INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

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1 INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE DE FÁRMACOS MÓDULO 05 Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas UnUCET Anápolis 1

2 2 MÓDULO 05 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

3 Panorama Da Química Analítica 3 Até os anos 70: Pouca Instrumentação analítica Métodos quantitativos predominantemente baseados em via-úmida (reações químicas) Resultados Univariados Atualmente: Desenvolvimento da microelêtronica e da informática Vasta disponibilidade de Instrumentação para análise Resultados Multivariados

4 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA 4 Utiliza muitas variáveis para quantificar alguma(s) propriedade(s) de interesse. Seu uso só é justificado quando não existe uma única variável seletiva, que permita a calibração univariada. Torna possível a determinação de espécies sem resolução de sinal analítico (o sinal analítico não precisa ser proveniente apenas da espécie que se deseja determinar).

5 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA 5 Torna possível a estratégia analítica de substituir a separação física das espécies pela separação quimiométrica de seus sinais analíticos. Cada amostra é representada por um vetor de dados. Exemplos: - Espectros (UV/Vis, IV médio ou próximo, Raman, fluorescência molecular) - Cromatogramas - Voltamogramas - Arranjos de sensores

6 VANTAGENS 6 Maior número de variáveis, diminuindo erros Determinações na presença de interferentes (conhecidos) que são incluídos no modelo Determinações mesmo sem resolução do sinal Determinações simultâneas diretas

7 7 Quando existe um sinal seletivo, a situação é ideal para a calibração Univariada Amostra Instrumento

8 8 Na prática, muitas vezes a medida instrumental não é seletiva para o analito, e/ou a resposta instrumental não é linear Amostra Instrumento

9 9 Alternativas para a falta de seletividade do sinal analítico 1 Interferentes removidos e faixa linear utilizada Amostra Instrumento 2 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA Amostra Modelo Matemático Instrumento

10 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 10 Método de Calibração Direta Classical Least Squares ou Ordinary Least Squares (OLS) Assume que as medidas são somas ponderadas de sinais linearmente independentes Similar ao Método da Matriz K

11 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 11 Modelo do tipo : A = KC + E (ex: Lei de Beer: A=εbc) Espectro de uma mistura de n espécies obtido em p diferentes comprimentos de onda: A 1 = k 11 c 1 + k 12 c 2 + k 13 c k n1 c n A 2 = k 21 c 1 + k 22 c 2 + k 23 c k n2 c n A p = k 1p c 1 + k 2p c 2 + k 3p c k np c n

12 12 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) Exemplo Análise de uma solução contendo 3 componentes usando espectrofotometria no UV/VIS Absorbancia comprimento de onda (nm)

13 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 13-7 amostras de calibração (7 espectros das misturas padrão). - Os espectros são adquiridos a 30 diferentes comprimentos de onda ( sensores ) digitalizados e coletados em uma matriz A de 7x Espectros Calibração Absorbancia A comprimento de onda (nm) concentrações conhecidas dos constituintes químicos armazenadas na matriz C de 7x3 7 C 3 7

14 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 14 Equação Matricial A = K C A e C são conhecidos (fase de calibração) Espectros Puros

15 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 15 Solução Mínimos Quadrados K = (C T C) -1 C T A

16 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 16 Fase de Previsão Amostra desconhecida com espectro a teste : a teste = K T c + e Solução dos mínimos quadrados : c = (KK T ) -1 K T a teste

17 Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) 17 Vantagens do CLS: Obtém os espectros puros Se baseia numa lei físico-química Desvantagens: Necessário conhecer a concentração de todas as espécies espectroscopicamente ativas no conjunto de calibração Não tolera a presença de interferentes Como o conhecimento de todas as espécies é muito difícil, raramente é usada em problemas práticos

18 18 Mínimos Quadrados Inversos (ILS) Modelo linear genérico: y = BX y = b 0 + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x b n x n Coeficientes de Correlação Variáveis espectrais Os coeficientes b 0, b 1, b 2, b 3,..., b n são parâmetros a serem determinados na fase de calibração. A maneira para determinar esses parâmetros é que distingue os diferentes métodos de calibração: - Regressão Linear Múltipla (RLM) - Regressão de Componentes Principais (PCR) - Mínimos Quadrados Parciais (PLS)

19 Regressão Linear Múltipla M (RLM) 19 Modelo empírico para correlacionar a concentração com a resposta instrumental. Modelo mais simples que os demais: y = b 0 + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x e Mínimos Quadrados: e = y - Xb deve ter os menores possíveis Solução : b = (X T X) -1 X T y

20 Regressão Linear Múltipla M (RLM) 20 Limitações P/ calcular b, a matriz X T X só pode ser inversível (não singular) se: Existirem mais amostras que variáveis (mais linhas que colunas) Não houver colinearidade na matriz X T X Portanto, é necessário um número de misturas de calibração pelo menos igual ao número de variáveis espectrais (se for utilizado o espectro inteiro, serão necessárias muitas amostras para a construção do modelo)

21 21 Regressão Linear Múltipla M (RLM) Limitações É o melhor método para sistemas bem comportados: respostas lineares, sem interferentes, sem interações entre analitos, com baixo ruído e nenhuma colinearidade A principal limitação está no fato de a RLM usar toda a informação contida na matriz X para construir o modelo, não importando se é relevante ou não Com isso, quantidade significativa de informação (variância) irrelevante é incorporada, tornando o modelo pouco robusto Aplicação restrita à sistemas simples

22 Regressão Linear Múltipla M (RLM) 22 Como superar as limitações da RLM? Alternativas: 1) Prévia Seleção de variáveis: Usa-se algum método (ex: algoritmo genético) ou conhecimento do sistema para selecionar um pequeno número de variáveis não correlacionadas 2) Métodos para redução da dimensionalidade dos dados: PCR PLS

23 23 Regressão em Componentes Principais (PCR) Principal Component Regression Combina a PCA com a RLM A dimensionalidade dos dados é reduzida e a colinearidade é filtrada através da PCA A regressão, ao invés de ser feita nas variáveis originais, é feita nos escores (T) obtidos em uma PCA: 1 o passo : decomposição via PCA: T = XP 2 o passo: relação entre T e y via RLM: y = BT + E solução: B = (T T T) -1 T T y

24 Regressão em Componentes 24 Principais (PCR) As variáveis em X são substituídas pelos escores em T, que são ortogonais e em menor número A PCR elimina a colinearidade dos dados e possibilita a etapa de inversão da matriz A escolha correta do número de CP s fundamental A informação irrelevante (aleatória) deve ser descartada nas CP s não utilizadas Quando todas as CP s são usadas no modelo, a PCR se torna idêntica à RLM é

25 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA 25 Todas as substâncias espectroscopicamente ativas são conhecidas? (ausência completa de interferentes) Sim Não CLS Fornece os espectros puros de todos os componentes (pouco robusto) O n o de variáveis é pequeno? (e elas não são correlacionadas?) Sim Não Adaptado de Ferreira et al., Quim. Nova 22:724 (1999) RLM/ILS Não são necessários os espectros puros PCR PLS