Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN-5799 Seminários em Genética e Melhoramento de Plantas Paula Fabiane Martins Orientador: Ricardo Antunes de Azevedo Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 -Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 -Piracicaba -São Paulo -Brasil Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Introdução Variabilidade e Adaptação - Origem da variabilidade enzimática - Teorias para evolução de vias - Diversidade funcional Exemplo: Glutamina Sintetase Considerações Finais
Estresse pode ser definido como qualquer modificação nos parâmetros ambientais que leve um organismo a responder à alteração. Estresse Seleção Adaptação Thammavongs, et al. Microbes Environ, 2008
Variabilidade enzimática: uma das forças da evolução Variabilidade de enzimas pode fornecer ao metabolismo a oportunidade de explorar novas funções e proporcionar novas ferramentas para vias adaptativas Variabilidade enzimática e diversidade funcional
Como uma enzima pode ser estruturada? Coenzima (molécula orgânica complexa) enzima Sítio ativo Substrato Cofator (componente químico adicional, ex.: íons metálicos)
Enzimas são específicas e catalisam reações individuais com velocidade e eficiência Para adaptação e evolução é necessário: A) novos substratos sejam reconhecidos B) novas atividades enzimáticas sejam envolvidas De onde se origina a flexibilidade e a plasticidade de vias metabólicas e novas atividades enzimáticas?
Variabilidade enzimática a) Química da reação Diferentes reações resultando em diferentes produtos b) Opção do metabólito Reação com diferentes substratos Schimdt, et al. TRENDS in Biochem Scien. Vol 28, 2003
A variabilidade enzimática pode estar envolvida com diferentes funções, porém como as vias são organizadas para novas respostas? a) Invenção de novo Novas vias podem ter envolvimento espontâneo de enzimas já existentes. Adaptado de Schmidt, et al. Trends in Biochemical Science, 2003
b) Retroevolução Vias inicialmente independentes, convergem pela necessidade de formação de produtos finais c) Especialização de enzimas multifuncionais Enzimas multifuncionais podem sofrer duplicação, resultando em diversificação de função e aumento da eficiência da reação. Adaptado de Schmidt, et al. Trends in Biochemical Science, 2003
d) Duplicação de vias A duplicação de vias pode acarretar histórias evolutivas independentes, e conseqüentemente diferenças nas vias. e) Recrutamento de enzimas Considerado a principal força na evolução de vias para originar respostas novas às variações ambientais. Schmidt, et al. Trends in Biochemical Science, 2003
Mecanismos para originar diversidade funcional Estudos realizados com superfamílias de enzimas Enzimas de origem comum que podem ser identificadas pela seqüência e pela homologia estrutural Superfamília de flavoproteínas que contém domínios de 2 dinucleotídeos tdbdf Nucleotideode piramidina FAD (dinucleotideo adenina flavina) 2 cofatores Diversas reações de oxidação/redução função
Mecanismos para originar diversidade funcional A) Pode haver troca de resíduos no sítio catalítico ou mesmo em aminoácidos que determinam a especificidade da reação, como em sítios para cofatores; Dominios tdbdf Superposição de estruturas quaternárias de enzimas da super família tdbdf Ojha, et al. PLOS Comp Biol, 2007
Mecanismos para originar diversificação funcional B) Pode haver variações estruturais em loops e acessórios de domínio de ligação, diferentes cofatores; Citocromo C sulfeto dehidrogenase: heme 2,4-dienoilCoa redutase: Cluster 4Fe-4S Adrenodoxina redutase: Superposição de estruturas quaternárias para rotas de transferência de elétrons de enzimas da super família tdbdf Ojha, et al. PLOS Comp Biol, 2007
GS tem papel importante na assimilação do nitrogênio inorgânico pelo organismo ela é fundamental para a produtividade de uma planta. GS s de plantas são divididas em dois subtipos celulares com diferentes localizações -GS1 (citosol) -GS2 (plastídeos) GS1a de milho: altamente estável Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Glutamina Sintetase (GS) é uma enzima essencial para plantas catalisarem a incorporação de amônia no glutamato, para gerar glutamina. GS L-Glutamato GS L-Glutamina Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Caracterizar a estrutura da GS de milho - decâmero composto por dois anéis pentaméricos, com total de 10 sítios ativos. Sítio ativo Interações entre subunidades Estrutura da GS1a de milho Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Comparação da estrutura oligomérica da GS de milho (a) e da bactéria M. tuberculosis(b) Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Determinantes estruturais de estabilidade em GS1a - Plantas superiores apresentam isoenzimas com propriedades diferentes, sendo que a presença de algumas delas são cruciais para a assimilação eficiente de amônia em resposta a variáveis ambientais. - Foi observado diferenças significantes na estabilidade térmica (calor) e nas propriedades catalíticas entre a GS1a e a GS1d. Inativação GS1d Dissociação da assembléia oligomérica GS1d facilmente inativada, como ocorre com a GS bacteriana Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Determinantes estruturais de estabilidade em GS1a - Construção de genes quiméricos para encontrar a região responsável pela estabilidade da enzima a- representação esquemática de genes GS1a/GS1d quiméricos b- comparação da estabilidade dos quiméricos GS s Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Determinantes estruturais de estabilidade em GS1a - Substituição de aminoácidos simples nas 7 posições de divergência entre GS1a e GS1d Substituição de aminoácido simples na região de 146 a 186 da GS1a. Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
O resíduo chave de aminoácido responsável pela estabilidade da GS1a em milho é 161-Ile. Sítio catalítico da GS1a Unno, et al. The Journal of Biological Chemistry, 2006
Algumas características estruturais e bioquímicas podem estar envolvidas mais fortemente na reação catalisada pela enzima, e podem permitir a identificação de motivos estruturais conservados. A partir desses dados, é possível caracterizar a reação química desempenhada pela enzima e inferir aspectos sobre a origem da diversidade de funções e filogenia; Estudos têm demonstrado que mudanças em propriedades do mecanismo químico da reação podem levar a evolução de novas funções em isoenzimas; A resposta metabólica à mudanças ambientais pode obter maior sucesso de adaptação quando aliada à variabilidade enzimática, pois esta pode acompanhar a diversidade funcional de enzimas, o que promoveria vias alternativas de respostas adaptativas.
Paula Fabiane Martins Laboratório de Genética e Bioquímica de Plantas Contato: pfmartin@esalq.usp,br