MODIFICAÇÃO DE SUPERFÍCIES VIA TECNOLOGIA DE PLASMA VISANDO PREVENÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA T. B. Santos 1, A. C. O. C. Doria 1, G.T.C. Redi 1, F.R. Figueira 1, J.S. Brandão 1, A.L. Lopes 1, A.L.S. Oliveira 1, R. S. Pessoa 1,2, H. S. Maciel 1,2, S. Khouri 1, L. Vieira. 1,2 1 Universidade do Vale do Paraíba/IP&D/Laboratório de Biotecnologia e Plasmas Elétricos, Av. Shishima Hifumi, 12244-000, São José dos Campos, SP, Brasil. Fone: +55 12 3947 1142/thabaesso@hotmail.com 2 Instituto Tecnológico de Aeronáutica/Departamento de Física, Praça Marechal Eduardo Gomes, 12228-900, Brasil. Fone: +55 12 3947 5940 Resumo - Biofilme é definido como a aderência de micro-organismos em superfícies sólidas e em equipamentos hospitalares pode levar a processos infecciosos. Neste estudo, avaliou-se uma possível forma para preveni-lo, onde filmes finos a base de carbono do tipo amorfo (Diamond-like Carbon - DLC) foram preparados através do tratamento por plasma elétrico em baixa pressão e sua performance antifúngica foi estudada em substratos de poliuretano. O processo se deu via reator de plasma (PECVD) usando precursores de hexano com inserção de cânfora. Investigou-se os filmes quanto suas propriedades morfológicas pela técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e realizou-se testes de crescimento e desenvolvimento de biofilmes de Candida albicans cultivados in vitro. Utilizou-se o método quantitativo para determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml) e o MEV para uma análise qualitativa. Os substratos que continham revestimento de DLC com e sem cânfora tiveram um percentual de redução de 99% e 91% respectivamente. O revestimento de materiais com filmes finos de DLC com substância antifúngica pode se tornar uma alternativa válida para a diminuição de infecções hospitalares. Palavras-chave: Candida albicans, cânfora, Diamond-like carbon e plasma. Área do Conhecimento: Engenharias; Engenharia Biomédica Introdução As infecções hospitalares e a resistência aos antifúngicos são problemas crescentes na saúde pública (PEREIRA et al., 2014). Nas últimas décadas teve-se um grande aumento, levando ao óbito cerca de 60% dos pacientes (RUIZ et al., 2013; MENEZES et al., 2012). Essas infecções apresentam alto custo hospitalar, pois aumentam o tempo de internação do paciente, além de causarem elevada mortalidade (OLIVEIRA et al., 2014). Cerca de 80% das infecções hospitalares causadas por fungos são originadas por espécies do gênero Candida. A principal porta de entrada do micro-organismo na corrente sanguínea é através da via extralumial do cateter, que é muito utilizado no ambiente hospitalar, principalmente em UTI s. O responsável pela infecção relacionada ao cateter é o biofilme (BRITO, 2007), conjunto de microorganismos que convivem em associação (RUIZ et al., 2013; STORTI, 2011). A maioria dos microorganismos, envolvidos na colonização do cateter, não são virulentos na forma planctônica, mas podem causar infecção persistente quando estão agrupados (STORTI, 2011). Uma possível maneira de evitar a formação de biofilme em instrumentos hospitalares é o recobrimento desses materiais com filme fino de DLC com um agente fungicida. O DLC (do inglês, Diamond-like carbon) é uma forma metaestável de carbono amorfo que contém uma parte significativa de ligações sp 3 e sp 2. Pertence a uma nova classe de material, cujas propriedades físicas e químicas são próximas às do diamante, tais como, dureza e módulos de elasticidade relativamente elevados, trazendo as vantagens de ser mais facilmente obtido e poder ser depositado em grandes áreas. Existem muitas formas de se depositar DLC em um substrato, porém a mais comum é através do processo CVD (chemical vapor deposition), onde se utiliza um reator constituído por dois eletrodos de áreas diferentes que com a adição de um gás gera um plasma (ROBERTSON, 2002). A cânfora foi escolhida como agente fungicida por ser utilizada em grandes quantidades como plastificante da nitrocelulose na indústria de celulose, na forma de álcool canforado, compressas ou injeções na área de medicina e também como desinfetante e repelentes contra traças e insetos (ABIVARD, 1979). O objetivo deste trabalho foi a modificação da superfície de polímeros do tipo poliuretano utilizado na 1
fabricação de cateteres com o intuito de inibir o crescimento de biofilme fúngico. Metodologia Segmentos de poliuretano de área de 2cm 2 foram revestidos em ambos os lados, em um reator Plasma enhanced Chimical Vapor Deposition (PECVD), com filmes finos de DLC com e sem adição de um antifúngico (cânfora). Nos filmes que continham a substância fungicida, a evaporação da mistura hexano e cânfora para o interior do reator ocorreu em um dispositivo de vidro acoplado ao reator de plasma, que pode ser observado na Figura 1. Os parâmetros utilizados estão descritos na Tabela 1. Tabela 1 Parâmetros de deposição do filme fino Figura 1- Reator de plama atmosférico, modelo NPE-4000 PECVD (Nanomaster Inc) Subsequentemente, os substratos foram introduzidos em Erlen Meyers que continham 15 ml de suspensões fúngicas (de cepas padrão ATCC de C. albicans) da ordem 0,5 da escala de Mac Farland em caldo Sabouraud e incubadas a 37ºC por 48 horas, sob agitação constante de 110 rpm em incubadora shaker. Posteriormente, foram removidas e transferidas para tubos contendo tampão fosfato (PBS ph 7,2 ± 0,1) e homogeneizadas em vórtex durante um minuto. Para a análise quantitativa, cerca de 100μl da suspensão fúngica que armazenavam os substratos, foram semeadas em placas de Petri estéreis, com cerca de 20 ml de ágar Sabouraud solidificado, pela técnica de Spread-Plate, incubadas a 37º C por 48 horas e em seguida colocadas em um contador automático para a determinação das unidades formadoras de colônia (UFC/ml). Para a análise qualitativa, os substratos foram transferidos para um recipiente estéril e colocados em estufa por aproximadamente 3 horas para a secagem, então, foram remanejados assepticamente com o auxílio de uma pinça, para um porta-amostra ( stub ), que possui um carbono coloidal para a condutividade dos elétrons e posterior preparação de metalização da superfície com banho de ouro. Logo após, foi realizada a análise por Microscopia Eletrônica de Varredura. Essa análise foi feita antes e após a indução do crescimento de biofilme fúngico nas amostras, a fim de caracterizar os revestimentos depositados. Todos os testes foram realizados em triplicata 2
Resultados Após análise quantitativa, observou-se uma redução de 99% na formação de UFC s das amostras que continham DLC com cânfora e de 91% nas amostras que continham apenas DLC. Conforme pode ser visualizado nas Figuras 2 (a), (b) e (c) e na Tabela 2. A figura 2a mostra as placas semeadas com suspensões fúngicas retiradas de susbstratos de poliuretano puro. Pode-se observar a presença de Unidades Formadoras de Colônias e deve ser levado em consideração que foram realizadas diluições em séries 1:100, a fim de facilitar a contagem. A figura 2 (b) mostra as placas semeadas com suspensões fúngicas de substratos que continham poliuretano revestidos de DLC com cânfora. Observa-se a presença de algumas UFC s, porém em número reduzido, quando comparado à imagem anterior, ainda que tenha sido realizada diluição seriada de 1:10. A figura 2 (c) mostra as placas semeadas com suspensões fúngicas retiradas de substratos que continham DLC sem cânfora. Visualiza-se grande quantidade de UFC s, mas deve-se levar em consideração que foi realizada diluição seriada de 1:10 apenas. Grupo UFC/mL % de redução POL 1,39x 10 5 - DLC 1,24x 10 4 91 CAN 9x 10 2 99 Tabela 2 Resultados obtidos através da contagem de UFC s Na figura 3 (a) tem-se uma imagem obtida através de MEV do substrato de poliuretano puro, observa-se que sua superfície está totalmente limpa e sem qualquer contaminação. Na Na figura 3 (b) tem-se uma fotomicrografia obtida por MEV do poliuretano puro já com o biofilme, com ampliação de 1500x. Pode-se notar a presença de hifas de Candida albicans cultivadas no período de 48h em que o substrato ficou imerso em suspensão fúngica. Figura 3 - Fotomicrografia eletrônica de varredura do substrato com ampliação de 1500x: (a) poliuretano puro e (b) poliuretano puro com biofilme fúngico A figura 4 (a) mostra uma fotomicrofotografia de uma região do substrato de poliuretano com revestimento de DLC com cânfora, obtida através de Microscopia Eletrônica de Varredura. Na figura 4 (b) observa-se o substrato de poliuretano revestido com DLC com cânfora contendo pequena região com biofilme fúngico. Pode-se notar que os fundos das imagens são muito semelhantes aos dos substratos seguintes, ainda que esse revestimento possua também cânfora. Pode ser observada a presença de poucas leveduras. Figura 2 Imagens das UFC s de substratos de: (a) poliuretano puro (b) poliuretano com revestimento de DLC e cânfora e (c) substratos com revestimento de DLC. 3
albicans, chegando a resultados satisfatórios em relação a diminuição da contagem de UFC s.. Conclusão Figura 4 - Substrato polimérico revestido com DLC com cânfora com apliação de 1500x: (a) sem crescimento de biofilme e (b) com biofilme A figura 5 (a) mostra uma fotomicrofotografia do substrato de poliuretano com revestimento de DLC, obtida através de Microscopia Eletrônica de Varredura. Nota-se que o substrato é mais rugoso devido ao revestimento de DLC quando comparado com a superfície do poliuretano puro. Na figura 7 (b), observa-se o mesmo substrato já com o biofilme fúngico. Nota-se o fundo também rugoso e algumas leveduras, mas observa-se que suas hifas se misturam com o filme fino, ficando presas às suas tramas. Através do processo de deposição foi possível obter filmes finos de DLC contendo cânfora nas superfícies das amostras. Tal procedimento pode ser uma alternativa válida para a diminuição de infecção fúngica hospitalar, pois o DLC dificultou a adesão da levedura ao substrato e a cânfora foi capaz de reduzir consideravelmente a quantidade de UFC s. Referências - ABIVARD, C. Fungicidal effect of camphor on 7 soilborne fungi. Phytopath. Medit. 1979, 18, 213-215 - BRITO, M. R. P. F. Detecção de formação de biofilme em cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis isolados de ponta de cateter venoso central. Publicado nos Anais do XVI e AIC em setembro de 2007. -BOGAERTS, A.; NEYTS,E.; GIJBELS, R.; MULLEN, J. V. D. Gas discharge plasmas and their applications. Spectrochimica Acta Part B 57 (2002) 609 658. Figura 5 - Superfície do poliuretano revestido com DLC com ampliação de 1500x (a) sem crescimento de biofilme e (b) com biofilme fúngico Discussão Ainda que exista grande número de pesquisas realizadas com revestimento de DLC em materiais metálicos, pouco se conhece sobre o uso de DLC em biomateriais poliméricos. O mesmo pode-se dizer com o DLC e substâncias fungicidas; pois apesar de existirem estudos que citem a prata como possível meio de inibir o crescimento microbiano, são escassos os estudos sobre o uso de substâncias fungicidas. Em estudo semelhante, Queiroz et al. (2013), revestiram PMMA (polimetilmetacrilato) com DLC dopado com prata e induziram a formação de biofilme fúngico de C. - MENEZES, E. A; JÚNIOR, A. A. V; CUNHA, F. A; CUNHA, M. C. S. O; BRAZ, B. H. L; CAPELO, L. G; SILVA, C. L. F. Identificação molecular e suscetibilidade antifúngica de Candida parapsilosisisoladas no Ceará, Brasil.J Bras Patol Med Lab v. 48 n. 6 p. 415-420 dezembro 2012 - OLIVEIRA, V.K.P.; RUIZ, L.S.; OLIVEIRA, N.A.J.; MOREIRA, D.; HAHN, R.C.; MELO, A.S.A.; NISHIKAKU, A.S. & PAULA, C.R. - Fungemia caused by Candida species in a Children s Public Hospital in the city of São Paulo, Brazil: study in the period 2007-2010. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo, 56(4): 301-5, 2014. - PEREIRA, R. D.; VELOSO, J. A. F.; MOTA, H. F.; MOTA, B. C. F.; FREITAS, R. F.; ROYO, V. A. Estudo in vitro da atividadeantifúngica do extrato de guaco (Mikania glomerata) contra Candida albicans. Conexão ci.: r. cient. UNIFOR- MG, Formiga, v. 9, n. 1, p. 31-38, jan./jun. 2014 4
- ROBERTSON J. Diamond-like amorphous carbon. Material science and engeneering. R 37 (2002) 129-281 - RUIZ, L.S.; KHOURI, S.; HAHN, R.C.; SILVA, E.G.; OLIVEIRA, V.K.P.; GANDRA, R.F.; PAULA, C.R. Candidemia by Species of the Candida parapsilosis Complex in Children's Hospital: Prevalence, Biofilm Production and Antifungal Susceptibility.Mycopathologia. 2013 Apr;175(3-4):231-9. - STORTI, A. Biofilme detectado em ponta de cateter venoso central por cultura usando método quantitativo. RBAC, vol. 39(3): 183-187, 2007. - QUEIROZ, J. R. C; FISSMER, S. F; KOGA-ITO, C. Y; SALVIA, A. C. R. D; MASSI, M;, SOBRINHO, A. S. S; JÚNIOR, L. N. Effect of Diamond-Like Carbon Thin Film Coated Acrylic Resin on Candida albicans Biofilm Formation. Journal of Prosthodontics 22 (2013) 451 455 c_ 2013 by the American College of Prosthodontists 5