1/8 1. INTRODUÇÃO / FINALIDADE DO MÉTODO A gonorréia ou blenorragia é uma doença sexualmente transmissível (DST), causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae, ou gonococo. A gonorréia é causada por uma bactéria que pode provocar inflamação na uretra, na próstata e no útero. O homem sente dor e ardência na região genital e elimina uma secreção branca ou amarelada ao urinar. A N.gonorrhoeae é uma bactéria Gram-negativa, que à microscopia óptica tem forma de diplococos medindo cerca de 1 micrometro (são cocos assemelhados a um rim, e que se agrupam aos pares). O fator mais importante de virulência do gonococo é a existência de pílios e daproteína. Estas estruturas permitem à bactéria permanecer aderente à mucosa do tracto urinário, resistindo ao jato da micção. O gonococo infecta principalmente as células cilíndricas da uretra, poupando geralmente a vagina e útero, cujos epitélios são de células escamosas. 2. NOME DO TESTE E SINONÍMIAS Cultura para gonococos, cultura para Neisseria gonorrhoeae 3. ABRANGÊNCIA Setor de Microbiologia. 4. PRINCÍPIO DO MÉTODO As amostras coletadas dos locais suspeitos de infecção são semeadas em Agar chocolate, sendo incubadas por até 48 horas a 35-37 C, em ambiente de 10% de CO 2 e umidade. As colônias de gonococos são mucóides, convexas, elevadas e brilhantes, com 1-5mm de diâmetro, transparentes ou opacas, não pigmentadas e não hemolíticas. Posteriormente, é feito o gram das colônias, onde deverão ser encontrados diplococos gram negativos. Confirmando a suspeita, é feito o teste da oxidase, onde as bactérias são colocadas em papel de filtro embebido em cloridrato de tetrametil-parafenilene-diamina (oxidase), as neisserias rapidamente adquirem uma cor púrpura-escura. 5. APLICAÇÃO CLÍNICA Os gonococos atacam as mucosas do trato genitourinário, olhos, reto e garganta, produzindo supuração aguda que pode levar a invasão tecidual. Este processo é seguido de inflamação crônica e fibrose. Nos homens, verifica-se habitualmente a ocorrência de uretrite, com pus cremoso e amarelado e micção dolorosa. O processo pode estender-se para o epidídimo. Com o desaparecimento da supuração na infecção não tratada, como fibrose, resultando algumas estenoses uretrais. A infecção uretral nos homens também pode ser assintomática. Nas mulheres, a infecção primária ocorre no endocérvice e estende-se para a uretra e a vagina, produzindo corrimento mucopurulento. A seguir, pode progredir para as trompas de Falópio, causando salpingite, fibrose e obliteração das trompas. Ocorre infertilidade em 20% das mulheres com salpingite gonocócica. A cervicite ou a proctite gonocócica crônica são sempre assintomáticas. Além dessas infecções a Neisseria gonorrhoeae causa bacteremia gonocócica, endocardite, meningite e oftalmia neonatal.
2/8 6. AMOSTRA a) Tipo de amostra Secreção uretral, urina de 1º jato, secreção vaginal e secreção ocular. b) Quantidade mínima de amostra necessária Urina de 1º jato até 5 ml. c) Restrições e critérios para rejeição de amostra Amostras não transportadas e/ou armazenadas de forma inadequada (amostras coletadas com swab sem meio de transporte). Amostras recebidas sem identificação do paciente. Urina com grande volume, o que significa dizer que a urina não foi de 1º jato e sim de jato médio. d) Condições de acondicionamento das amostras As amostras de secreção colhidas com swab com gel permanecem estáveis em geladeira por um período de 24 horas. A urina de 1º jato deverá ser armazenada em coletor universal e ser prontamente semeada, não ultrapassando mais do que 8 horas se conservadas a temperatura ambiente. e) Procedimento de tratamento ou pré-tratamento da amostra Não se aplica. f) Preparo do paciente Conforme descrito no Pop Orientação de preparo e coleta de amostras biológicas (Cód. PO-LB-CO-005). g) Transporte da amostra Vide o PO Manuseio de Transporte de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-0). 7. BIOSSEGURANÇA Para esta atividade é necessário a utilização de luvas, jaleco, touca e máscara, conforme descrito no POP Orientações de Biossegurança em vigor (cód. PO-LB-CQ-001). 8. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
3/8 a) Equipamentos Autoclave Estufa bacteriológica a 35-37 C Balança b) Materiais Swab em tubo com meio de Stuart Bico de Bunsen Placa de Agar chocolate Agulha ou fio bacteriológico Lâmina de vidro desengordurada limpa Lápis dermatográfico Solução fisiológica estéril Bastão de vidro Aquecedor a gás Erlenmeyer 1 ou 2 L. Panela Termômetro Papel p/ pesagem Palito de madeira para pesagem Água deionizada estéril Autoclave Placas de petri, plásticas, lisas e descartáveis. Jarra de microaerofilia Isqueiro Apoiador para coloração de gram Fita adesiva termo indicadora c) Reagentes Solução de cloreto de sódio 0,9% estéril.preparação: Dissolver 0,9g do NaCl em água destilada estéril e completar para 1000mL. Em seguida esterilizar em autoclave a 121 C por 15 minutos. Validade: Se conservado em geladeira a validade é de 6 meses. Após o frasco aberto a validade é de 5 dias. Fucsina Fenicada p/ Gram Frasco 500mL, NEWPROV. RMS: 102.879.100.54. Conservar em temperatura ambiente. Pronto para uso. Álcool-acetona p/gram, 500mL, NEWPROV, Reg Anvisa: 10287910054: Conservar em temperatura ambiente ao abrigo da luz. Lugol p/ gram Frasco 500mL, DOLES. RMS: 102.318.100-21, ou NEWPROV, Reg Anvisa 10287910054. Conservar em temperatura ambiente. Pronto para uso.
4/8 Cristal violeta Frasco 500mL, DOLES. RMS: 102.318.100.30, ou NEWPROV, Reg Anvisa 10287910054. Conservar em temperatura ambiente. Pronto para uso. Base de Ágar sangue Frasco 500g, BIOBRÁS. RMS: 100.057.40.32, ou TSA 500g, MBIOLOG, RMS: 80047580055, ou DIFCO Tryptic Soy Agar BD, ref 236950.. Conservar em temperatura ambiente. Pronto para uso. Placa de Agar chocolate 90 X 15mm. Preparação: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante. Autoclavar a 121 C por 15 minutos. Retirar da autoclave e resfriar até 45 C. Adicionar 50mL de sangue de carneiro para cada litro de meio base. Em seguida, aquecer lentamente até 85 C e homogeneizar constantemente até achocolatar o meio. Resfriar a temperatura ambiente, distribuir nas placas de petri, esperar solidificar e armazenar em geladeira. Tiras de Oxidase 20 testes, PROBAC. Reg MS: 10104030032, ou NEWPROV, frasco c/ 10 unidades. Para os dois kits armazenar em geladeira. Pronto p/uso. - Armazenamento e estabilidade dos reagentes: Os reagentes são estáveis ate a data de expiração. Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente para serem usados; conter a data de recebimento no setor e a data de abertura para uso, com a rubrica do colaborador responsável. 9. CALIBRAÇÃO Não aplicável. 10. CONTROLE DE QUALIDADE a) Controle de Qualidade Interno: Conforme plano da qualidade do setor. b) Controle de Qualidade Externo: Conforme plano da qualidade do setor. 11. PROCEDIMENTO TÉCNICO Receber a amostra já identificada apropriadamente com número da OS, iniciais do paciente e espécime clínico. Conferir identificação da amostra com a folha de trabalho, sinalizando com um traço ao lado da OS, identificando que a amostra deu entrada e será semeada. Descarregar a amostra do swab na placa de Agar chocolate, pré-identificada com a data, número da OS, e espécime clínico. Quando o material for urina de 1ª jato, o descarrego do material deverá ser feita com uma alça bacteriológica. Com uma alça bacteriológica semear o material descarregado do swab em estrias por esgotamento em três direções.
5/8 Incubar as placas por até 48hs em estufa bacteriológica (35-37 C), dentro de uma lata com vela e um chumaço de algodão umedecido. Antes de tampar a lata, a vela deverá ser acesa para que quando se apague (pela ausência do O 2 ) o ambiente dentro da lata tenha aproximadamente 10% de CO 2. Proceder a leitura das placas de forma a procurar colônias mucóides, convexas, elevadas e brilhantes, com 1-5mm de diâmetro, transparentes ou opacas, não pigmentadas e não hemolíticas. Fazer o gram (ver o procedimento para coloração de gram no protocolo próprio) das colônias sugestivas de gonococos, observando microscopicamente a presença de diplococos gram negativos. Fazer o teste da oxidase da seguinte forma: Tocar na colônia suspeita de gonococos com uma alça bacteriológica e colocar sobre a tira reagente de oxidase, observando o aparecimento de uma mancha de cor púrpura sobre a superfície a qual se depositou a colônia suspeita. a) Limites de Detecção/ Sensibilidade: Não se aplica. b) Linearidade: Não se aplica. c) Intervalo reportável (CRR): Não se aplica. d) Valor crítico: Não se aplica. e) Especificidade: Não se aplica. f) Carryover: Não se aplica 12. CÁLCULOS Não aplicável. 13. REGISTROS DOS RESULTADOS Registrar os resultados na folha de trabalho. 14. PROCEDIMENTOS EM CASO DE RESULTADOS ANORMAIS Verificam-se dados clínicos, medicamentos e histórico do paciente. Se necessário o ensaio é repetido e informa-se que o resultado foi repetido e confirmado na amostra. Comunicar ao medico que solicitou por via telefônica, os resultados discrepantes e anotar na Planilha de Comunicação de Resultados Críticos (Cód. LAB- 089-VR01). 15. VALORES DE REFERÊNCIA Negativo.
6/8 16. INTERFERÊNCIAS Formulação alterada do meio Espessura do meio Tempo e atmosfera de incubação Presença de água de condensação nas placas Amostras transportadas e/ou armazenadas de forma adequada Alça bacteriológica excessivamente aquecida - O método de incubação das amostras em Agar chocolate é menos sensível que a incubação das amostras em Agar Thayer Martin, pois este último meio é enriquecido com Isovitalex (fatores X e V), além de inibir outras bactérias devido a presença de VCNT(vancomicina, colistina, nistatina e trimetropim ). Desta forma as cepas de gonococos mais fastidiosas apresentam melhor crescimento no Thayer Martin. Apesar disso, os gonococos apresentam bom crescimento em Agar chocolate, já que durante o processo de aquecimento até 85 C os fatores X e V são liberados do interior das hemácias, porém em menor concentração do que encontrado no meio de Thayer Martin, que são obtidos comercialmente e são adicionados em alta concentração. - Problemas técnicos que possam ocorrer na realização da rotina dos exames devem ser analisados conforme informações no Plano da Qualidade do Setor Microbiologia (cód. PQ-LB-MC-001). Sempre que necessário os resultados serão analisados de acordo com a indicação clinica e/ou historia do paciente. 17. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA a) Bibliografia OPLUSTIL, Carmen Paz... [et.al.]. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. SARVIER: São Paulo, 2000. b) Documentos Complementares Bula das tiras de Oxidase Plano da qualidade do setor da Microbiologia (cód. PQ-LB-MC-001) Orientação de Preparo e Coleta de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-005). PO Manuseio de Transporte de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-0). PO de Orientações de Biossegurança (cód. PO-LB-CQ-001) 18. HISTÓRICO DAS REVISÕES Pg. Natureza da Revisão Data da Revisão Versão Responsáveis 1 Alteração no tempo da estabilidade da amostra 30/07/2005 01 Vitor Almeida 2/3 Atualização e inserção de novos reagentes 30/07/2005 01 Vitor Almeida 3 Alteração de texto no procedimento 30/07/2005 01 Vitor Almeida 2 Atualização e inserção de novos reagentes 08/09/2008 02 Vitor Almeida
7/8 3 Introdução da folha de trabalho na rotina de conferência e registro dos resultados 08/09/2008 02 Vitor Almeida 3 Alteração de texto no procedimento detalhado 20/03/2012 03 Talita Caldas 1-5 Revisão de todos os itens 13/08/2013 04 1-5 Pop recodificado, codificação anterior PT-LB-MC-130 13/08/2013 04 1-7 Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 1-7 Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Após Pré auditoria. Ana Regina e 01/08/2014 05 12/11/2014 1-7 Procedimento revisado e sem alterações. 19. REGISTRO DE TREINAMENTO DATA NOME COMPLETO ASSINATURA