactérias são mais frequentes nos hemocomponentes contaminados

16 2. MATERIAL E MÉTODOS Foi realizado um estudo retrospectivo dos dados obtidos pelo Laboratório de Controle da Qualidade do Hemocentro de Ribeirão Preto nas análises de rotina do controle de qualidade microbiológico dos hemocomponentes no período de 2000 a 2009. Foram analisados os resultados de hemoculturas de 7.191 concentrados de hemácias (CH), 661 concentrados de hemácias lavadas (CHL), 3.110 concentrado de plaquetas por aférese (CPA), 4.618 concentrado de plaquetas randômicas (CPR), totalizando 15.580 bolsas. O controle microbiológico foi realizado utilizando sistema de detecção microbiana BacT/ALERT (biomérieux, Marcy l'etoile, França) em frascos de hemocultura aeróbios e anaeróbios.

17 3. RESULTADOS A seguir, nas tabelas 1, 2, 3 e 4, serão relacionados os resultados obtidos no Hemocentro de Ribeirão Preto nas análises laboratoriais do controle microbiológico dos hemocomponentes (CH, CPR, CPA e CHL respectivamente). Na Tabela 1 observa-se que foram confirmados dois P. acnes e S. epidermidis totalizando um índice de positividade de 0,04% entre os 7191 concentrados de hemácias inoculados. Além dos casos positivos confirmados, foram encontrados 26 casos de culturas inconclusivas (0,36%). Tabela 1- Resultado das avaliações das hemoculturas em CH. (Continua) total Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice inoculado 2000 0 0,00% 2 Propionibacterium acnes 0,26% 764 2001 0 0,00% 3 Bacillus sp., Eubacterium lentum, Staphylococcus epidermidis 0,41% 724 2002 0 0,00% 3 P. mirabilis, P. acnes, E. lentum 0,40% 744 2003 0 0,00% 4 P. acnes, Propionibacterium granulosum 0,53% 748 2004 0 0,00% 6 Bacillus sp., P. acnes, Eubacterium limosum, E. lentum 0,81% 740 2005 0 0,00% 0 0,00% 661 2006 0 0,00% 3 Staphylococcus auricularis, P. acnes, Staphylococcus epidermidis 0,54% 551 2007 1 P. acnes 0,13% 1 Escherichia coli 0,13% 757

18 Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice 2008 1 S. epidermidis 0,13% 2 P. acnes, Corynebacterium sp. (Continuação) Total inoculado 0,26% 763 2009 1 P. acnes 0,14% 2 P. acnes Streptococcus viridans 0,27% 739 Total 3 0,04% 26 0,36% 7191 P = Positivo; I = Inconclusivo. Na Tabela 2 pode ser observado que foram confirmados positivos seis P. acnes, um E. lentum e um E. aerogenes, totalizando um índice de positividade de 0,17% entre os 4618 concentrados de plaquetas randômicas inoculadas. Além dos casos positivos confirmados, foram encontrados 34 casos de culturas inconclusivas entre as 4618 unidades de CPR inoculadas (0,74%). Tabela 2 - Resultado das avaliações das hemoculturas em CPR. (Continua) Total Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice inoculado 2000 1 P. acnes 0,13% 2 2001 0 2002 0 P. acnes Stapylococcus aureus 0,27% 744 0,00% 1 Staphylococcus epidermidis 0,14% 730 0,00% 1 S. epidermidis 0,14% 738 2003 1 E. lentum 0,15% 1 E. lentum 0,15% 655 2004 1 P. acnes 0,34% 2 2005 0 2006 0 0,00% 0 S. epidermidis, P. acnes 0,67% 298 0,00% 273 0,00% 1 Streptococcus viridians 0,25% 393 2007 0 0,00% 1 Klebsiella pneumonia 0,34% 292

19 (continuação) Total Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice inoculado 2008 1 P. acnes 0,40% 14 Bacillus sp., P. acnes, Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Micrococcus sp., S. epidermidis 5,60% 250 2009 3 1 P. acnes, E. aerogenes 1,63% 11 Bacillus sp., P. acnes, Streptococcus sp., S. epidermidis, Corynebacterium sp., Pseudomonas oryzihabitans 4,49% 245 Total 8 0,17% 34 0,74% 4618 P = Positivo; I = Inconclusivo. Considerando os resultados das culturas de concentrados de plaquetas obtidos por aférse (Tabela 3), pode-se observar que foram confirmados um P. acnes e S. epidermidis totalizando um índice de positividade de 0,06% entre os 3110 amostras de bolsas inoculadas. Além dos casos positivos confirmados, foram encontrados 11 culturas inconclusivas (0,35%). Tabela 3 - Resultado das avaliações das culturas em CPA. (Continua) total Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice inoculado 2000 0 0,00% 0 0,00% 129 2001 0 0,00% 0 2002 0 0,00% 2 Propionibacterium acnes, Eubacterium lentum 0,00% 200 0,75% 268 2003 1 S. epidermidis 0,44% 1 Staphylococcus captilis 0,44% 228 2004 0 0,00% 0 2005 0 0,00% 0 2006 0 0,00% 0 0,00% 209 0,00% 218 0,00% 367

20 (Continuação) total Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice inoculado 2007 1 P. acnes 0,33% 1 Staphylococcus hominis 0,33% 301 2008 0 0,00% 4 2009 0 0,00% 3 Bacillus sp., P. acnes, Staphylococcus epidermidis Corynebacterium sp., P. acnes 0,73% 548 0,47% 642 Total 2 0,06% 11 0,35% 3110 P = Positivo; I = Inconclusivo. Em relação aos resultados das culturas dos concentrados de hemácias lavadas (Tabela 4 ) não foram identificados resultados verdadeiros positivos entre os 661 CH lavados inoculados, sendo que os quatro culturas alteradas foram inconclusivas (0,61%). Tabela 4 - Resultado das avaliações das culturas em CHL Ano P Microorganismo Índice I Microorganismo Índice total inoculado 2000 0 0,00% 0 0,00% 0 2001 0 0,00% 0 0,00% 0 2002 0 0,00% 0 0,00% 6 2003 0 0,00% 0 0,00% 6 2004 0 0,00% 1 Bacillus subtilis 1,96% 51 2005 0 0,00% 1 Staphylococcus aureus 0,85% 117 2006 0 0,00% 0 0,82% 122 2007 0 0,00% 1 Bacillus sp. 0,83% 120 2008 0 0,00% 0 0,83% 120 2009 0 0,00% 1 Staphylococcus epidermidis 0,84% 119 Total 0 0,00% 4 0,61% 661 P = Positivo; I = Inconclusivo.

21 A figura 1 mostra os percentuais de cada espécie bacteriana identificada nas culturas dos hemocomponentes do Hemocentro de Ribeirão Preto com resultados positivos, no período de 2000 a 2009. Pode-se notar que cerca de 70% dos resultados positivos são germes proveniente da pele. Figura 1 Percentual de cada espécie bacteriana para os resultados positivos verdadeiros nos hemocomponentes analisados (CH, CPR, CPA e CHL) no periodo de 2000 a 2009. Na figura 2 o grafico mostra os percentuais de cada espécie bacteriana identificada nas culturas dos hemocomponentes do Hemocentro de Ribeirão Preto com resultado final inconclusivo, no período de 2000 a 2009. Embora estes resultados foram considerados inconclusivos, o perfil de bactérias identificadas predominante é de germes da flora cutânea.

22 Figura 2 Percentual de cada espécie bacteriana para os resultados inconclusivos nos hemocomponentes analisados (CH, CPR, CPA e CHL) no periodo de 2000 a 2009. A figura 3 mostra um comparativo entre os resultados de culturas positivas verdadeiras de todos os hemocomponentes analisados no período de 2000 a 2007 (12.154 hemocomponentes) com o período de 2008 a 2009 (3.426 hemocomponentes). Uma alteração importante da técnica entre estes dois períodos foi a mudança do volume do inóculo de 2 para 8 ml, podendo ter sido este um fator na melhoria dos resultados.

23 Figura 3 Comparativo da portcentagem de positivos verdadeiros entre os periodos de 2000 /2007 e 2008/2009.

24 4. DISCUSSÃO Considerando o risco da contaminação bacteriana dos hemocomponentes, o Hemocentro de Ribeirão tem procurado melhorar continuamente suas práticas a fim de prevenir e detectar a contaminação bacteriana dos hemocomponentes produzidos. Até o final do ano de 2001 este Hemocentro utilizava um único frasco (aeróbio/anaeróbio), sendo o frasco aeróbio pediátrico com baixa tensão de CO 2 que permitia o crescimento de alguns microorganismos anaeróbios. A partir de 2002 começou a ser utilizado junto a esse, o frasco exclusivo para anaeróbio (tipo adulto). O frasco pediátrico era a opção de utilizar um volume menor de amostra dos hemocomponentes. Além de modificar a técnica de antissepsia do braço do doador, em 2006 começaram a ser utilizadas as bolsas de coleta com desvio de fluxo, com a intenção de diminuir a contaminação das bolsas por bactérias vindas da flora normal da pele dos doadores. Em outubro de 2007 houve um aumento do percentual de hemocomponentes analisados, passando de 1% para 11% os concentrados de plaquetas randômicos analisados por cultura microbiológica. A partir do ano de 2008 optou-se pela troca do frasco aeróbio pediátrico pelo adulto, para aumentar o volume inoculado (estudos comprovam maior chance de encontrar verdadeiros positivos). Foi considerado verdadeiro positivo quando a positividade foi confirmada na reinoculação do mesmo hemocomponente, ou se na inoculação do co-componente foi encontrado o mesmo microorganismo; resultado é considerado inconclusivo quando não foi possível confirmar a positividade, ou quando não positivou o reinóculo. Conforme descrito na literatura, dentre os hemocomponentes analisados os mais suceptíveis a contaminação bacteriana foram os produtos celulares - CPs e CHs. Isso se deve a que os CPs são armazenados em temperatura de 22 ± 2ºC que favorece a proliferação bacteriana, e os concentrados de hemácias levam consigo

25 na sedimentação por centrifugação no processamento, as bactérias presentes na bolsa de sangue total. Com os dados obtidos pode ser observado que no total de 15.580 dos hemocomponentes analisados, 88 apresentaram positividade (0,565%), sendo que somente 13 foram positivos verdadeiros (0,083%), ficando 75 (0,481%) inconclusivos. Isso pode ser explicado por vários fatores como a falta ou volume insuficiente de amostra para reinoculação, componente ou co-componente já descartado, contaminação na inoculação, dentre outros. Nos resultados dos últimos 2 anos (2008/2009) pode ser observado um aumento nos índices de positivos verdadeiros quando comparados com o periodo de 2000 a 2007. De 2000 a 2007 o índice de resultados microbiológicos verdadeiros positivos foi 0,05% e no periodo de 2008 a 2009 foi 0,20%. Isto pode ter sido denominado pela mudança do volume do inóculo, na utilização do frasco adulto, evidenciando assim melhorias nas técnicas do controle microbiológico e com isso conseguindo detectar a presença de bactérias. Dentre as bactérias identificadas como positivos verdadeiros a de maior frequência foi Propionibacterium acnes (0,058%) e nos resultados inconclusivos foram Propionibacterium acnes (0,199%), Bacillus sp. (0,071%) e Staphylococcus epidermidis (0,058%).

26 5. CONCLUSÃO A taxa de contaminação bacteriana nos hemocomponentes analisados (CH, CP, CPA e CHL) foi baixa, estando dentro dos padrões exigidos pela legislação RDC 153 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Entre os índices de positivos a plaqueta randômica é o hemocomponente de maior preocupação (tabela 2) sendo que os resultados analisados nas tabela 2 em comparação com os demais hemocomponentes (tabela 1, 3, 4) evidenciaram este alto índice de positividade quando comparado aos outros hemocomponentes. Os CPR apresentou índice positivo de 0,17%, enquanto que os outros apresentaram índices menores que 0,06%. Considerando o que se sabe da literatura que o risco de contaminação bacteriana de hemocomponentes é real, a melhoria das técnicas do controle de qualidade utilizadas foi evidenciada pelos resultados obtidos nos ultimos dois anos, comprovado pelo aumento dos verdadeiros positivos. As bactérias de maior frequência nos casos de positividade são de flora normal da pele (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis), evidenciando a necessidade de maior atenção para melhoria das técnicas utilizadas no momento da antissepsia do braço do doador, além da manuetenção do uso das bolsas com desvio de fluxo na coleta do sangue. Devido a dificuldade de eliminar a contaminação dos hemocomponentes sanguíneos, seja endógenas do doador, seja no momento de coleta ou na manipulação/processamento das bolsas, faz-se necessário que os centros de hemoterapia tenham um sistema de detecção bacteriano eficiente a fim de prevenir a transfusão de hemocomponentes contaminados.

27 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual Técnico de Hemovigilânica Investigação das reações transfusionais imediatas e tardias não infecciosas. Brasília, DF, p. 59-62, 2007. BARRETT, B. B.; ANDERSEN, J. W.; ANDERSON, K. C. Strategies for the avoidance of bacterial contamination of blood components. Transfusion, v.33. p. 228-233,1993. BIOMÉRIEUX, Manual do usuário versão B.25 BacT/ALERT 3D. EUA, 358 p., 2006. CHIU, E.K. et al. A prospective study of symptomatic bacteremia following platelet transfusion and of its management. Transfusion, v.34, p. 950-954, 1994. FONSECA, L. G. et al. Avaliação da antissepsia cutânea por quatro métodos em doadores de sangue. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, São Paulo, v.31(1), p. 5-8, 2009. HOLDEN, F. et al. Coagulase-negative staphylococcal contamination of whole blood and its components: the effects of WBC reduction. Transfusion, v.40, p.1508-1513, 2000.

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