O uso de Marcadores Moleculares na Caracterização Citoplasmática em Cebola Como Auxílio no Melhoramento de Cultivares Híbridas. Daniela L. Leite 1 ; Denilson Anthonisen 1 1 Embrapa Clima Temperado, BR 392, Km 78, C. P. 403, 96001-970, Pelotas, RS, Brasil E-mail: daniela@cpact.embrapa.br RESUMO Sistemas de macho-esterilidade gênica-citoplasmática são utilizados para produção de sementes de cebola híbridas. Estes são condicionados por um fator citoplasmático S e um genótipo homozigoto recessivo (msms) em um loco nuclear (Ms) para a restauração da macho-fertilidade. Linhas macho-estéreis podem ser mantidas por sementes quando cruzadas com uma linha mantenedora, a qual possui citoplasma normal (N) para machofertilidade e genótipo (msms). A caracterização dos polimorfismos nos DNAs de cloroplasto e mitocôndria que distinguem citoplasmas normal e estéril, constituem-se em técnicas mais rápidas do que avaliações dos citoplasmas por cruzamentos. Este estudo foi realizado para a caracterização de citoplasmas entre plantas individuais de seis cultivares de elite de polinização aberta através de análise de genomas de cloroplasto e mitocôndria. Quatro cultivares apresentaram somente citoplasma N e duas, ambos citoplasmas N e S. As plantas com citoplasma N serão selecionadas para mantenedoras (Nmsms) para produção de sementes híbridas. PALAVRAS-CHAVE: Allium cepa L., macho-esterilidade gênica-citoplasmática, reação da polimerase em cadeia ABSTRACT The use of molecular markers in the onion cytoplasm characterization as an aid in the hybrid cultivar breeding Cytoplasmic-genic male sterility (CMS) systems are used to produce hybrid-onion seed. These are conditioned by a cytoplasmic factor (S for sterile) and the homozygous recessive genotype (msms) at a nuclear locus (Ms) for male-fertility restoration. Male-sterile lines can be maintained by seed when crossed with a maintainer line, which possesses normal
cytoplasm (N) for male-fertility and (msms) genotype. Characterization of polymorphisms in the chloroplast DNA and mitochondrial DNA that distinguish N and S cytoplasms are significantly faster than crossing. This study was done to characterize the cytoplasms among individual plants of six open pollinated onion cultivars through chloroplast and mitochondria genome analyses. Four cultivars presented only cytoplasm N and two both cytoplasms N and S. The plants with N cytoplasm will be selected for maintainers (N msms) for hybrid seed production. KEYWORDS: Allium cepa L., cytoplasmic-genic male-sterility, polymerase chain reaction MATERIAL E MÉTODOS Foram analisados marcadores de PCR de Havey (1995) e Sato (1998) nas cultivares Baia Periforme, Bola Precoce, BRS Cascata, Crioula, Primavera e Roxa, variando de 8 a 45 plantas por genótipo, num total de 122 plantas. As amostras utilizadas para análise foram de folhas jovens, obtidas a partir de brotações de bulbos plantados à campo. Cada amostra se constituiu de 110 a 140mg de folhas. Após a pesagem das amostras, estas foram colocadas em tubos eppendorf e armazenadas à 80 o C até o momento da extração do DNA genômico. Os procedimentos usados para extração do DNA e a separação dos fragmentos amplificados por eletroforese foram os descritos por Ferreira & Grattapaglia (1998). A estimativa de concentração de DNA, em gel de agarose, foi realizada com base na comparação da intensidade das bandas com o padrão lambda cortado com a enzima HindIII, ficando estabelecida uma concentração final de 5 ng.ul -1. As reações de amplificação foram realizadas com volume de 15 μl, conforme Szklarczyk et al. (2002), com modificações, contendo cada mistura de reação: 10 mm Tris HCl ph 8,8; 50 mm KCl; 5 mm MgCl2; 0,25 mm de cada dntp; 0,05% BSA; 0,3 μm; 10 ng de DNA genômico e 0,5 U de Taq polimerase marca Gibco e cobertas com uma gota de óleo mineral. As amplificações foram realizadas em tubos de eppendorf em um termociclador (RoboCycler 96 Temperature Cycler Stratagene) programado para um ciclo de cinco minutos a 94 o C, seguido de 36 ciclos repetidos nas seguintes condições: 45 segundos a 92 o C (desnaturação), 45 segundos a 57 o C (anelamento) e dois minutos a 72 o C (extensão). Após, foi efetuado um passo final de extensão de 10 minutos a 72 o C. DNAs de citoplasma estéril (B1750A) e normal (B1750B), provenientes do Ministério da Agricultura dos Estados Unidos, foram incluídos nas reações como controle.
Os produtos das reações de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose (Gibco), submerso, na concentração de 1,5%, com uma diferença de potencial de 80 v.cm -1 por um período médio de três horas e trinta minutos, corados com brometo de etídeo (5 ul de uma solução 10 mg.ml -1 para cada gel de 100 ml), deixados para migrar por 8 cm, e fotografados sob luz ultravioleta (302 nm). Em todos os géis foi utilizado um DNA padrão da Ladder de 1Kb (4ul), com fragmentos de tamanhos conhecidos. As cultivares foram genotipadas através dos produtos visualizados em gel. RESULTADOS E DISCUSSÃO Das seis cultivares testadas, duas possuíam citoplasma N e S (Crioula e Primavera) e quatro possuíam somente citoplasma N (Tabela 1). Todas as cultivares estudadas são produzidas na região Sul do Brasil. Baia Periforme originou-se da população portuguesa Garrafal e foi introduzida no RS. Crioula é cultivada principalmente em SC e pode ter sido originada de um cruzamento entre 'Baia Periforme' e Pêra Norte (outra população do RS) (Barbieri et al., 2002). Bola Precoce e Primavera são cultivares precoces obtidas a partir de seleção de população de Baia Periforme, lançadas respectivamente pela Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina S.A. e pela Embrapa Clima Temperado. 'BRS Cascata é uma cultivar lançada pela Embrapa Clima Temperado a partir de trabalho de seleção massal a partir da população de Pêra Norte, que apresenta as vantagens de alta conservação pós-colheita (até seis meses em galpão) proporcionada pelo alto número de escamas e por sua coloração externa atraente (pinhão bronzeada) (Leite et al., 2002). Havey (1995) identificou citoplasmas de plantas individuais em uma população de polinização aberta de cebola usando reação em cadeia da polimerase [polymerase chain reaction (PCR)] pela amplificação de um fragmento de 100 pares de base presente no DNA de cloroplasto de citoplasma normal e ausente em citoplasma S. Sato (1998) desenvolveu um marcador de PCR similar, a partir de DNA de mitocôndria. Havey (1995) descreveu a produção de fragmentos de 1,0 e 1,1 e Sato (1998) de 0,41 e 0,18 para citoplasmas S e N respectivamente. No presente trabalho, as bandas descritas por Havey (1995) de 1,1 e 1,0 kb corresponderam a fragmentos de 1,2 e 1,1 kb respectivamente, concordando com os resultados obtidos por Szklarczyk et al. (2002). Das 122 plantas analisadas, foi possível caracterizar 116 plantas com os "primers" de Sato e 58 plantas com os "primers" de Havey (1995) (Tabela 1). Dessa forma, com a aplicação dos "primers" de Sato (1998), foi possível caracterizar um número de plantas 50% superior. Para cada planta analisada ambos
marcadores produziram os mesmos resultados (Figura 1). Além dos fragmentos já mencionados, houve a amplificação de alguns fragmentos adicionais com ambos conjuntos de "primers": o produto de cloroplasto de 1,2 kb estava sempre associado com uma banda de 0,9 kb. Para alguns acessos, o marcador mitocondrial produziu uma banda de 0,4 kb. Esta banda nunca estava associada às plantas com citoplasma S e estava sempre associada com uma banda forte de 0,18 kb. Como o surgimento das bandas inesperadas eram presentes em plantas férteis ou não possuidoras de citoplasma S, não apresentando dessa forma nenhum valor no diagnóstico, elas foram desconsideradas nas descrições. Também com a utilização dos "primers" de Sato (1998), foi observada uma banda fraca de 0,18 kb nas plantas classificadas com citoplasma S, demonstrando fragmento de 1,1 kb em Havey (1995) e 0,41 kb em Sato (1998). Os resultados do surgimento de bandas adicionais concordam com os resultados obtidos por Szklarczyk et al. (2002) e Engelke et al. (2003). A identificação molecular citoplasmática constitui-se em uma técnica útil na redução do tempo e esforços empregados em um programa de melhoramento de cebola, quando são necessários o desenvolvimento de novas linhagens macho-estéreis e suas mantenedoras correspondentes. Caso seja detectado por marcadores de PCR um citoplasma indutor da esterilidade, esta planta nunca poderá ser utilizada como mantenedora no sistema de macho-esterilidade gênica-citoplasmática. Esta planta poderá ser estéril ou quando autofecundada, poderá segregar para plantas macho-estéreis e poderão ser usadas como ponto de partida para uma linhagem estéril. A seleção de plantas macho-estéreis e suas plantas mantenedoras correspondentes de mesma procedência, poderão reduzir o número de retrocruzamentos necessários para se alcançar a homozigose entre as linhagens para o alcance de um programa de melhoramento de híbridos de cebola de sucesso. LITERATURA CITADA BARBIERI, R.L.; LEITE, D.L.; CASTRO, C.; CHOER, E.; PEREIRA, A. Collecting Southern Brazil onion genetic resources for use and conservation. In: NATIONAL ALLIUM RESEARCH CONFERENCE, 2002, Pasco. Abstracts. Pasco: Washington State University, 2002. p.55. ENGELKE, T.; TEREFE, D.; TATLIOGLU,T. A PCR-based marker system monitoring CMS- (S), CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion (Allium cepa L.). Theorethical and Applied Genetics, v. 107, p. 162-167, 2003.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3a ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. pp. 220. (EMBRAPA- CENARGEN Documento 20) HAVEY, M.J. Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid in extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion. Theoretic and Applied Genetics, v. 90, p. 263-268, 1995. LEITE, D.L.; GARCIA, A.; SANTOS, A. BRS Cascata a new cultivar released by Temperate Climate Agricultural Research Center, Embrapa, Brazil. In: NATIONAL ALLIUM RESEARCH CONFERENCE, 2002, Pasco. Abstracts. Pasco: Washington State University, 2002. p. 56. SATO, Y. PCR amplification of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of onion (Allium cepa L.). Theoretical and Applied Genetics, v. 96, p. 367-370, 1998. SZKLARCZYK, M.; SIMLAT, M.; JAGOSZ, B.; BA, G. The use of cytoplasmic markers in onion hybrid breeding. Cellular & Molecular Biology Letters, v. 7, p. 625-634, 2002.
Tabela 1. Citoplasmas de cultivares brasileiras de cebola Cultivar N.º de Marcadores citoplasmáticos [kb] a Havey (1995) Sato (1998) plantas Citoplasma b B1750A c - 1,1 0,41 Estéril (S) B1750B c - 1,2 0,18 Normal (N) Bola Precoce 8-0,18 (8 plantas) N BRS Cascata 21 1,2 (21 plantas) 0,18 (19 plantas) N Crioula 45 1,2 (18 plantas) 0,41 (2 plantas) N e S 1,1 (1 planta) 0,18 (43 plantas) Primavera 30 1,2 (18 plantas) 0,41 (1 planta) N e S 0,18 (25 plantas) Roxa 8-0,18 (8 plantas) N Baia Periforme 10-0,18 (10 plantas) N TOTAL 122 58 116 N a somente foram consideradas bandas fortes e reproduzíveis. b citoplasmas determinados pela presença ou ausência de bandas dos marcadores de Havey (1995) e Sato (1998).segundo amplificação de Szklarczyk et al. (2002). c DNAs padrões provenientes do Ministério da Agricultura dos Estados Unidos. Figura 1. Produtos de PCR gerados com "primers" de Havey (1995) (a) e Sato (1998) (b) segundo amplificação de Szklarczyk et al. (2002): 1 a 6 Plantas individuais de Crioula ; 7 B1750A, DNA padrão de citoplasma macho-estéril (S); 8 Marcador de DNA 1kb; 9 B1750B, DNA padrão de citoplasma normal, macho-fértil (N); S citoplasma S; N citoplasma N.