AVALIAÇÃO DA AÇÃO CICATRIZANTE E ANTIEDEMATOGÊNICA DO EXTRATO ALCOOLICO DE ERVA-MATE (Ilex paraguariensis) EM LESÕES DE CAMUNDONGOS. Carolina Teles Ramos 1, Fabíola Piedade Tanyeri¹, Luciana Cristina Nowacki². 1 Acadêmico do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2. Bióloga, Prof Ms da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); Endereço para correspondência: Carolina Teles Ramos, carol.sistemas@gmail.com RESUMO: A erva-mate (Ilex paraguariensis) tem sido utilizada em inúmeras aplicações devido à composição química de suas folhas. O presente estudo objetivou analisar a eficácia da mesma no processo de cicatrização e inflamação, comparando a contração de feridas cutâneas e diminuição de edemas de orelha em camundongos sob tratamentos distintos. Foram considerados para o teste de cicatrização três grupos, sendo respectivamente tratados com creme de erva-mate, creme base e creme comercial Neotricin. As aplicações foram realizadas duas vezes ao dia e as contrações das feridas avaliadas diariamente com auxílio de um paquímetro. Os resultados evidenciaram que o grupo tratado com creme de erva-mate obteve maior contração das lesões em certas fases da cicatrização, comparado aos demais. No teste antiedematogênico, foram considerados 4 grupos, sendo respectivamente tratados com creme base, creme de erva-mate, dexametasona e um grupo controle sem tratamento. A inflamação foi induzida com óleo de cróton e os edemas foram mensurados nos tempos de 6h e 24h, com auxílio de um micrômetro digital. Os resultados evidenciaram ação antiedematogênica da erva-mate nas primeiras fases da inflamação. Diante disso, tem-se que o creme de ervamate foi auxiliar para um reparo mais rápido as lesões induzidas. Palavras-chave: Erva-mate, Ilex paraguariensis, cicatrização, inflamação. ABSTRACT: The mate (Ilex paraguariensis) has been used in many applications because of the chemical composition of their leaves. This study aimed to analyze the effectiveness of it in the process of healing and inflammation, comparing the contraction of skin wounds and reduction of the ear edema in mice under different treatments. Were considered for the test of healing three groups, respectively treated with cream mate, cream and cream commercial basis "Neotricin." The applications were made twice daily and the contractions of the wounds daily evaluated with the help of a caliper. The results showed that the group treated with cream mate was greater contraction of injuries at certain stages of healing, compared to the others. In the test anti-edematogenic, were 4 groups, respectively treated with basic cream, cream of mate, dexamethasone and a control group without treatment. The inflammation was induced with oil from Crotone and edema were measured in times of 6h and 24h, with the aid of a digital micrometer. The results showed the action antiedematogênica mate in the early stages of inflammation. Thus, there is the cream of mate was helping to repair a faster induced lesions. Palavras-chave: Erva-mate, Ilex paraguariensis, cicatrização, inflamação.
1.0 INTRODUÇÃO Crescem no caminhar dos anos estudos de fitoterápicos para a comprovação da eficácia de inúmeras plantas que são utilizadas sem nenhuma evidência científica. Estuda-se no presente trabalho a erva-mate (Ilex paraguariensis), buscando evidenciar a ação da mesma na cicatrização de lesões e no processo inflamatório de edemas. Em várias aplicações emprega-se a erva-mate, decorrente da composição química de suas folhas, podendo ser consumida na forma de chimarrão e de chá. Na região Sul os tropeiros fazem uso do chimarrão na lavagem de feridas de bois para melhorar as feridas. Sendo também usada sob a forma de cataplasma, no tratamento caseiro de feridas e úlceras. 7 As investigações químicas relativas a erva-mate iniciaram-se em 1836 16. A cafeína, teofilina e teobromina são três alcalóides encontrados na erva-mate e são os compostos mais interessantes sob o ponto de vista terapêutico 12,13. Com vitaminas do complexo B, o mate participa do aproveitamento do açúcar nos músculos, nervos e atividade cerebral do homem; vitaminas C e E agem como defesa orgânica e são benéficas para os tecidos do organismo; sais minerais, juntamente com a cafeína, ajudam o trabalho cardíaco e a circulação do sangue, diminuindo a tensão arterial, dado que a cafeína atua como vasodilatador 16. Qualquer tipo de agressão à pele leva inicialmente a uma perturbação do equilíbrio entre as células do tecido normal, caracterizada por diversos eventos celulares e humorais que se iniciam com a coagulação e compreendem a inflamação, a proliferação de fibroblastos e o remodelamento, visando o reparo tecidual e a reposição de colágeno. 1 A inflamação se traduz por migração celular intensificada através das vênulas e extravasamento de moléculas séricas, anticorpos, complemento e proteínas pelos capilares. 1 O sangue e o exsudado, logo após a lesão, desidratam-se e solidificam-se, formando uma crosta, que age protegendo a invasão de microorganismos e traumas. 15 A partir dos mediadores celulares originam-se fibroblastos, macrófagos, neutrófilos, plaquetas, células endoteliais e mastócitos. Os mastócitos e as plaquetas são importantes fontes de histamina e serotonina, substâncias que causam vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular 11. Os macrófagos ativados secretam interleucinas, fator de necrose tumoral alfa, fator de crescimento de fibroblastos e de plaquetas, entre outros. 2,8 No período inicial do processo inflamatório, os neutrófilos e macrófagos retiram as bactérias, material estranho e
fragmentos celulares da ferida, desempenhando um papel crítico para o início da reparação tecidual. 2 A pele se renova através do crescimento dos fibroblastos, células do tecido conjuntivo, mediante a secreção de colagenase e do fator ativador do plasminogênio, resultando na parte da neovascularização que ocorre na ferida. A neovascularização é essencial, porque permite a troca de gases e a nutrição das células metabolicamente ativas 1,5. O colágeno é de grande importância no processo de reparação tecidual, resultando em um significante ganho na resistência da ferida 9. A colagenase, uma enzima produzida pelos fibroblastos é que destrói o colágeno e impede o crescimento excessivo do tecido de granulação, por esse motivo há um equilíbrio entre a produção e a remoção do colágeno 11. A função de contrair a ferida é atribuída aos miofibroblastos. Quando a ferida se fecha, o número de células dos vasos sangüíneos e de miofibroblastos diminuem. Isto se deve ao fenômeno denominado apoptose, pelo qual o tecido de granulação evolui para a cicatriz. 14 Assim minimizam a perda de líquidos, de proteínas, diminuem o processo doloroso, a contração da ferida, as cicatrizes e os quelóides, favorecendo dessa forma o processo de cicatrização. 2.0 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Animais Para o presente estudo experimental foram utilizados 54 camundongos, machos (25-35g), Mus muscullus da linhagem Swiss albino, provenientes do CPPI/Piraquara/Paraná. Os animais foram mantidos, durante todo o experimento, em caixas de polipropileno e em condições de temperatura controlada (22±2 C), respeitando uma fase clara/escura de 12 horas e com água e ração ad libitum. 2.2 Obtenção do extrato de erva-mate Em um béquer pesou-se 10g de erva-mate em pó, tostado solúvel (Leão Junior S/A.) e adicionou-se 190ml de álcool etílico P.A. A mistura foi agitada manualmente por uns instantes e mantida em repouso por sete dias. Decorrido o tempo estimado de repouso a solução foi filtrada, obtendo-se 114ml de extrato alcoólico de erva-mate a uma concentração de 5%. 2.3 Formulação do creme A formulação do creme é realizada por uma fase aquosa, composta por 74ml de água, 1g natrosol e 5g de propilenoglicol; e uma fase oleosa contendo 15g de cera Lanette e 5g de óleo mineral.
As emulsões foram preparadas ao mesmo tempo, mas separadamente a fase O (oleosa) da fase A (aquosa), sob aquecimento e agitação constante. Após as duas atingirem a temperatura de 70ºC a fase A foi vertida sobre a fase O e manteve-se em agitação até obter um resfriamento parcial da emulsão. Sem parar a agitação foi adicionado aos poucos 57ml do extrato alcoólico de erva-mate. Finalizadas essas etapas obteve-se um creme de erva-mate na concentração 30mg/g, e reservado sob refrigeração. Foi efetuado o mesmo processo para a elaboração do creme base do grupo controle I, entretanto a este não foi adicionado o extrato da erva-mate. O terceiro creme de controle foi obtido de forma comercial, sendo ele o Neotricin (Legrand - EMS) 2.4 Análise Estatística Os dados foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste Tukey. Foram considerados como indicativos de significância p<0,05 e p<0,01. Os cálculos foram realizados utilizando o Software estatístico GraphPad Prism version 3.00, San Diego Califórnia, EUA. 2.5 Procedimento Experimental 2.51 Experimento I Lesão tissular Os animais foram divididos em grupos de 10 sendo: Grupo I tratado com creme de erva-mate, Grupo controle II tratado com creme base e Grupo controle III tratado com a pomada comercial Neotricin (principio ativo: dexametasona e neomicina). 2.51.1 Confecção das feridas O procedimento cirúrgico foi realizado após anestesia inalatória com éter etílico em campânula fechada. Os camundongos foram posicionados em decúbito ventral e com contenção dos membros por barbantes. A tricotomia foi realizada com auxílio de tesoura manual e lâmina descartável. Para a demarcação da ferida a ser realizada utilizou-se um paquímetro e caneta hidrográfica. Com auxílio de tesoura íris e pinça, foram efetuadas as feridas de maneira a retirar a pele e tecido subcutâneo sem atingir o tecido muscular. (Fig.1) Figura 1. Desenho esquemático mostrando o local da lesão na região dorsal do tórax do camundongo (Mus muscullus). 2.51.2 Pós operatório Deu-se início imediato à aplicação dos cremes de tratamento, essas foram mantidas duas vezes ao dia, durante os 18 dias do estudo. As aplicações foram
efetuadas com auxilio de espátulas de madeira, individuais para cada um e nenhum tipo de bandagem sob as lesões foi inclusa durante todo o experimento. 2.51.3 Avaliação das feridas A mensuração das feridas iniciouse no quarto dia de pós-operatório sendo efetuada com auxílio de um paquímetro, sempre considerando para as anotações o raio de maior e menor extensão das lesões. Com base nesses dados numéricos obtevese a das lesões considerando a equação matemática: A =. R. r Onde: A = ; = 3,14; R = raio maior; r = raio menor. Mediante o cálculo da das lesões foi feita avaliação do percentual de contração das feridas através da equação matemática: % da contração = 100. [(Wo Wi)/ Wo] Onde: Wo = inicial da ferida Wi = do dia da ferida 2.52 Experimento II Indução de Edema Os animais foram divididos em 4 grupos com n = 5 e 6, sendo: Grupo I tratado com 20µL de salina (0,9 %), Grupo II com 20µL de dexametasona (0,5mg /20 µl), Grupo III tratado com aproximadamente 0,1g de creme base, Grupo IV tratado com aproximadamente 0,1g de creme de erva-mate (30mg/g), 2.52.1 Indução do edema Foi induzido edema na orelha direita de cada animal através da aplicação tópica de 0,4 mg de óleo de cróton diluído em 20 µl de acetona. Logo após foram aplicados os agentes de tratamento. 2.52.2 Avaliação do edema O edema de orelha foi mensurado pelo aumento da espessura da orelha dos camundongos (µm). A medida foi feita com o auxílio de um micrômetro digital (Mitutoyo - Coolant Proof- IP 65), antes e após 6 e 24 horas da aplicação do óleo de cróton. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Experimento I cicatrização. As lesões dos camundongos foram avaliadas macroscopicamente, do ponto de vista clínico, durante os dezoito dias do experimento. No primeiro período de observação, 48h de pós-operatório, constatou-se a formação de crostas em todos os grupos, diferenciadas pelo aspecto. O grupo tratado com o creme de erva-mate (GM) e o grupo tratado com creme base (GCI) apresentaram crostas mais espessas e irregulares quando comparadas ao grupo tratado com
Neotricin (GCII). A formação dessas ocorreu no momento em que a lesão passou a ser preenchida por coágulos, fibrinas e exsudato. Estudos histológicos e clínicos consideram a formação de uma crosta um sinal positivo no reparo tecidual, pois indica uma maior formação de vasos sanguíneos, infiltrados inflamatórios e fibras colágenas. 18,19 No 4º já é evidente que o creme de erva-mate demonstrou maior atuação devido apresentar uma redução de 38%, quando comparado aos grupos controles que não ultrapassaram 22% de redução da lesão. Observou-se o desprendimento das crostas do GM e GCI no 7º dia, já para o GCII no 10º dia. No processo de reparação tecidual, normalmente, ocorre o desprendimento da crosta quando a cobertura epitelial está completa, entretanto no caso dos presentes grupos o desprendimento pode ser atribuído a algum fator desconhecido, já que não houve reepitelização completa do local lesionado 18,19. Essas emulsões de tratamento do GM e GCI são desidratantes, pois possuem água que se evapora e com ela a água existente na superfície da pele, baixando a temperatura local, deduz-se assim que tem ação antiflogistica. 3,10 Pode se considerar que o tecido de granulação observado após o desprendimento foi mais favorável no GM e no GCI. Em lesões o tecido de granulação favorece a migração epitelial sobre si e ao se contrair, retrai as bordas da ferida possibilitando uma menor de reepitelização. 20 Logo tem se que a presença de erva-mate desencadeou maior resposta na fase proliferativa quando comparada aos demais grupos. Em relação às médias das s lesionadas, dispostas na figura 3, a análise de variância demonstrou efeito significativo ao grupo tratado com creme de erva-mate do 4º ao 11º em relação aos grupos controles. Durante a fase proliferativa do processo cicatricial o GM teve uma maior redução da lesionada do que os outros grupos, considerando uma redução entre 50-90% do 6º ao 10º dia de pós-operatório, enquanto nessa mesma faixa de dias o GCI 29-77% e o GCII 27-70%. (Fig. 2) Durante está fase o surgimento do tecido de granulação, reepitelização e contração da ferida, os quais desempenham papéis importantes na cicatrização normal 24. Evidenciaram-se respostas menos intensas nos grupos controles, que somente depois do 8º dia de pós-operatório obtiveram uma redução da lesionada maior que 50%. Entretanto a reparação tecidual igualou-se entre os grupos a partir do 15º dia de pós-operatório, onde a média percentual entre os grupos já se encontrava maior que 90%.
Deduz-se que a presença da ervamate desempenhou papel importante no estímulo do tecido de granulação e acarretou ao grupo de tratamento maior resposta proliferativa, fribloplásica e angiogênica (neovascularização). Os macrófagos e leucócitos são de extrema importância no processo cicatricial por atuarem fagocitando as bactérias e debidrando corpos estranhos que podem afetar a cicatrização. No presente estudo acredita-se que a ação antimicrobiana é decorrente das propriedades presentes no creme de ervamate 21. Estudos permitem sugerir que o extrato hidroalcoólico de erva-mate constitui uma perspectiva para a obtenção de antibiótico natural por apresentar uma evidente atividade antimicrobiana 21. Os metabólicos secundários da erva-mate, como cafeína, triterpenos, derivados do ácido clorogênico e entre outros, apresentam atividade antimicrobiana tanto para bactérias gram positivas como gram negativas. 25 Pode ser considerado também um favorecimento ao processo de cicatrização à emulsão elaborada para o creme de tratamento do GM e GCI, uma vez que essas emulsões proporcionam uma atividade terapêutica mais intensa, por tempo prolongado, sendo um veículo mais eficiente ocasionando maior permeabilidade cutânea e penetração da substância adicionada ao mesmo àrea 4 º D ia 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 4.0 3.5 3.0 2.5 3.5 3.0 2.5 2.a 3.5 3.0 2.5 2.b 2.c 2.d 2.5 2.e 2.f 3,10. 6 º D ia 7 º D ia 8 º D ia 9 º D ia 1 0 º D ia Figura. 2 Área da lesão (cm2) e tempo 2.a 4º, 2.b 6º, 2.c 7º, 2.d 8º, 2e 9º e 2.f 10º dias de pós-operatório sob o tratamento tópico de creme base, creme de
erva-mate e neotricin. As barras representam à média ± E.P.M., submetidos à análise de variância (ANOVA) e pós teste de Tukey, onde n = 7-9 e p<5 e p<0,001 representam o nível de significância em relação ao controle (Creme base). 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Creme base Creme de erva-mate Neotricin 3º 0 4º 1 2 3 6º 4 7º 5 8º 6 9º 7 10º 8 9 11º 10 13º 11 14º 12 15º 13 16º 14 17º 15 18º 16 Dias pós-cirurgia Figura 3. Área da lesão (cm2) e tempo (dias) após o tratamento tópico utilizando creme base, creme de erva-mate e neotricin. Cada ponto representa à média ± E.P.M., submetidos à análise de variância (ANOVA) e pós teste de Tukey, onde n=7-9, os asteriscos denotam os níveis de significado quando comparado com os valores do controle (creme base): p<0,05. 3.2 Experimento II Indução de Edema. Conforme demonstrado na figura 4.a e 4.b, que descreve os resultados observados após 6h e 24h da aplicação do óleo de cróton respectivamente, ao comparar os agentes testados com o grupo controle (salina) verifica-se que no tempo de 6h o creme de erva-mate apresentou a melhor redução da espessura na orelha dos camundongos, sendo esta de 71 %. O controle positivo, dexametasona, apresentou redução de 61 % e o grupo tratado com creme base não apresentou redução significativa. Já no tempo de 24h, constata-se que a dexametasona apresentou a melhor redução de edema, sendo esta de 92 %, enquanto o creme de erva-mate reduziu em 49 % o edema. Nesse tempo o creme base também apresentou redução insignificante. A indução de inflamação pelo óleo de cróton (Croton tiglium L.), o qual possui um éster de forbol, o 12-O tetradecanoilforbol acetato, é um potente agente flogístico capaz de promover uma resposta inflamatória bastante intensa 4. Observa-se que a erva-mate apresentou atividade antiedematogênica somente nas primeiras horas da indução de inflamação aguda pelo óleo de cróton, supondo-se que a mesma pode atuar na inibição de substâncias vasodilatadoras, como as aminas vasoativas (histamina e serotonina) e prostaglandinas. Sugere-se também que ela pode atuar na inibição de citocinas e leucotrienos. As aminas vasoativas atuam sobre a parede vascular, não exercendo quimiotaxia sobre os leucócitos, como alguns mediadores de ação prolongada. A histamina é sintetizada nos basófilos, plaquetas e mastócitos, que a liberam quando agredidos. A serotonina, encontrada nas plaquetas, mucosa intestina e SNC. Ambas provocam contração das células endoteliais venulares com conseqüente aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação. A histamina em especial tem destacada participação no mecanismo de formação do edema inflamatório 6.
Os leucotrienos são sintetizados predominantemente em células de origem mielóide através do metabolismo do ácido araquidônico. Este mediador tem a capacidade quimiotática para neutrófilos, estimulando várias funções de leucócitos, incluindo aderência, fagocitose, secreção de espécies reativas de oxigênio e liberação de enzimas lisosomais. 26 As citocinas são mediadores e reguladores da imunidade, produzidas pelos macrófagos estimulando ou inibindo as reaçoes inflamatórias. As citocinas quimiotáticas, as quimiocinas, atraem leucócitos aos locais de infecção, induzindo a adesão rápida e quimiotaxia dos mesmos. São produzidas por quase todos os tipos celulares em resposta a sinais pró-inflamatórios. 26 A dexametasona é um glicocorticóide com grande potencial antiinflamatório e imunossupressor uma vez que seu efeito leva a inibição da produção de várias citocinas 22. Pode-se destacar seu profundo efeito sobre a concentração, a distribuição e a função dos leucócitos periféricos, bem como de seus efeitos supressores sobre a produção de citocinas e de outros mediadores lipídicos e glicolipídicos da inflamação, como as prostaglandinas 23. Essas são mediadoras de presentes na fase tardia da inflamação o que justifica o resultado observado no tempo de 24h, no qual houve melhor eficácia da dexamentasona em relação ao creme de erva-mate. Figura 4: Avaliação da atividade antiedematogênica de diferentes agentes a base de erva mate após 6h (4.a) e 24h (4.b) da indução de edema por óleo de cróton em orelha de camundongo. Os edemas foram induzidos pela aplicação tópica de óleo de cróton na orelha direita de cada animal. Os animais foram tratados com dexametasona, creme de erva mate, salina e creme base. Após 6h e 24h a espessura da orelha foi medida com o auxílio de um micrômetro avaliando o aumento da espessura da orelha em micrômetros (m). Os resultados estão representados em média ±E.P.M., n = 5-6. O teste estatístico realizado foi ANOVA seguido do pós teste Tukey p<0,05 CONCLUSÃO A ação cicatrizante e antiedematogênica da erva-mate, na forma de extrato alcoólico, testada em emulsão para uso tópico na concentração 30mg/g, foi comprovada em momentos específicos do processo inflamatório e cicatrizante.
AGRADECIMENTOS Agradecemos a colaboração da Dr.ª Neila de Paula Pereira e Ms Claudia Consuelo do Carmo Ota, professoras da UTP. E ao aluno de pós-graduação da UFPR Eduardo Cunha. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. CARVALHO, P.T.C. Análise da cicatrização de lesões cutâneas através da espectrofotometria: estudo experimental em ratos diabéticos. Dissertação 31(Mestrado) - Área interunidades em Bioengenharia da EESC/FMRP/IQSC - USP, 2002. 2. CRUVINEL, S.S. Efeitos da sulfadiazina de prata em feridas cirúrgicas experimentalmente induzidas em camundongos isogênicos: aspectos morfológicos, imunológicos e hematológicos. Dissertação (mestrado) - UFU, Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas. Uberlândia, 2000. 3. FONSECA, A. Manual de terapêutica dermatológica e cosmetologia. Ed. ROCA, cp 1, SP, 1993. 4. GÀBOR, M. Mouse Ear Inflammation Models and their Pharmacological Applications. Budapeste: Akadémiai Kiadó, 2000. 5. GONZÁLEZ, R.P.; LEYVA, A.; MELO, R.A.B.; MOREIRA, R.D.M.; PESSOA, C.; FARIAS, R.F.; MORAES, M.O. Método para estudo em vivo da angiogênese: indução de neovascularização em córnea de coelho. Acta Cirúrgica Brasileira, v.15, n.3, p168-173, 2000. 6. GUIDUGLI-NETO, J. Elementos de Patologia Geral. São Paulo : Santos, 1997. 7. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. São Paulo: Instituto Plantarum de Estudos da Flora LTDA, 512p, 2002. 8. LUSTER, A.D. Chemokines chemotactic cytokines that mediate inflammation. The New England Journal of Medicine, v.338, n.7, p.436-444, 1998. 9. MANDELBAUM, S. H.;SANTIS DI, E. P.; MANDELBAUM, M. H. S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares. An bras Dermatol, Rio de Janeiro, jul./ago. 2003. 10. MAIO, M. Tratado de medicina estética. v.1, cp 20. Ed ROCA, SP, 2004. 11. MARTIN, P. Wound healing aiming for perfect skin regeneration. Science, v.276, p.75-81, 1997. 12. MAZUCHOWSKI, J.Z.; RUCKER, N.G.de A. Erva-mate Prospecção Tecnológica da Cadeia Produtiva. Documento Executivo. Curitiba: Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento do Paraná. Departamento de Economia Rural, p. 130, 1996; p. 27, 1997.
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