QUÍMICA ANALÍTICA AVANÇADA 1S 2017 MÓDULO 2 Estatística Aplicada à Química Analítica - Conceitos básicos Prof. Rafael Arromba de Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br Notas de aula: www.ufjf.br/baccan
Estatística Aplicada à Química Analítica Aula anterior: Conceitos e definições básicos Não existe um valor absoluto para um resultado analítico Forma correta de expressar os resultados Definição de exatidão e precisão Importância de rejeitar resultados anômalos Exercícios: Exerc. 1 Algarismos significativos Exerc. 2 Precisão e rejeição de resultados 3
Estatística Aplicada à Química Analítica Aula anterior: Conceitos e definições básicos Não existe um valor absoluto para um resultado analítico Forma correta de expressar os resultados Definição de exatidão e precisão Importância de rejeitar resultados anômalos Nessa aula: - Conceitos básicos (continuação) - Noções de Quimiometria (?) 3
RELAÇÃO ENTRE EXATIDÃO E PRECISÃO A Exatidão e a Precisão se relacionam de 3 formas principais: Método de análise C B A preciso e exato! preciso mas inexato impreciso e inexato valor verdadeiro Conc. do analito EXEMPLOS PRÁTICOS?? 4
Algumas formalidades... TERMINOLOGIAS 1) Boa precisão = Boa repetibilidade reprodutibilidade Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling. Guidelines on Analytical Terminology (CAC/GL72 2009) 5
2) Precisão intermediária TERMINOLOGIAS (Semelhante ao apresentado na Rev. 05 Ago 2016) 6
A ESTATÍSTICA NA ANÁLISE QUÍMICA 1. Definição do problema analítico 2. Escolha do método de análise 3. Amostragem 4. Tratamento da amostra (e separação da espécie de interesse) 5. Calibração Comparação de Resultados: 6. Medida analítica RESULTADO (MÉDIA ± INCERTEZA) 7. Avaliação dos resultados : RESULTADO OBTIDO x RESULTADO ESPERADO 8. Ação Comparação Precisões (Teste F) Médias (Teste t de Student) 7
Teste F (ou Teste de Snedecor) Comparar precisões (ou variâncias) de duas médias (A e B) F = S A 2 S B 2 A refere-se à média com o maior desvio SE F calculado < F crítico para a confiabilidade desejada Não existe diferença significativa entre os conjuntos de dados em termos de precisão SE F calculado F tabelado para a confiabilidade desejada Existe diferença significativa entre os conjuntos de dados 8
Tabelas para os valores críticos de F Ex: Valores críticos para F ao nível de 5%* Graus lib. 3 4 5 6 12 20 Numer. 3 9,28 9,12 9,01 8,94 8,74 8,64 4 6,59 6,39 6,26 6,16 5,91 5,80 5 5,41 5,19 5,05 4,95 4,68 4,56 6 4,76 4,53 4,39 4,28 4,00 3,87 12 3,49 3,26 3,11 3,00 2,69 2,54 20 3,10 2,87 2,71 2,60 2,28 2,12 Denom. * A tabela indica as probabilidades dos valores serem diferentes (confiabilidade de 95% para não haver diferença significativa entre os resultados) 9
EXERCÍCIO Exercício 3- Comente sobre a diferença na precisão obtida nos laboratórios A e B para a determinação de Mg em uma mesma amostra de leite considerando um nível de confiança de 95%. Dados: Lab. A : 34,97; 34,85; 34,94 e 34,88 mg L -1 e Lab. B : 35,02; 34,96; 34,99; 35,07 e 34,85 mg L -1 (Precisões semelhantes, comparáveis) 10
MAS para avaliar os parâmetros precisão e exatidão: entender que erros afetam esses parâmetros? TIPOS ERROS: - SISTEMÁTICOS (rastreáveis e pode ser evitados) - ALEATÓRIOS (sempre presentes... ) 11
1) Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados) Erros de Método : surgem do comportamento químico ou físico não ideal de sistemas analíticos Erros Pessoais : resultam da falta de cuidado, falta de atenção ou limitações pessoais do analista afetam a exatidão Erros Instrumentais: causados pelo comportamento não ideal de um instrumento, por calibrações falhas ou pelo uso de condições inadequadas 12
Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados) Como detectar um erro sistemático? Materiais de Referência Certificados (CRM) Método de adição e recuperação de analito ( spike ) Métodos comparativos Testes interlaboratoriais 13
Erros Sistemáticos ou Determinados CRM - Adquirir de empresas especializadas (NIST*) Amostras com certificado de análise (resultado ± incertza) Substâncias comumente encontradas em amostras: AMBIENTAIS CLÍNICAS BIOLÓGICAS FORENSES (*) National Institute and Technology 14
Erros Sistemáticos ou Determinados Exercício 4- PESQUISAR PARA A PRÓXIMA AULA - Se existem CRMs disponíveis comercialmente para as suas matrizes de estudo (ou interesse) 15
2) Erros Indeterminados (aleatórios ou randômicos) Não podem ser localizados Medidas flutuam aleatoriamente ao redor da média afetam a precisão Variam de acordo com uma distribuição normal 16
% das medidas Ex de uma Distribuição Normal (Calibração de uma pipeta) 50 30 Curva de Gauss (Perfil da distribuição) 10 9.969 9.971 9.975 9.977 9.981 9.983 9.987 9989 9.993 9.995 volume (ml) Histograma mostrando a distribuição de 50 medidas do volume escoado por uma pipeta de 10,00 ml OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp) 17
Karl F. Gauss Característica de uma Distribuição Normal Os resultados são alterados ora para menos, ora para mais, por erros que parecem se dar ao acaso (aleatórios), que é um comportamento esperado e, por isso, normal 18
Distribuição Normal de Gauss Probabilidade de ocorrência de um resultado (Y) Y = 1 2 exp - 1 (X i - ) 2 2 2 µ corresponde a média da população (situação de várias medidas) Assim, pode-se calcular uma faixa para um resultado R supondo que os desvios observados seguem uma distribuição normal OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp) 19
Distribuição Normal e a Estatística Clássica Para a estatística clássica os desvios da normalidade não afetam os resultados do ponto de vista estatístico (métodos robustos) e esta ideia é apresentada no Teorema do Limite Central : Se a flutuação total numa certa variável aleatória for o resultado da soma das flutuações de muitas variáveis independentes e de importância mais ou menos igual, a sua distribuição tenderá para a normalidade, não importa qual seja a natureza das distribuições das variáveis individuais W S Gossett (1868 1937): Desenvolveu a distribuição de Student para analisar resultados do teor de álcool em cerveja 20
Frequência relativa Limites de confiança para a media de um resultado 0,4 0,3 0,2 0,1 0 _ -2-1 0 +1 +2 + Distribuição Normal de Gauss = x z N Níveis de Confiança para Z % 50 0,67 68 1,00 80 1,28 90 1,64 95 1,96 95,4 2,00 99 2,58 99,7 3,00 99,9 3,29 21 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)
Limites de confiança da média quando não se tem µ = x z N = x t S N Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,36 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3,25 10 2,23 3,17...... 1,96 2,58 22 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)
Exemplo 4 (aplicação do conceito na expressão de um resultado): Um indivíduo fez quatro determinações de ferro em uma liga metálica, encontrando um valor médio de 31,40% m/m e uma estimativa do desvio padrão de 0,11% m/m. Qual o intervalo em que deve estar a média da população, com um grau de confiança de 95%? µ =? = x t S N µ = 31,40 ± (3,18 x 0,11) / 4 µ = 31,40 ± 0,17 C Fe = (31,23 31,57)% m/m 23
Comparação de médias Situação 1 Resultado ± incerteza Valor de referência Situação 2 Resultado ± incerteza Valor de referência ± incerteza 24
Exemplo de aplicação SITUAÇÃO 1 (Exp. de amostragem) Ex: Comparação da distribuição de cores de confeitos M&M com a especificação do fabricante Com base na amostragem e análise (contagem) dos analistas diferentes média (X) e estimativa do desvio (S) para cada cor Média do fabricante (µ) Calcula-se t com a confiança desejada e compara-se com o valor tabelado: t = - x S N Se o t calc < t tab não existe diferença significativa entre as médias 25
Outro modo de usar o Limite de confiança da média pra esse mesmo tipo de comparação Comparação de uma média com um valor de referência quando não se tem o desvio do valor de referência Valor referência IC para o resultado R Ex de situação em que o resultado obtido concorda com o valor de referência = x t S N ν t tabelado = N-1 26
PARA A SITUÃO 2: Se as precisões forem comparáveis, compararam-se as médias: Teste t, de Student t = S p x 1 - x 2 n 1 + n 2 n 1. n 2 n é o número das medidas para cada média S p corresponde a S agrupado S p = (n 1-1) S 1 2 + (n 2-1) S 2 2 n 1 + n 2-2 ν t tabelado = n 1 +n 2-2 SE t calculado < t crítico para o nível de confiança desejado: não existe diferença significativa entre as médias e as diferenças observadas se devem a erros aleatórios 27
MAS se as precisões não forem comparáveis: t = S p x 1 - x 2 n 1 + n 2 n 1. n 2 S p = (n 1-1) S 1 2 + (n 2-1) S 2 2 n 1 + n 2-2 ν t tabelado : ν t tabelado = n 1 +n 2-2 FÓRMULAS ESPECÍFICAS (Pesquisar...) n 1 = n 2 n 1 n 2 28
Valores críticos para t nos níveis de 95 e 99% (P= 0,025 e P= 0,005) Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,37 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3,25 10 2,23 3,17...... 1,96 2,58 Testes estatísticos são válidos quando os erros envolvidos são aleatórios Mais confiáveis serão os testes quanto maior o ν (graus de liberdade) 29
Outras formas de utilizar o teste-t Comparação de dados em pares (teste-t pareado) Amostras diferentes (do mesmo tipo ou de lotes diferentes) analisadas por métodos diferentes ou analistas diferentes Procedimento: 1) Organizar os dados em pares 2) Calcular o desvio padrão entre as diferenças das médias (dos pares) 3) Calcular o valor de t: t = d S d N ν t tabelado = N-1 ν= número de graus de liberdade 30
EXERCÍCIO Exercício 5- No seu trabalho de pós-graduação você fará comparação de resultados? Em caso afirmativo, qual teste será usado? Por quê? 31
Testes estatísticos para comparação de resultados - Precisão - Exatidão Testes de hipóteses - Hipótese nula (H 0 ) H 0 : µ = µ 0 (µ 0 é o valor verdadeiro ou de referência) - Hipótese alternativa (Ha) Ha: µ µ 0 32
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Alguns Exemplos de Propagação de Erros Leva-se em consideração as incertezas de cada etapa do processo Para erros indeterminados (situação mais usual) Para um resultado R : R = A + B C (soma e sub.) R = AB C (multiplicação e divisão) S R = S 2 A + S 2 B + S 2 C S R R = S A A 2 S B 2 + + B S C C 2 34
Propagação de Erros Para casa Exerc. 6: Considerando que o S de uma balança seja de 0,0001 g, calcule a estimativa do desvio-padrão de uma pesagem feita nesta balança. (S R = 0,0001g) 35
CASO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE O TRATAMENTO ESTATÍSTICO INCLUE TAMBÉM: Regressão linear Curva de calibração (ou analítica) Tipos: - univariada ( convencional ) - multivariada (métodos quimiométricos) Estimativa dos Limites de detecção e quantificação Cálculos baseados na Estimativa do desvio padrão do branco para prever a detectabilidade do instrumento e método 36
Absorbância REGRESSÃO LINEAR É a reta que melhor representa a relação entre a propriedade medida (Abs, p. ex) e a concentração dos padrões Padrões Abs= 48,3x + 0,24 r= 0,9987 Branco 0 Concentração (mg L -1 ) 1 - O coeficiente de correlação (r) varia entre -1 e +1 - Quanto mais próximo da unidade, melhor é a correlação 37
REGRESSÃO LINEAR Uma Curva analítica linear nem sempre é possível e uma Regressão não-linear pode ser usada desde que apresente boa correlação As Regressões lineares são as mais usuais e podem ser obtidas por meio de softwares, que usam o Método dos mínimos quadrados : Para y= ax + b, com coef. correlação r : a = n Σx i y i Σx i Σy i n Σx 2 i (Σx i ) 2 b = y - x n= n o de pontos (x 1 ;y 1 ) da calibração r = n Σx i y i Σx i Σy i { [nσx i 2 (Σx i2 )] [nσy i 2 (Σy i ) 2 ] } 1/2 38
REGRESSÃO LINEAR O Método dos mínimos quadrados minimiza os resíduos (erros) que a reta de regressão gera para cada um dos pontos Nos pontos centrais de uma curva de calibração os resíduos são sempre menores Implicações... 39
REGRESSÃO LINEAR Para casa : Vide ex. 4.9 e 4.10 do Vogel Análise Química Quantitativa, 6ª Ed: Para determinar quitina por fluorescência molecular utilizou-se padrões de quitina nas seguintes concentrações: 0,10; 0,20; 0,30 e 0,40 µg ml -1 e que resultaram nos seguintes valores de emissão, respectivamente: 5,20; 9,90; 15,30 e 19,10, Cps sendo que o branco gerou leitura de 0,00 Cps. Considerando-se que um coeficiente de correlação linear superior a 0,99 é satisfatório, calcule a concentração de quitina de uma amostra cujo sinal analítico foi de 16,10 Cps. (r= 0,9987 e C quitina = 0,32 µg ml -1 ) 40
REGRESSÃO LINEAR Para se obter uma boa calibração é preciso que: a) Os únicos erros nas medidas sejam devidos a flutuações na variável dependente y b) Os pontos tenham comportamento homocedástico (erros aleatórios com média zero e variância constante) Testes: Cochran (Q) ou Levene Regressão normal ou ponderada c) Garantir que os erros não sejam correlacionados Preparar todos os padrões do mesmo jeito e realizar as medidas experimentais de forma aleatória d) Os erros sigam uma distribuição normal Teste de Shapiro Wilk e) O modelo obtido não apresente falta de ajuste (ANOVA) 41
AI REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Sendo a Regressão linear uma reta média pode-se calcular a incerteza dos seus coeficientes angulares e lineares As incertezas desses coeficientes podem ser usadas para avaliar a própria regressão bem como outros parâmetros Avaliação do efeito matriz no desenvolvimento de um método analítico * (comparação dos coef. angulares, a ): 0.020 0.018 Curva de adição de padrão Curva analítica em meio ácido a a 0.016 0.014 0.012 0.010 ( y= ax + b ) meio alcalino meio ácido 1,60 10-3 ± 0,05 10-3 1,78 10-3 ± 0,03 10-3 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000-0.002 0 2 4 6 8 10 Concentração de Pb (ug/l) Comparação para um nível de 95% de confiança para saber se a calibração poderia ser feita em meio ácido! (*) R.A.de Sousa et al. / Talanta 104 (2013) 90 96 42
REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Cálculo das incertezas de a e b : S a = S y/x S [ Σ(x i x ) 2 ] 1/2 b = S y/x [ Σx 2 i / nσ(x i - x ) 2 ] 1/2 S y/x = [ Σ(y i y ^ ) 2 / (n-2) ] 1/2 Obtido usando a própria equação de regressão Uma observação cuidadosa dos valores de y i - y mostram que o erro da regressão é menor nas vizinhanças do centro da curva de calibração! ^ 43
REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Representam a DETECTABILIDADE DO MÉTODO LEMBRAR : LOD instrumental é diferente do LOD método Exemplo Para quantificar 0,02 mg.kg -1 Pb em uma amostra de peixe por GF AAS o LOQ deve ser consideravelmente menor que 0,02 mg.kg -1 Pb Análise elementar = Amostra é digerida Na solução final a amostra fica diluída (10x p. ex) C Pb sol. amostra = 0,02 mg kg -1 / 10 = 0,002 mg kg -1 LOQ instrumental 0,002 mg.kg -1 Pb e não 0,02 mg kg -1 44
REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Limite de detecção: Definições É a menor concentração ou massa de analito que pode ser detectado com uma certa confiança Depende da magnitude do sinal analítico em relação à flutuação do branco: 3 S branco LOD= m m= inclinação curva analítica 45
REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO CONSIDERAÇÃO: CÁLCULO do LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) LOD concentração correspondente ao Menor sinal detectável Menor sinal detectável = Sinal branco + 3 S branco Para que se tenha 99% de confiança SE Curva analítica: (1) Y= m X + b b= Sinal branco Na concentração limite Y = Menor sinal detectável (2) X = LOD Substituindo (2) em (1): Sinal branco + 3 S branco = m LOD + Sinal branco 3 S branco = LOD m 46
REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO O LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) No nível do LOD a medida é significativamente afetada pelo ruído instrumental (baixa precisão) As medidas quantitativas devem ser feitas num nível superior ao LOD, geralmente: LOQ= 10 S branco m PODE ser determinado experimentalmente (em função da precisão) ou considerado igual ao primeiro ponto da curva analítica 47
Sabemos calcular (estimar)? Dúvidas? Comentários? OBS: Existem outras formas de calcular os valores de LOD e LOQ, dependendo da técnica e objetivo do método/análise 48
Outros Usos da Estatística no Laboratório... Métodos quimiométricos para planejamento e otimização de experimentos, análise multivariada de dados e calibração multivariada A quimiometria pode ser definida como sendo a aplicação de métodos matemáticos e estatísticos no planejamento ou na otimização de procedimentos e na obtenção de informações químicas através da análise de resultados relevantes 49
Recomendação Literatura básica para estudos iniciais Bruns, RE; Faigle, FG. Quimiometria, Quím. Nova, 8 (1985) 84 Gemperline, PJ. Practical Guide to Chemometrics (2nd Ed), CRC Press Taylor and Francis, New York (2006) 50
Alguns exemplos: 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Conhecer como os diferentes parâmetros experimentais afetam o resultado do experimento (ou análise). Seleção das condições instrumentais para determinar Se por GF AAS em adoçantes dietéticos Tpyr Tat tpyr Mod 51
Mg II / Mg I 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Estabelecer condições experimentais (instrumentais) otimizadas Sousa, RA; Silva, JCJ; Teófilo, RF; Cadore, S.; Baccan, N. Study of Instrumental Parameters for the Analysis of Milk by ICP OES Employing Factorial Design, Brazilian Meeting on Chemistry of Food and Beverages, 2004. Seleção das condições instrumentais para análise de leite por ICP OES 16-1,2-0,72 N -0,24 0,24 0,72 0-1,2-0,96-0,72-0,48-0,24 0 2 4 6 8 12 10 14 y= 6.74 + 1.89 P 4.34 N 0.59 A 0.69 PN 0.34 PA + 0.34 NA 1,2 1,2 0,96 0,72 0,48 0,24 P 52
2- Análise multivariada de resultados Um exemplo na área de Química analítica: Dados experimentais obtidos para as diferentes amostras: ACP ACN Ca (mg L -1 ) 178-232 107 237 Mg 87-129 50 88 Mn 1,8 2,8 1,0 4,8 Fe 0,08 0,18 0,04 0,18 Zn 0,20 0,36 não detectado Cu 0,09 0,19 não detectado 53
2- Análise multivariada de resultados Considerando as variações para cada parâmetro (analito), busca-se as possíveis similaridades entre as amostras UTILIZAR: Recursos para Análise exploratória, como PCA Gráfico de scores: Amostras num espaço multidimensional PCA: Análise de Componentes Principais 54
Na PCA realizada compara-se o Gráfico de scores com o de loadings para se entender as separações encontradas Verificação de correlações entre dados 55
3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos, fluidos biológicos,... - Utiliza-se um único método analítico para detectar e quantificar vários parâmetros em uma mesma análise 56
3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos TABLE I: Correlation Coefficient Values for Both Calibration and Validation Models Obtained via PLSR 1 for All Inorganic Elements Element Correlation Coefficient Correlation Coefficient Element Calibration Validation Calibration Validation Ca 0.99992 0.84705 K 0.99751 0.99558 P 0.98802 0.96488 Mg 0.96973 0.90379 Na 0.99367 0.98957 Cl 0.99982 0.99275 57
3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos TABLE II: Correlation Coefficient Values for Calibration and Validation Models Obtained via PLSR 1 for the Organic Compounds Correlation Coefficient Compounds Calibration Validation Glucose 0.99165 0.94337 Urea 0.99925 0.95103 Creatinine 0.99093 0.96018 58
Outros exemplos importantes podem ser encontrados na literatura Trata-se de um área em constante desenvolvimento OBS: Várias ferramentas além destas exemplificadas podem ser usadas com finalidades analíticas (desenvolvimento do método, avaliação de resultados e na própria calibração) Estudem quimiometria!! 59
BIBLIOGRAFIA 1) D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Stanley R. Crouch Fundamentos de Química Analítica, 8 a Ed., CENGAGE Learning, 2009 2) J. Mendham, R. C. Denney, J. D. Barnes, M. Thomas Vogel - Análise Química Quantitativa, 6 a ed., LTC, 2002 3) D. C. Harris, Análise Química Quantitativa, 7 a ed., LTC, 2008 4) B. B. Neto, I. E. Scarminio, R. E. Bruns, Como Fazer Experimentos, Editora da Unicamp, 2001 5) J. N. Miller, J. C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th Ed, Pearson Education Limited, 2005 60