ANELISE CRISTINA OSÓRIO CESAR DORIA

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1 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica ANELISE CRISTINA OSÓRIO CESAR DORIA ESTUDO DA AÇÃO ANTIFÚNGICA DE UM JATO DE PLASMA NÃO-TÉRMICO DE ARGÔNIO E/OU AR COMPRIMIDO SOBRE BIOFILMES DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA São José dos Campos, SP 2015

2 ANELISE CRISTINA OSÓRIO CESAR DORIA ESTUDO DA AÇÃO ANTIFÚNGICA DE UM JATO DE PLASMA NÃO-TÉRMICO DE ARGÔNIO E/OU AR COMPRIMIDO SOBRE BIOFILMES DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Sávio Pessoa São José dos Campos, SP 2015

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5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, por ter me dado saúde e força para superar minhas dificuldades. À minha família, pelo amor, incentivo e apoio incondicional. Ao meu orientador, Professor Doutor Rodrigo Sávio Pessoa, pelo suporte, pelas suas correções e incentivo. À Professora Doutora Sônia Khouri, pela confiança no mérito e na ética deste trabalho, e pela amizade fraterna que nos une. Ao Professor Doutor Walter Miyakawa e à Técnica Priscila Leite, pelo tempo e ajuda dispensados para a realização deste trabalho. Aos colegas do Laboratório, sem cuja colaboração não teria sido possível a conclusão deste trabalho. Aos amigos, pela paciência e compreensão. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pelo apoio financeiro. À Universidade do Vale do Paraíba UniVap, seu corpo docente, direção e administração, que me oportunizaram a janela por onde vislumbro um horizonte mais amplo. A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram na elaboração deste trabalho.

6 RESUMO Fungos existem, na maioria dos ambientes, como complexas e organizadas comunidades biológicas embebidas dentro de matrizes poliméricas produzidas por eles próprios, conhecidas como biofilme. Os biofilmes fúngicos representam uma onipresente e predominante causa de infecções crônicas, associadas com a utilização de dispositivos médicos de longo período de uso, tais como cateteres e próteses. Tais infecções exibem uma tolerância significativamente aumentada para agentes antifúngicos, biocidas e a variações imunológicas. Isso torna difícil, e algumas vezes impossível, o tratamento com agentes terapêuticos convencionais. Abordagens alternativas eficazes para a prevenção e erradicação do biofilme associado a infecções crônicas e associadas a dispositivos hospitalares são, portanto, urgentemente necessárias. Plasmas não-térmicos operados em pressão atmosférica estão ganhando cada vez mais atenção como uma abordagem potencial para a erradicação e controle da infecção e/ou contaminação bacteriana ou fúngica; porém, com relação à contaminação fúngica, pouco foi estudado. Ademais, até o momento, a maioria dos estudos tem sido conduzida com relação aos micro-organismos na forma planctônica e pouca atenção tem sido dirigida aos biofilmes. Neste trabalho de mestrado, foi avaliada a ação de um jato de plasma de Argônio e/ou ar comprimido, operado em pressão atmosférica, sobre biofilmes de leveduras do gênero Candida spp cultivados in vitro sobre substrato de poliuretano, visando correlacionar os resultados biológicos com as características químicas dos plasmas gerados. Os principais resultados observados foram uma redução de 88,1% na contagem de unidades formadoras de colônia nas amostras tratadas com plasma de Argônio/ar comprimido, 86,8% de redução nas amostras tratadas com plasma de ar, e 85 % nas amostras com Argônio. Já no teste de viabilidade celular, os resultados foram 8%, 12% e 33% para as amostras tratadas com Argônio/ar comprimido, ar comprimido e somente Argônio, respectivamente. Foi verificada a presença de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio na análise da química dos plasmas estudados, além de terem sido comprovadas por micrografia, alterações morfológicas nos micro-organismos e no substrato. Concluiu-se que os diferentes tratamentos com os tipos de plasma estudados são eficazes no controle da contaminação microbiana, independentemente da influência do aquecimento gerado pelo sistema, e que as espécies reativas exercem papel fundamental na inativação de células leveduriformes presentes no biofilme analisado. Palavras-chave: Plasma Atmosférico. Argônio. Ar Comprimido. Biofilme. Candida spp.

7 ABSTRACT Fungi exist in most environments as complex and organized biological communities embedded within polymer matrices produced by themselves, known as biofilm. The fungal biofilms represent a ubiquitous and predominant cause of chronic infections and associated with the use of medical devices for long period, such as catheters and prostheses. Such infections exhibit a significantly improved tolerance for antifungal agents, biocidal agents and immunological changes. This makes it difficult, and sometimes impossible, to treat with conventional therapeutic agents. Effective alternative approaches to the prevention and eradication of biofilm associated with chronic infections and associated with hospital devices are therefore urgently needed. Non-thermal plasmas operated at atmospheric pressure are gaining increasing attention as a potential approach to the eradication and control of infection and / or bacterial or fungal contamination, however, in relation to fungal contamination, little were studied. Moreover, to date, most studies have been conducted with respect to microorganisms in planktonic form and little attention has been directed to biofilms. In this master thesis, we evaluated the action of an argon and / or compressed air plasma jet operated at atmospheric pressure, on biofilm yeasts Candida spp cultured in vitro on polyurethane substrate, aiming to correlate the biological results with chemical characteristics of the generated plasma. The main results observed were a reduction of 88.1% in the count of colony forming units in the samples treated with argon plasma / compressed air, 86.8% reduction in samples treated with air plasma samples and 85% in Argon. In the cell viability test, the results were 8%, 12% and 33% for the samples treated with the argon / air, compressed air, and only argon, respectively. It was verified the presence of reactive species of oxygen and nitrogen in the analysis of the chemistry of plasmas studied, and has been proven through micrograph, morphological changes in microorganisms and the substrate. Concluding that the studied different plasma treatments are effective in controlling microbial contamination, independent of the influence of heated generated by the system and that the reactive species play a fundamental role in the inactivation of yeast cells in the biofilm analyzed. Keywords: Atmospheric Plasma. Argon. Compressed Air. Biofilm. Candida spp.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Sequência de realização da metodologia Figura 2 Esquema do equipamento de plasma utilizado nos tratamentos Figura 3 - Arranjo experimental para a técnica de espectroscopia óptica de emissão Figura 4 Imagem da fibra óptica posicionada para obtenção do espectro Figura 5 Aparato experimental para simulação do ambiente de plasma Figura 6 Imagem de C.albicans inviáveis (coradas em azul) no teste de viabilidade celular com Azul de Tripan. Aumento de 400x Figura 7 Equipamento Metalizador modelo K550X (Emitech) Figura 8 Microscópio Eletrônico de Varredura modelo EVO MA 10 (Zeiss) Figura 9 Microscópio de Força Atômica modelo SPM9500 J3 (Shimadzu) Figura 10 Temperatura no substrato em função do tempo de exposição para as diferentes composições químicas do plasma Figura 11 Temperatura no substrato em função da distância bocal/substrato para as diferentes composições químicas do plasma Figura 12 Temperatura de saturação no substrato em função do fluxo de gás para os plasmas de ar e Argônio Figura 13 Temperatura de saturação no substrato em função da concentração de ar comprimido na mistura Argônio/ar Figura 14 Espectros de emissão dos plasmas de Argônio (a), Argônio+ar (b) e somente ar (c) Figura 15 Evolução dos espectros com a concentração de Argônio na mistura Argônio + ar comprimido Figura 16 Imagem das placas semeadas e incubadas, conforme metodologia descrita Figura 17 Comparativo das imagens de MEV e AFM Figura 18 - Espectroscopia de raios X por dispersão em energia de artefatos encontrados nas amostras Figura 19 Imagem do biofilme tratado com plasma de Argônio Figura 20 Imagens de AFM e em 3 dimensões (3D) do material tratado com os diferentes plasmas Figura 21 Rugosidade RMS extraída das imagens de AFM da figura Figura 22 Imagem de MEV da amostra colocada em estufa a 60 C Figura 23 Imagem de MEV da amostra submetida ao jato de ar quente a 60 C Figura 24 Imagem das placas contaminadas com C. albicans após realização do aquecimento em estufa e com jato de ar Figura 25 Comparação entre a viabilidade celular e a temperatura para os diferentes processos analisados... 54

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Grupos experimentais Tabela 2 - Parâmetros utilizados na aplicação dos plasmas utilizados neste trabalho Tabela 3 Percentual de redução da contagem de UFC/ml Tabela 4 Percentual de Viabilidade Celular Tabela 5 - Resultados obtidos após experimento em estufa Tabela 6 - Resultados obtidos após experimento com jato de ar quente... 52

10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 3D Três Dimensões AFM Atomic Force Microscopy ATCC American Type Culture Collection C. albicans Candida albicans C. glabrata Candida glabrata C. guilliermondii Candida guilliermondii C. krusei Candida krusei C. luisitane Candida luisitane C. parapsilosis Candida parapsilosis C. tropicalis Candida tropicalis DBD Descarga de Barreira Dielétrica EDS Espectroscopia de Raios X por Dispersão em Energia EPS Substâncias Poliméricas Extracelulares ERN Espécies Reativas de Nitrogênio ERO Espécies Reativas de Oxigênio ICS Infecção da Corrente Sanguinea IH Infecção Hospitalar MEV Microscopia Eletrônica de Varredura PBS Tampão Fosfato RMS Root Mean Square UFC Unidades Formadoras de Colônia UTI Unidade de Terapia Intensiva UV Ultravioleta

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Objetivo Geral Objetivos Específicos REVISÃO DE LITERATURA Epidemiologia das candidemias Infecções por Cateter Venoso Central Biofilme e seu processo de formação Plasma Elétrico e suas aplicações na Medicina Controle de contaminação Cenário atual da pesquisa utilizando plasmas para inativação de leveduras do gênero Candida MATERIAIS E MÉTODOS Preparação das amostras Formação do Biofilme O sistema de jato de plasma em pressão atmosférica Aplicação e caracterização do plasma elétrico Técnicas para análise do aquecimento do substrato contaminado Aquecimento em Estufa Aquecimento com Jato de ar quente Análise quantitativa Spread-Plate Avaliação da viabilidade celular Análise microscópica Microscopia Eletrônica de Varredura Microscopia de Força Atômica RESULTADOS E DISCUSSÃO Efeito dos parâmetros de processo sobre a temperatura no substrato Estudo da química do plasma Análise quantitativa do tratamento a plasma do substrato de poliuretamento contendo biofilme Resultados de microscopia dos substratos antes e após tratamento com jato de plasma Efeito do aquecimento do biofilme/poliuretano: experimentos utilizando estufa e jato de ar quente CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 58

12 12 1 INTRODUÇÃO Os fungos estão presentes na maioria dos ambientes como complexas e organizadas comunidades biológicas embebidos dentro de matrizes poliméricas produzidas por eles próprios, conhecidas como biofilme. Os biofilmes fúngicos representam uma onipresente e predominante causa de infecções crônicas e associadas com a utilização de dispositivos médicos de longo período de uso, tais como cateteres e próteses. A formação de biofilme em cateter venoso central é uma das principais causas de infecção da corrente sanguínea de pacientes hospitalizados e representa importante problema de saúde pública mundial, conduzindo ao óbito em torno de 25 a 38% dos pacientes (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Tais infecções exibem uma tolerância significativamente aumentada para agentes antifúngicos, biocidas e a variações imunológicas. Isso torna difícil, e algumas vezes impossível, o tratamento com agentes terapêuticos convencionais. Portanto, estudos que tenham como foco novas metodologias de esterilização de tal material hospitalar, visando à extensão de sua vida útil de maneira eficaz, se fazem urgentemente necessários. A tecnologia de plasmas elétricos não-térmicos, operados em pressão atmosférica, estão ganhando cada vez mais atenção como uma abordagem potencial para a erradicação e controle da infecção e/ou contaminação bacteriana ou fúngica, pois tais equipamentos se beneficiam de um design simples, custo de construção/operação baixo, utilização de gases não tóxicos, temperaturas operacionais do gás próximas à do ambiente, e ausência de resíduos nocivos (BONFIM; LIMA; VICTOR, 2013; LAROUSSI, 2002; KONG et al., 2009; GAUNT; BEGGS; GEORGHIOU, 2006). É importante ressaltar que esses plasmas produzem grandes quantidades de agentes microbicidas ativos, nos quais se incluem partículas carregadas (íons positivos, íons negativos e elétrons), espécies quimicamente reativas, fótons, radiação ultravioleta (UV) e campos eletromagnéticos (ALKAWAREEK et al., 2012; FRIDMAN et al., 2008; MOISAN et al., 2002). Acredita-se que a diversidade e o pequeno tamanho destes agentes ativos atuam sobre os múltiplos componentes celulares e processos metabólicos em micro-organismos e, por conseguinte, torna menos provável o surgimento de mecanismos de resistência ocasionados pela formação do biofilme. A utilização de plasmas não-térmicos em pressão atmosférica tem sido avaliada para diversas aplicações biomédicas, a citar: cicatrização de feridas, coagulação do sangue, regeneração da pele, clareamento dental, e apoptose das células cancerosas (KONG et al., 2009; FRIDMAN et al., 2008). Além disso, muitos sistemas de plasma a pressão atmosférica têm sido estudados e provaram ser eficazes em termos de inativação microbiana e até mesmo

13 13 descontaminação de superfícies e esterilização (MOISAN et al., 2002). No entanto, em sua maioria, estes estudos foram realizados utilizando micro-organismos em sua forma planctônica, que não representam a totalidade do espectro de crescimento microbiano e sobrevivência em ambiente natural, bem como em ambientes clínicos. Embora um certo número de estudos tenha constatado o efeito dos plasmas não-térmicos operados em pressão atmosférica sobre biofilmes microbianos, ainda há muito o que ser investigado nesta vertente de pesquisa, em especial a inativação de biofilmes fúngicos (ABRAMZON et al., 2006; JOAQUIN et al., 2009; SALAMITOU et al., 2009). O estudo de novas tecnologias para o controle de contaminações microbianas se faz importante devido ao grande número de mortes devido as infecções hospitalares todos os anos, os elevados custos dos tratamentos para o Sistema Público de Saúde, além dos problemas ambientais gerados pela grande quantidade de materiais médico-hospitalares descartados, que poderiam ser reprocessados através uma técnica segura, barata e limpa para o meio ambiente. Com base no contexto apresentado neste trabalho de mestrado, propõe-se o estudo da ação de um jato de plasma de Argônio e/ou ar comprimido, operado em pressão atmosférica, sobre biofilmes de leveduras do gênero Candida, cultivados in vitro, sobre substrato de poliuretano, principal material constituinte do cateter venoso central. Em uma primeira etapa, foram realizados estudos do efeito dos parâmetros de processo (distância do bocal/substrato, tempo de exposição, fluxo de gás e composição química do plasma) sobre o aquecimento da superfície do poliuretano, bem como a análise química dos plasmas gerados através da técnica de espectroscopia de emissão óptica, visando à determinação de condições otimizadas para tratamento do conjunto biofilme/poliuretano. Na segunda etapa, foi investigada a atividade antifúngica do jato de plasma. Para isso, foram utilizados métodos quantitativos para determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml) e a avaliação da viabilidade celular; e métodos qualitativos, utilizando a técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia de Força Atômica (AFM). Paralelamente, foram realizados tratamentos do substrato com biofilme em ambientes aquecidos, como estufa e jato de ar quente. Por meio destes resultados foi possível melhor explicar o efeito das diferentes químicas do plasma sobre o processo de inativação do biofilme. A ideia é discutir sobre os mecanismos de atuação do plasma sobre o material biológico, bem como fazer uma prova de conceito visando futuramente a utilização deste processo para tratamento de dispositivos médico-hospitalares.

14 Objetivo Geral O objetivo geral deste trabalho foi estudar a ação de um jato de plasma de Argônio e/ou ar comprimido, operado em pressão atmosférica, aplicado em biofilmes de leveduras do gênero Candida spp cultivados in vitro sobre substrato de poliuretano, visando correlacionar os resultados biológicos com as características físicas e químicas dos plasmas gerados Objetivos Específicos a) Estudar o efeito do plasma de Argônio e/ou ar comprimido sobre a temperatura do substrato em diferentes condições de processo; b) Estudar a química dos plasmas gerados pela técnica de espectroscopia óptica de emissão, visando correlacionar os resultados biológicos com as características químicas dos plasmas; c) Avaliar o efeito antifúngico, in vitro, do jato de plasma de Argônio e/ou ar comprimido no tratamento em amostras de poliuretano contaminado com biofilme de Candida albicans; d) Comparar os resultados da ação do plasma com tratamentos realizados em ambientes de temperatura elevada como estufa e jato de ar quente.

15 15 2 REVISÃO DE LITERATURA Os relatos de infecções invasivas por leveduras do gênero Candida eram escassos até a metade do século XX. Nas últimas décadas, Candidas albicans e espécies não-albicans vêm se tornando cada vez mais importantes como causa de infecção. A transformação da levedura, de comensal a importante agente de infecções, ocorre em ambiente hospitalar e resulta do próprio progresso da medicina: surgimento de grande número de procedimentos invasivos, quebrando barreiras de proteção natural, uso intensivo de antibióticos de amplo espectro e a capacidade de sustentar a vida de pessoas muito debilitadas e susceptíveis a micro-organismos oportunistas (OLIVEIRA; MAFFEI; MARTINEZ, 2001). A incidência de infecções hospitalares (IHs) por fungos tem aumentado substancialmente nas últimas décadas, acarretando altos índices de mortalidade, que atingem até 60% dos óbitos por IHs. Espécies do gênero Candida têm sido os agentes mais freqüentemente isolados. Correspondem a cerca de 80% das infecções fúngicas de origem hospitalar e são a quarta causa de infecção da corrente sanguínea, conduzindo ao óbito em torno de 25 a 38% dos pacientes que desenvolvem candidemia (TAMURA et al., 2007; RUIZ et al., 2013). Nos Estados Unidos, entre 1979 e 2001, houve um aumento de 207% nas infecções da corrente sanguínea (ICS) causadas por fungos e a Candida sp foi o principal gênero envolvido. Entre as infecções hospitalares, 8% têm sido atribuídos ao gênero Candida, aumentando para 12% em doentes de unidade de terapia intensiva (RAMOS et al., 2011). Até alguns anos atrás, a Candida albicans era a espécie de maior interesse clínico; contudo, paralelamente ao aumento geral das candidemias observou-se aumento das ICS por espécies de Candida não-albicans como: C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae. As razões para essa inversão no padrão de distribuição das espécies ainda não foram completamente elucidadas, podendo estar fortemente relacionadas com o potencial de virulência (capacidade da levedura em aderir, infectar e causar doença) destes micro-organismos (TAMURA et al., 2007). 2.1 Epidemiologia das candidemias O gênero Candida pertence ao reino Fungi, filo Eumycota, classe dos Deuteromicetos. São organismos eucarióticos e heterotróficos, cuja reprodução ocorre através de brotamento ou gemulação. Existem aproximadamente de 150 a 200 espécies reconhecidas no gênero

16 16 (ODDS, 1987). A espécie Candida albicans possui a capacidade de se apresentar na forma de levedura ou na forma filamentosa (hifas). Essa capacidade de transição morfológica recebe o nome de dimorfismo celular e tem sido apontada como um importante fator de virulência, pois, este fenômeno possibilita a penetração e proliferação do fungo em vários tecidos e ainda evita que o micro-organismo seja fagocitado por macrófagos e neutrófilos, quando estão na forma de hifa. Esse fenômeno é influenciado por fatores como: temperatura, ph, fontes de carbono e substâncias químicas, além dos nutrientes presentes no meio (ÁLVAREZ; SVIDZINSKI; CONSOLARO, 2007). A candidemia é umas das causas mais comuns de infecção na corrente sanguínea de pacientes hospitalizados e representa importante problema de saúde pública mundial. Por isso, estudos contínuos fazem-se necessários (GIOLO et al., 2012; FALAGAS; ROUSSOS; VARDAKAS, 2010). O ar, alimentos, fômites, pisos e outras superfícies podem ser reservatórios de Candida spp em hospitais (TITON et al., 2009). Os modos de transmissão podem estar associados a cateteres, próteses e infecções cruzadas envolvendo pacientes e profissionais de saúde (RUIZ et al., 2013). Um estudo realizado com 712 episódios de candidemia de hospitais públicos do Brasil, observou predomínio da Candida albicans (41%) seguida de Candida tropicalis (21%) e Candida parapsilosis (20%). As espécies não-albicans foram mais freqüentes que Candida albicans, e destas, Candida parapsilosis foi a mais encontrada, seguida da Candida tropicalis. Apesar dos números pequenos, e do caráter unicêntrico deste estudo, os dados encontrados estão de acordo com o estudo epidemiológico brasileiro, que demonstrou que Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis causam a maioria das candidemias (HINRICHSEN et al., 2008). Valores semelhantes foram encontrados em outro estudo, sendo que no período analisado, foram obtidos 91 isolados de pacientes do Hospital Universitário Regional de Maringá, sendo 38 de C. albicans (41,8%), 23 de C. tropicalis (25,3%), 16 de C. glabrata (17,6%), 10 de C. parapsilosis (10,9%) e 4 de C. krusei (4,4%). A maioria, portanto, foram espécies de C. não-albicans (58,2%) em relação a C. albicans (41,8%) (DEMITTO et al., 2012). O episódio de candidemia é definido por pelo menos uma hemocultura positiva para Candida spp onde se tenha presença de sinais e sintomas de infecção dentro de um período de 30 dias. Se ocorrer outra hemocultura positiva para Candida spp durante esses 30 dias, pela mesma espécie ou por uma espécie diferente, esta hemocultura é registrada como sendo o mesmo episódio. Porém, se o paciente já apresentava uma hemocultura positiva para Candida

17 17 spp em período maior que 30 dias em relação à hemocultura inicial, este é considerado um novo episódio (FRANÇA et al., 2008). Devido ao fato desses micro-organismos serem eucarióticos, portanto, compartilharem muitos dos seus processos biológicos com os seres humanos, a maioria dos medicamentos antifúngicos causa efeitos colaterais deletérios e as doses utilizadas são normalmente fungistáticas e não fungicidas, dificultando o tratamento (BERMAN; SUDBERY, 2002). 2.2 Infecções por Cateter Venoso Central Cateteres venosos centrais são dispositivos que facilitam o tratamento e o diagnóstico de pacientes. Normalmente, são fabricados de poliuretano ou silicone. São utilizados, por exemplo, para administração de medicamentos, hemoderivados e soluções de nutrição parenteral, para monitorar a condição hemodinâmica, e facilitar o acesso vascular para hemodiálise. São então, muito usados no monitoramento de pacientes em estados críticos, principalmente em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), onde em muitas situações seu benefício é significante (ROSS et al., 2006). A contaminação do sistema intravenoso pode ocorrer em qualquer ponto, desde o momento do processamento até o término da infusão no hospital. Ocorrida uma contaminação, a cânula intravenosa e o trombo aderente formado podem servir como um foco intravascular para a proliferação e disseminação de micro-organismos (STORTI, 2006). Estima-se que pelo menos metade dos pacientes admitidos em hospitais receba terapias intravenosas (STORTI et al., 2007). Como os procedimentos médicos invasivos aumentaram, com eles há também uma maior incidência de infecções relacionadas ao uso do cateter, sendo estas uma das causas mais frequentes de morbidade e mortalidade nos hospitais (TITON et al., 2009; STOCCO et al., 2012; ORTOLANI; GASPARINO; TRALDI, 2013; CORRÊA et al., 2012). Aproximadamente 65% das infecções resultam da migração de micro-organismos que compõem microbiota da pele, a partir do sítio de inserção do cateter. Os fatores de risco relacionados à infecção por cateteres estão associados à duração do cateterismo, o local de inserção, o material do qual é constituído, a presença de múltiplos lumens, a repetição do cateterismo, a manipulação frequente, o tipo de curativo usado, os micro-organismos envolvidos na colonização do cateter, a doença de base, a gravidade do estado clínico do paciente, e a condição imunológica do mesmo (ROSS et al., 2006; CORRÊA et al., 2012).

18 18 Os cateteres podem ser classificados em: de curta permanência (utilizados em UTIs, mono ou duplo lúmen, cateter para hemodiálise etc.) e de longa permanência (utilizados em terapia endovenosa prolongada) (ORTOLANI; GASPARINO; TRALDI, 2013). Em estudo realizado em hospital público do interior de São Paulo no ano de 2012, Doria et al. (2012), verificou que os micro-organismos mais prevalentes em ponta de cateter foram: Staphylococcus epidermidis com 32%, Pseudomonas aeruginosa com 16%, fungos leveduriformes com 13% e Klebsiella pneumoniae com 12%. 2.3 Biofilme e seu processo de formação Os micro-organismos têm acesso ao cateter venoso central pela via extraluminal, ao migrarem através da pele ou por contaminação na manipulação do dispositivo. Quando associados, os micro-organismos formam o chamado biofilme, que favorece a proteção destes contra neutrófilos e dificulta a atuação dos antimicrobianos, resultando em uma terapia falha (CORRÊA et al., 2012). A infecção relacionada ao cateter ocorre sempre devido à formação de um biofilme. A capacidade da levedura de aderir e colonizar sobre a superfície do material polimérico constituinte do cateter, formando o biofilme, apoia a ideia destes materiais tornarem-se um local de colonização de microrganismos (RUIZ et al., 2013). Basicamente, o processo de formação do biofilme sobre a superfície de um substrato ocorre em três etapas: a) Transporte de células livres do meio líquido para uma superfície sólida e sua subsequente adsorção/adesão; b) Crescimento e divisão de células fixas à custa de nutrientes provenientes do líquido circundante (colonização), conjuntamente com a produção e excreção de Substâncias Poliméricas Extracelulares (EPS), e c) Dixação de células fúngicas flutuantes e outras partículas, contribuindo para a acumulação do biofilme (crescimento) (XAVIER et al., 2003). Adicionalmente, é importante salientar que existem processos que competem com o crescimento do biofilme, causando a libertação de material celular por vários tipos de mecanismos: (a) erosão superficial (perda de células individuais), (b) descolamento ( sloughing off ), (c), abrasão e (d) ataque por predadores (STORTI, 2006). Os micro-organismos praticamente não existem na sua forma livre, mas se agrupam, formando uma comunidade multicelular, tanto sob os tecidos quanto em próteses, cateteres e outras superfícies, e entre os benefícios dessa vida em comunidade destacam-se a maior

19 19 proteção contra as defesas imunes do hospedeiro e a ação de antimicrobianos, o que acaba por favorecer o estabelecimento do processo patogênico (GIOLO et al., 2010). Estudos com microscópio eletrônico de varredura e transmissão mostraram que praticamente todos os cateteres venosos centrais inseridos são colonizados por microorganismos incrustados em uma matriz de biofilme (STORTI, 2006). Micro-organismos do gênero Candida spp são capazes de formar biofilme em cateter devido às características condicionantes do material do dispositivo (por exemplo, superfície coberta com um filme condicionante contendo plaquetas, plasma sanguíneo e/ou proteínas tissulares) (BRITO et al., 2007). A colonização de um cateter pode ocorrer em 24h, em função do filme condicionante produzido pelo hospedeiro. Nos cateteres de curta permanência (menor do que dez dias) o biofilme forma-se na superfície externa, e nos cateteres de longa permanência (mais do que trinta dias) o biofilme forma-se na superfície interna do cateter (BETTIO, 2010) Plasma Elétrico e suas aplicações na Medicina O termo plasma foi pioneiramente empregado na física, para referir-se a um gás parcial ou totalmente ionizado, pelo cientista americano Irving Langmuir em 1929 (LAROUSSI, 2002). O termo ionizado significa que pelo menos um elétron não está ligado a um átomo ou molécula, convertendo-os em íons carregados positivamente. Conforme a temperatura de um ambiente é elevada, as espécies neutras tornam-se mais enérgicas e a matéria é transformada na sequência: sólido, líquido, gás e, finalmente, plasma, o que justifica o fato de ser popularmente denominado de quarto estado da matéria (ALKAWAREEK et al., 2012). Estima-se que mais de 99% da matéria conhecida do universo encontra-se em tal estado. A definição preliminar de plasma está restrita aos plasmas gasosos, que consistem em uma mistura de elétrons, íons e partículas neutras, em neutralidade elétrica (equilíbrio entre as cargas negativas e positivas propriedade conhecida como quase neutralidade) e com certo grau de condutividade elétrica, em contraste com um gás comum, devido à presença de cargas elétricas livres em seus constituintes. Tais cargas são geradas mediante processos de ionização por descargas elétricas, ou por processos de colisão de gases em temperaturas elevadas. Em geral, os portadores de carga negativa em um plasma são os elétrons, enquanto os portadores de carga positiva são os íons (plasma eletropositivo). Todavia, para gases como o oxigênio (O 2 ), por exemplo, ocorre também a formação de um segundo portador de carga negativa, o

20 20 íon negativo, uma vez que estes gases têm uma grande capacidade de capturar elétrons que possuem baixas energias. Este fenômeno é conhecido por captura de elétrons e os plasmas em que este fenômeno ocorre são denominados eletronegativos. Plasmas gasosos ou plasmas elétricos podem ser gerados em pressões atmosférica (760 Torr ou mmhg) ou sub-atmosférica. Dependendo da potência aplicada ao plasma, este pode ser considerado como não-térmico (baixa temperatura, da ordem de ambiente a 1.000ºC) ou térmico (temperaturas acima de 1.000ºC). O uso de plasmas sub-atmosféricos para a área biológica é frequente em esterilização, porém, o custo dos equipamentos (sistema de vácuo, controle de fluxo e pressão etc.) para sua geração é elevado, o que muitas vezes não justifica o investimento. Plasmas atmosféricos reduzem bastante o custo do equipamento uma vez que necessitam apenas do controle do fluxo de entrada do gás e dos parâmetros da fonte de excitação do plasma (como frequência e potência). Um outro parâmetro importante a ser considerado para plasmas atmosféricos é a geometria dos eletrodos. Atualmente diversas concepções tem sido utilizadas como por exemplo descargas de barreira dielétrica (DBD), microplasmas, jatos de plasma e descargas de arco deslizante (gliding arc) (LAROUSSI, 2002). Cada geometria possui uma capacidade de ionização, geração de espécies reativas e de transferência de calor. Cabe ao pesquisador avaliar qual a melhor geometria para uma dada aplicação. Plasmas elétricos são utilizados para inúmeras finalidades dentro da área médica, como: melhorar a biocompatibilidade de materiais (YASUDA; GAZICKI, 1982), tais como lentes de contato, próteses vasculares, cateteres; esterilização de materiais em um período de tempo menor em relação às metodologias convencionais, como autoclavação e exposição ao óxido de etileno, além de utilizações na cicatrização de feridas, coagulação sanguinea, proliferação celular, incisões cirúrgicas, desinfecção local de tecidos, regeneração tecidual, tratamento de doenças de pele e na inativação de biofilmes (BOGAERTS et al., 2002; KONG et al., 2009; LAROUSSI, 2009; MORGAN, 2009) Controle de contaminação Os mecanismos exatos que conduzem a inativação bactericida ou fúngica pela ação do plasma elétrico ainda não são bem compreendidos (LAROUSSI, 2002; ALKAWAREEK et al., 2012). No entanto, acredita-se que vários produtos do plasma têm um papel importante neste processo. Esses produtos incluem espécies reativas de oxigênio (ERO), espécies reativas de nitrogênio (ERN), a radiação UV e partículas carregadas (MA et al., 2008; LAROUSSI;

21 21 LEIPOLD, 2004; GAUNT; BEGGS; GEORGHIOU, 2006). Entre as ERO acredita-se que estão envolvidos neste processo, o ozônio, o oxigênio atômico, superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila (KONG et al., 2009). Embora, muitas das referidas ERO tenham documentado atividades antibactericidas e antifúngicas por meio de suas interações com os diferentes componentes celulares (interação com o DNA, membrana plasmática e organelas celulares), é muito importante considerar os efeitos aditivos e sinérgicos que estas espécies têm umas com as outras e com outros produtos do plasma, como radiação UV e partículas carregadas, em um ambiente física e quimicamente complexo, antes de tirar quaisquer conclusões sobre o(s) responsável(is) pelo processo de inativação celular Cenário atual da pesquisa utilizando plasmas para inativação de leveduras do gênero Candida Nos últimos anos, o número de estudos voltados para a aplicação de plasma no controle de contaminação fúngica utilizando os mais diversos tipos de química de plasma, geometria de descarga e micro-organismos para testes - dentre eles, as leveduras do gênero Candida spp, em especial a Candida albicans, devido à sua importância clínica - têm demonstrado um avanço bastante tímido. Dentre os principais trabalhos pode-se citar o estudo de Koban et al. (2010), que utilizou uma descarga de barreira dielétrica (DBD) de Argônio e Argônio/oxigênio em comparação com o uso de digluconato de clorexidina (0,1%) e hipoclorito de sódio (0,6%), conhecidos agentes microbicidas, no controle de contaminação de biofilme de cepa padrão de C. albicans em substrato metálico (discos de titânio), visando à simulação de contaminação em próteses ortodônticas. O resultado desse estudo demonstrou que o plasma de descarga DBD foi mais eficiente no controle de biofilme de C. albicans do que a clorexidina e o hipoclorito. Em outro estudo, Fantova et al. (2013) avaliou a variação do tamanho do halo de inibição formado em placas contaminadas com cepas padrão de C. albicans em função da distância entre as áreas (2 ou 4 áreas) de aplicação em uma mesma placa. Com os resultados obtidos, verificou-se que a inibição do crescimento fúngico pode ser feita com uma exposição próxima ou distante do micro-organismo em sua forma planctônica; porém, o estudo não conseguiu correlacionar os resultados obtidos com as espécies reativas e a radiação ultravioleta gerada pelo plasma. Em estudo mais recente, Kostov et al. (2014) utilizou um jato de plasma gerado por DBD em pressão atmosférica com hélio, também para avaliar o tamanho do halo de inibição

22 22 formado em placas contaminadas com cepas-padrão e cepas clínicas de C. albicans, em diferentes tempos de tratamento (30, 60, 90, 120, 150 e 180 segundos) e em diferentes distâncias (2.0, 2.5 e 3.0 centímetros). Verificou que com a diminuição da distância das amostras, o tamanho do halo de inibição aumenta; porém, o fluxo de gás pode levar a irregularidades e recortes no ágar e que a interação do plasma com a atmosfera gerou espécies reativas de oxigênio, como o ozônio, que pode ter desempenhado papel fundamental como fator de inativação do micro-organismo. O presente estudo procura incrementar os trabalhos citados anteriormente, visando avaliar fatores como: temperatura, química dos plasmas, quantificação da redução da contaminação e da viabilidade celular, ação do plasma sobre substrato onde o biofilme foi cultivado, comparação entre três composições diferentes de plasma, visto que em nenhum trabalho houve menção, por exemplo, da interferência do fator temperatura de aquecimento promovido pelo tempo de exposição ao plasma sobre a superfície do material biológico (biofilme) ou ao micro-organismo que o compõe.

23 23 3 MATERIAIS E MÉTODOS A metodologia do presente trabalho foi realizada em 5 etapas, conforme sequência ilustrada na figura 1. Figura 1 - Sequência de realização da metodologia. Fonte: A autora. 3.1 Preparação das amostras A cepa padrão ATCC (American Type Culture Collection) de C.albicans (10231) foi cedida pelo Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos (NUFABI) da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade do Vale do Paraíba, mantida e processada no Laboratório de Biotecnologia e Plasmas Elétricos. Foram preparadas suspensões fúngicas da cepa padrão, da ordem 0,5 da escala de Mac Farland (10 6 UFC/ml) em caldo Sabouraud-Dextrose (DIFCO) (VASCONCELOS et al.,

24 ), onde foram inseridas placas de poliuretano (substrato), produzido pela empresa 3R Plásticos, de 2 mm de espessura e área de 2 cm 2, sob condições de esterilidade. As amostras foram divididas em sete grupos, conforme tabela 1. Grupo Substrato Biofilme Tabela 1 Grupos experimentais. Tratado com Tratado Tratado plasma com com plasma Argônio/ Ar plasma Ar comprimido Argônio comprimido Tratado em estufa Tratado com jato de ar quente 1 X 2 X X 3 X X X 4 X X X 5 X X X 6 X X X 7 X X X Fonte: A autora. 3.2 Formação do Biofilme As amostras de poliuretano primeiramente passaram por lavagem com detergente multienzimático da marca 3M, e depois de secas foram inseridas em frascos contendo 15 ml de suspensão fúngica, em cada um, e incubados a 37ºC por 48 horas sob agitação constante de 110 rpm em incubadora shaker modelo MA 420 (Marconi). Em seguida, as amostras foram removidas dos tubos e transferidas para novos frascos contendo tampão fosfato (PBS ph 7,2 ± 0,1) para remover as células não aderidas (adaptado de AL-FATTANI; DOUGLAS, 2006). Todos os ensaios foram realizados em triplicata. 3.3 O sistema de jato de plasma em pressão atmosférica Neste trabalho foi utilizado um reator tipo plasma de arco deslizante, conforme ilustrado na figura 2. Sua geometria permite a exaustão do gás em vortex reverso (SAGÁS, 2009). Os gases utilizados foram: o Argônio (pureza: 99,95%) e ar comprimido seco [gerado por compressor médico-odontológico modelo MSV6-30 (Schulz)]. O fluxo de gás, que deve ser relativamente baixo, de modo a não influenciar na dispersão do biofilme, atravessa todo o volume da descarga elétrica (vide figura 2a), sofrendo modificações por esta e chegando ao substrato (pela região de pós-descarga) contendo não apenas espécies neutras, mas também espécies reativas como radicais metaestáveis e íons. Abaixo do reator foi colocado um porta-

25 25 amostras a uma distância D, que pode ser variada, fato que permite o posicionamento da amostra nas regiões de descarga ou de pós-descarga. Para a geração da descarga foi utilizado um transformador de alta tensão (7.5 kv) de 500 W de potência. Para limitar a corrente e proteger o transformador, foi colocada uma resistência de 1 kω entre o transformador e a fonte de plasma. O propósito desta pesquisa foi investigar a eficiência do plasma frio no controle da contaminação por micro-organismos. Assim, a formação do plasma elétrico em pressão atmosférica deve promover um aquecimento do substrato tal, que não provoque a morte dos fungos por efeito da temperatura. Para isso, serão controlados parâmetros como: distância bocal/substrato, tempo de exposição, fluxo de gás e composição química do plasma. Figura 2 Esquema do equipamento de plasma utilizado nos tratamentos. (a) Esquema da montagem experimental. (b) Foto do equipamento em funcionamento com zoom da pluma de plasma. (b) Fonte: A autora Aplicação e caracterização do plasma elétrico Neste trabalho foram realizados os tratamentos na região de pós-descarga do plasma elétrico, ou seja, as amostras não estavam contato com a pluma de plasma. A aplicação dos plasmas de Argônio/ar comprimido, Argônio e somente ar comprimido foi realizada logo após a lavagem das amostras com PBS. Para a definição dos parâmetros de processo que subsequentemente serão utilizados no estudo da inativação do biofilme, foi realizada inicialmente a medida da temperatura. Para isso foi utilizado um termopar tipo K da marca

26 26 Minipa, acoplado ao sistema, para monitorar a temperatura do fluxo de gás, e para monitorar a temperatura das amostras após o tratamento foi utilizado termômetro infravermelho ScanTemp modelo ST-600 (Incoterm), conforme ilustra a figura 2a. Os resultados desta análise são apresentados e detalhados no tópico 4.1. Após esta análise foram estabelecidas as condições de processo que estão organizadas na tabela 2. Tabela 2 - Parâmetros utilizados na aplicação dos plasmas utilizados neste trabalho. Plasma Argônio + Ar Comprimido Argônio Ar Comprimido Fluxo de Gás 6 l/min + 4 l/min 10 l/min 10 l/min Corrente (ma) 16,3 19,8 13 Tensão (V) Potência(W) Frequência (Hz) Distância bocal/amostra (mm) Tempo (min) Temperatura da amostra após tratamento ( C) Fonte: A autora. Em conjunto com o estudo da temperatura, também foi realizada a análise química do plasma, por meio do uso da técnica de espectroscopia de emissão óptica. Neste trabalho foi utilizado um espectrômetro óptico de emissão UV-VIS OCEAN OPTICS USB4000, com resolução de 1,5 nm, operando na faixa do ultravioleta e do visível. O espectrômetro consiste basicamente de uma fibra óptica que capta a radiação até uma rede de difração que separa a luz em seus diferentes comprimentos de onda. O espectro é obtido por via do programa OOIBase32, que permite determinar o tempo de integração (tempo de captação de radiação para a obtenção de um espectro) e ilustra o espectro medido na tela do computador. O arranjo experimental deste sistema apresenta-se nas figuras 3 e 4.

27 27 Figura 3 - Arranjo experimental para a técnica de espectroscopia óptica de emissão. Fonte: A autora. Figura 4 Imagem da fibra óptica posicionada para obtenção do espectro. Fonte: A autora. As espécies atômicas e moleculares relativas às várias linhas emitidas que constituem o espectro ótico são identificadas por meio de dados da literatura.

28 Técnicas para análise do aquecimento do substrato contaminado Com o intuito de verificar uma possível interferência do fator temperatura nos resultados com tratamento a plasma, visto que conforme já mencionado anteriormente, ocorre um aquecimento do gás inserido no sistema, foram realizados estudos da inativação do biofilme em ambiente aquecido. Estes experimentos são de suma importância na avaliação do efeito que a elevação da temperatura do processo tem sobre o processo de inativação, bem como para evidenciar o efeito que as espécies reativas provenientes do plasma causam sobre o biofilme. Conforme salientado no tópico 2.4.2, na literatura pouco é evidenciado ou detalhado sobre o aquecimento provocado pelo plasma sobre a superfície do material biológico sendo tratado. As amostras de poliuretano contaminadas com biofilme de C. albicans foram submetidas a dois ambientes aquecidos (estufa de cultura e jato de ar quente) pelo mesmo tempo do tratamento a plasma (10 minutos) e após o período, realizado avaliação da viabilidade celular e imagens de MEV Aquecimento em Estufa Para a realização dos testes em ambiente de temperatura controlada, foi utilizada uma estufa para cultura bacteriológica modelo MA 032/3 (Marconi), onde as amostras foram colocadas por 10 minutos nas temperaturas de 40 C, 45 C, 48 C, 50 C e 60 C. Após o tempo determinado, a temperatura das amostras foi aferida utilizando termômetro infravermelho ScanTemp modelo ST-600 (Incoterm) Aquecimento com Jato de ar quente Para simular o fluxo de gás aquecido proveniente do sistema de jato de plasma, foi utilizado um soprador de ar quente do modelo HL 1800E (Steinel) e um termopar tipo K acoplado a um multímetro Minipa para monitorar a temperatura do jato de ar. Para aferir a temperatura da amostra após o experimento, foi utilizado um termômetro infravermelho ScanTemp modelo ST-600 (Incoterm). O aparato experimental utilizado nessa etapa pode ser visto na figura 5.

29 29 Figura 5 Aparato experimental para simulação do ambiente de plasma. Fonte: A autora. 3.4 Análise quantitativa A análise quantitativa do crescimento fúngico foi realizada utilizando as metodologias da determinação da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC/ml) por meio de semeadura por espalhamento (Spread plate), e da determinação do percentual de viabilidade celular utilizando a técnica do Azul de Tripan (0,2%) Spread-Plate Após a aplicação do plasma, as amostras de poliuretano foram colocadas em novos tubos, contendo 5 ml de PBS, e realizou-se o desprendimento do biofilme, utilizando agitador de tubo tipo vórtex, e 0,1 ml desta suspensão foi semeada em ágar Sabouraud-Dextrose, pela técnica de espalhamento, e incubadas a 37ºC por 48 horas, para a determinação das unidades formadoras de colônia (UFC/ml) Avaliação da viabilidade celular Cerca de 0,02 ml da suspensão fúngica, obtida após desprendimento do biofilme, foi acrescida de 0,02 ml de solução de Azul de Tripan 0,2% (diluição 1:1). Desta suspensão foram transferidos 0,01 ml para uma câmara de Neubauer e realizada a contagem das células

30 30 presentes nos quatro quadrantes laterais. As células translúcidas são consideradas viáveis e as coradas em azul são consideradas inviáveis, obtendo-se com isso a porcentagem da viabilidade celular (adaptado de SAAD-HOSSNE; SAAD-HOSSNE; PRADO, 2004). Vide figura 6. O cálculo utilizado para determinação do percentual de viabilidade célular foi: Percentual de células viáveis = n.º de células viáveis nos 4 quadrantes x 100 total de células nos 4 quadrantes Figura 6 Imagem de C.albicans inviáveis (coradas em azul) no teste de viabilidade celular com Azul de Tripan. Aumento de 400x. Fonte: A autora. 3.5 Análise microscópica Para análise microscópica do material, para comprovação da formação de biofilme e visualização de possíveis alterações morfológicas das estruturas leveduriformes presentes, utilizou-se a Microscopia Eletrônica de Varredura e a Microscopia de Força Atômica Microscopia Eletrônica de Varredura As amostras de poliuretano foram colocas em um porta-amostras ( stub ) com o auxilio de uma fita de carbono coloidal, que auxilia na condutividade dos elétrons e foi realizada a metalização da superfície com banho de ouro na metalizadora modelo K550X (Emitech), ilustrado na figura 7, e em seguida procedeu-se à análise em Microscópio Eletrônico de Varredura, modelo EVO MA 10 (Zeiss) do Laboratório de Microscopia

31 31 Eletrônica de Varredura do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraiba, ilustrado na figura 8. Figura 7 Equipamento Metalizador modelo K550X (Emitech). Fonte: A autora. Figura 8 Microscópio Eletrônico de Varredura modelo EVO MA 10 (Zeiss). Fonte: A autora Microscopia de Força Atômica A Microscopia de Força Atômica foi realizada no Laboratório de Plasmas e Processos do Instituto Tecnológico de Aeronáutica, utilizando o equipamento da marca Shimadzu, modelo SPM9500 J3, ilustrado na figura 9.

32 32 As análises foram feitas por modo dinâmico, utilizando ponta de nitreto de silício com constante de mola de 37 N/m, frequência de ressonância de 355 khz e raio nominal da ponta de 10 nm. Figura 9 Microscópio de Força Atômica modelo SPM9500 J3 (Shimadzu). Fonte: A autora.

33 33 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Após realização da metodologia descrita no item 3, os resultados obtidos foram: 4.1 Efeito dos parâmetros de processo sobre a temperatura no substrato Antes de iniciar o processo de tratamento a plasma dos biofilmes sobre substrato de poliuretano, se fez necessária a análise do aquecimento do substrato pelo efluente de gás advindo do jato de plasma. Este efluente pode conter não apenas espécies químicas constituintes do gás neutro, mas também espécies reativas e iônicas geradas pelo plasma, que, ao colidirem com o substrato, transferem sua energia causando uma elevação da taxa de aquecimento do mesmo. Os parâmetros do processo investigados nesta primeira etapa do trabalho foram: distância bocal/substrato, tempo de exposição, fluxo de gás e composição química do plasma. Primeiramente, foi investigado o efeito do tempo de exposição ao plasma. A figura 10 demonstra a variação da temperatura no substrato em função do tempo de exposição dado em minutos para as diferentes composições químicas do plasma utilizadas neste trabalho. Conforme pode-se observar, para os primeiros 3 minutos tem-se um drástico aumento da temperatura, característico de um regime transitório da química do plasma e consequentemente da temperatura de aquecimento do substrato, e para tempos maiores uma saturação da mesma, que corresponde à fase estacionária onde processos físico-químicos de ganho e perda são equalizados. Este fato ocorre para as três químicas de plasma utilizadas. Relativamente à química do plasma, observa-se que plasmas de Argônio puro causam um baixo aquecimento do substrato durante todo o processo, atingindo patamares de temperatura da ordem de 31ºC. Por outro lado, quando é considerado o ar comprimido, observa-se um drástico aumento de patamar da temperatura, registrada em torno de 55ºC (ar, somente) e em torno de 65ºC (para a mistura de Argônio e ar). Este fato ilustra bem o efeito que os radicais gerados em plasmas contendo um fluxo de ar (que é composto de espécies reativas de N 2 e O 2 ) podem causar sobre o substrato a ser tratado.

34 34 Figura 10 Temperatura no substrato em função do tempo de exposição para as diferentes composições químicas do plasma. Temperatura no substrato (ºC) Ar (10 L/min) Argônio (10 L/min) Argônio+Ar (6 L/min + 4L/min) Tempo (min.) Condições fixas: Potência = 32 W (Ar), 14 W (Argônio), 28 W (Ar+Argônio). Fluxo total = 10 l/min. Distância bocal/substrato (D) = 33 mm. Fonte: A autora. Como o processo de saturação da temperatura inicia-se para valores de tempo acima de 3 min para as quimicas de plasma aqui estudadas, foram realizadas análises do efeito da distância bocal/substrato sobre a taxa de aquecimento do substrato. A figura 11 apresenta tais resultados. Foi analisado um range de distância D entre 4 e 55 mm. A temperatura diminui consideravelmente para distâncias acima de 20 mm, tornando possível o tratamento de superfícies e/ou substratos sensíveis à temperatura. No entanto, para o aparato experimental utilizado neste trabalho, para tais distâncias o substrato não está mais imerso no ambiente de plasma (o jato de plasma atinge comprimentos de no máximo 10 mm), sendo exposto somente à chamada região de pós-descarga, que ainda possui uma elevada reatividade química, conforme demonstrado pelos valores de temperatura mensurados. Visando uma otimização do processo, optou-se por escolher uma distância em torno de 30 mm para o estudo do processo de inativação do biofilme, uma vez que as temperaturas após 3 min de processo ficaram entre 30 e 65ºC.

35 35 Figura 11 Temperatura no substrato em função da distância bocal/substrato para as diferentes composições químicas do plasma. Temperatura (ºC) Distância bocal - substrato (mm) Argônio (14 W) Argônio (25 W) Ar (32W) Ar + argônio (28 W) Condições fixas: Fluxo total = 10 l/min. Tempo = 3 min. Fonte: A autora. Um outro parâmetro de processo investigado foi a intensidade de fluxo de gás inserido no reator e consequentemente o efluente incidido sobre o substrato. É sabido que em sistemas de jato de plasma em pressão atmosférica, baixos fluxos de gás causam, além de possiveis instabilidades na descarga elétrica, uma elevação da temperatura do gás advindo do jato de plasma, e com a elevação do fluxo é possivel promover um efeito de refrigeração do(s) eletrodo(s), consequentemente reduzindo a temperatura do gás. Este fenômeno pode ser bem observado na figura 12, que apresenta a temperatura de saturação no substrato em função do fluxo de gás para os plasmas de ar e Argônio. Para o caso do plasma de Argônio, a redução da temperatura é pouco significativa para fluxos acima de 5 l/min. No entanto, para o plasma de ar comprimido, nota-se uma significativa redução (de até 30ºC) quando o fluxo é aumentado de 5 l/min para 10 l/min. Portanto, para este trabalho, foi fixado um fluxo de 10 l/min para o tratamento do biofilme. Salienta-se, ainda na figura 12, que foi escolhida a potência de 14 W para o caso do plasma de Argônio, uma vez que as temperaturas para a distância de 33 mm foram bastante próximas, além de que para o caso de 25 W, a fonte

36 36 trabalha com sua capacidade máxima, causando sobreaquecimento da mesma, para tratamentos acima de 3 min. Figura 12 Temperatura de saturação no substrato em função do fluxo de gás para os plasmas de ar e Argônio. 90 Temperatura de saturação (ºC) Região de instabilidade ar argônio Fluxo de gás (L/min) Condições fixas: Potência = 32 W (ar comprimido), 14 W (Argônio). Tempo = 3 min. Fonte: A autora. Por fim, foi melhor investigado o efeito da química do plasma sobre o aquecimento do substrato. A figura 13 demonstra a temperatura de saturação no substrato, em função da concentração de ar comprimido na mistura Argônio/ar. Nesta figura pode-se observar três regiões distintas de aquecimento do substrato: (i) entre 0 e 60% de ar comprimido, (ii) entre 60 e 90%; e (iii) 90 a 100% de ar comprimido na mistura. Para o caso (i) nota-se que o acréscimo de ar comprimido na mistura do plasma de Argônio/ar causa uma rápida elevação da temperatura de saturação do substrato, atingindo uma variação de temperatura da ordem de 40ºC, onde para o caso de 60% de ar tem-se uma temperatura de saturação da ordem de 70ºC. Esta elevação está associada ao favorecimento da dissociação de espécies do ar por íons de Argônio (LIEBERMAN; LICHTENBERG, 2005). No entanto, quando se eleva a concentração de ar para valores acima de 60% observa-se um decréscimo repentino da

37 37 temperatura do substrato durante o processo. Este fato está relacionado à mudança da química do plasma e consequentemente do fluxo de gás incidido sobre o substrato (caso ii). Para o caso (iii) nota-se uma elevação um tanto tímida da temperatura, novamente devido à mudança da química do plasma. Tais variações da química do plasma serão apresentadas na próxima seção deste capítulo. Figura 13 Temperatura de saturação no substrato em função da concentração de ar comprimido na mistura Argônio/ar. 75 Temperatura de saturação ( C) Região (i) Região (ii) Região (iii) % Ar Comprimido Condições fixas: Potência = W. Fluxo de gás = 10 l/min. Tempo = 3 min. Fonte: A Autora. 4.2 Estudo da química do plasma Quando o jato de plasma é gerado apenas pela inserção de Argônio, só que em pressão atmosférica, espécies do ambiente (tais como N 2, O 2, e umidade) penetram no canal de plasma, embora em pequena proporção, devido ao fluxo contrário. As espécies energéticas do plasma (em sua maioria espécies metaestáveis de Argônio) interagem com as moléculas do ar, formando espécies reativas (O, OH, O 3, NO 2, etc.). Portanto, mesmo quando Argônio puro é usado para gerar o plasma o efluente do jato (região onde o gás de alimentação e o ar atmosférico se misturam) é uma região de elevada reatividade. De fato, em muitos

38 38 tratamentos superficiais a plasma, o alvo é colocado nesta região, conhecida como região de pós-descarga. Portanto, o conhecimento da composição das espécies ativas no efluente do jato de plasma é muito importante para a eficiência da inativação microbiológica (KOSTOV et al., 2014). A figura 14a apresenta o espectro de emissão óptica do plasma medido no início da saída do bocal do sistema de jato de plasma de Argônio. É possível verificar diversas espécies metaestáveis do Argônio (região do vermelho, nm), bem como espécies excitadas do N 2 (região do azul, range de nm). A intensidade das espécies de N 2 é bem mais baixa em comparação com as espécies de Argônio, evidenciando que as reações ocorrem no jato de plasma (cujo comprimento é de no máximo 10 mm) gerado na região fora do bocal. Por outro lado, quando se considera a composição química do plasma de Argônio+ar (6 l/min + 4 l/min), é claramente visto que o espectro mensurado (figura 14b) é dominado por espécies excitadas de N 2. Resultado similar foi observado por Kostov et al. (2014) utilizando um jato de plasma gerado por DBD em pressão atmosférica com gás hélio. As maiores linhas de emissão são correspondentes ao sistema N 2 C 3 Π B 3 Π e a espécie OH (312,6 nm). Não foi detectada emissão de átomos excitados de Argônio no efluente do jato de plasma, confirmando a eficiência de transferência energética das espécies metaestáveis de Argônio para as moléculas de nitrogênio e a subsequente formação de espécies reativas de nitrogênio. Como espécies reativas de O 2 estão também presentes no ar, porém em menor quantidade, a formação de ERO no efluente do jato também é esperado. No entanto, não foram identificadas linhas de emissão características do oxigênio atômico, provavelmente devido à baixa sensibilidade do equipamento utilizado. Nos trabalhos de Ma et al. (2008), Laroussi e Leipold (2004) e Gaunt, Beggs e Georghiou (2006) foi demonstrado que ERO como O e O 3 atacam a membrana celular e são o principal fator para inativação microbiológica em jatos de plasma em pressão atmosférica. Na figura 14c é apresentado o espectro para o plasma de ar puro. Nela observou-se uma característica química muito similar à figura 14b. No entanto, tem-se a vantagem que para tal situação a temperatura de saturação do processo é em torno de 55ºC (vide figura 13). Visando expor um panorama geral da variação das espécies no efluente do jato de plasma, a figura 15 apresenta a evolução dos espectros com a concentração de Argônio na mistura Argônio + ar comprimido. Nota-se que para 90% de Argônio já ocorre uma redução drástica na intensidade dos picos das espécies metaestáveis de Argônio, e para valores maiores praticamente tem-se somente a detecção de espécies de N 2.

39 39 Figura 14 Espectros de emissão dos plasmas de Argônio (a), Argônio+ar (b) e somente ar (c). (a) 2500 N 2 I Ar I 2000 Intensidade (u.a.) OH Plasma argônio (14W) fluxo = 10 L/min (b) Comprimento de onda (nm) N 2 I 2000 OH Intensidade (u.a.) Plasma ar+argônio (28W) fluxo total = 10 L/min Comprimento de onda (nm) (c) N 2 I Plasma ar (32W) fluxo = 10 L/min Intensidade (u.a.) OH Comprimento de onda (nm) Condições fixas: Potência = 32 W (Ar), 14 W (Argônio), 28 W (Ar 40%+Argônio 60%). Fluxo total = 10 l/min. Fonte: A autora.

40 40 Figura 15 Evolução dos espectros com a concentração de Argônio na mistura Argônio + ar comprimido. (a) Plasma argônio 100% (25W) 2500 N 2 I 2000 Ar I Intensidade (u.a.) OH Comprimento de onda (nm) (b) Plasma argônio 90% (30W) OH N 2 I Intensidade (u.a.) NO e espécies de N 2 + Ar I Comprimento de onda (nm) (c) Plasma argônio 70% (30W) OH N 2 I Intensidade (u.a.) Comprimento de onda (nm)

41 41 (d) Plasma argônio 40% (28W) 2500 N 2 I Intensidade (u.a.) OH Comprimento de onda (nm) (e) 2500 Plasma argônio 20% (30W) N 2 I 2000 Intensidade (u.a.) OH Comprimento de onda (nm) (f) Plasma argônio 0% (32W) 2500 N 2 I 2000 Intensidade (u.a.) OH Comprimento de onda (nm) Condições: Potência = W. Fluxo de gás = 10 l/min. Fonte: A autora.

42 42 Um resultado a ser destacado dos espectros na figura 15, é a formação de espécies reativas (como o NO) e ionizadas (N + 2 ), em concordância com o que foi encontrado por SAGÁS (2009), entre os comprimentos de onda de 200 a 300 nm (ultravioleta) para a condição de 90% a aproximadamente 40% de Argônio na mistura ar+argônio. Este fato, em conjunto com os resultados apresentados na próxima seção, demonstram o efeito que espécies reativas tipo ERN e ERO, além da própria radiação UV, tem sobre a inativação do biofilme estudado. 4.3 Análise quantitativa do tratamento a plasma do substrato de poliuretamento contendo biofilme Realizado o diagnóstico do plasma, foram escolhidas três configurações para a análise de suas ações sobre a inativação do biofilme de C. albicans cultivado sobre substrato de poliuretano. Foram escolhidos os extremos da figura 13 e a situação de maior temperatura e considerável concentração de espécies ERN e ERO, ou seja, a condição de 40% de ar comprimido na mistura Argônio+ar. Após a realização da metodologia descrita no capítulo 3, são apresentados na figura 16 os resultados das placas semeadas e incubadas após o tratamento a plasma (grupos 3-5). Também são apresentados para comparação os resultados da amostra de controle (grupo 2). O resultado da análise quantitativa (seção 3.4) apresentado na tabela 3, demonstrou uma redução de 88,13% na contagem de UFC/ml no grupo tratado com plasma de Argônio/ar comprimido e 85,00% e 86,80% de redução nos grupos tratados somente com plasma de Argônio e tratado somente com plasma de ar comprimido, respectivamente. Fato que demonstra que todas as configurações de plasma estudas obtiveram resultados positivos no controle de contaminação microbiana.

43 43 Figura 16 Imagem das placas semeadas e incubadas, conforme metodologia descrita. Fonte: A autora. Tabela 3 Percentual de redução da contagem de UFC/ml. Grupo UFC/ml % de redução Controle Negativo - - Controle Positivo Argônio / Ar comprimido ,13 Argônio ,00 Ar comprimido ,80 Fonte: A autora. A técnica da viabilidade celular utilizando Azul de Tripan demonstrou que no grupo tratado com plasma de Argônio/ar comprimido o percentual de viabilidade celular após o tratamento foi de 8% e nos grupos tratado com plasma de Argônio e tratado com plasma de ar comprimido foi de 33% e 12%, respectivamente, sendo que no controle positivo (grupo nãotratado) a viabilidade foi de 100%, conforme tabela 4.

44 44 Tabela 4 Percentual de Viabilidade Celular. Grupo % Viabilidade Controle Negativo - Controle Positivo 100 Argônio / Ar comprimido 8 Argônio 33 Ar comprimido 12 Fonte: A autora. O percentual de redução de UFC/ml e o percentual de viabilidade, são métodos in vitro, quantitativos, para analisar a efetividade de um determinado processo de controle microbiano, quer seja químico ou físico. Os métodos in vitro aqui utilizados apresentaram algumas vantagens, como: limitar o número de variáveis experimentais, obter dados significativos mais facilmente, além de o período das análises ser, em muitos casos, relativamente rápido. Neste estudo, pode-se observar que o jato de plasma, com ou sem suas combinações, apresentou cerca de mais de 80% de eficiência no controle das colônias de leveduras analisadas e o teste de viabilidade celular, após os tratamentos propostos, demonstrou que as células levedurifomes, média de apenas 18% apresentaram-se viáveis, ou seja, capazes de se multiplicar e originar novas células, demonstrando assim, que cerca de mais de 80% apresentaram morte celular. Estes dados corroboram com o teste anterior para a validação dos métodos de controle da cepa de Candida albicans, pelo plasma de Argônio e/ou ar comprimido utilizados. Portanto, a técnica de viabilidade celular mostra um panorama mais real da ação do plasma sobre o biofilme, permitindo assim melhor avaliar o efeito das químicas de plasma investigadas neste trabalho. 4.4 Resultados de microscopia dos substratos antes e após tratamento com jato de plasma No que se refere à análise qualitativa ou visual das amostras dos grupos de 1 a 5, os resultados podem ser vistos na figura 17, que apresenta micrografias de MEV e AFM para cada amostra analisada. Aqui, as imagens de MEV estão em magnitude de 1500x com escala de 20μm e as imagens de AFM com uma área de 60 x 60 μm e escala de 20μm. Somente para

45 45 o caso do substrato de poliuretano é que foi utilizada uma escala de 2μm, de modo a melhorar a visualização da morfologia da amostra. Figura 17 Comparativo das imagens de MEV e AFM. Fonte: A autora.

46 46 De um modo geral pode-se confirmar que a superfície do substrato é consideravelmente lisa, possuindo uma rugosidade RMS da ordem de 22 nm. Também pôdese verificar que houve um bom preenchimento da superfície do substrato pelo biofilme (figura 17, grupo controle positivo). Conforme salientado no capitulo de revisão bibliográfica, este tipo de microrganismo possui a característica de formar hifas (estrutura filamentosa). As estruturas arredondadas observadas nas imagens da figura 17, que contém o biofilme, correspondem às células da C. albicans. Adicionalmente, observou-se a presença de artefatos cristalinos nas imagens das amostras dos grupos tratados com plasma de argônio e tratado com plasma de ar comprimido da figura 17, conforme destacado em vermelho na figura 18. Visando sua identificação, foi realizada a análise por Espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDS) e pôde-se constatar que estes artefatos são cristais de cloreto de sódio (NaCl) provenientes do processo de lavagem das amostras. Figura 18 - Espectroscopia de raios X por dispersão em energia de artefatos encontrados nas amostras. Fonte: A autora. Com relação à ação do plasma sobre a estrutura do biofilme, pôde-se observar, comparando-se as micrografias dos grupos tratados com as 3 diferentes composições de plasma, uma considerável mudança, não somente na estrutura, mas também da área preenchida pelo biofilme sobre o substrato de poliuretano. Portanto, pode-se afirmar que em todas as amostras tratadas por plasma houve uma perda de massa nas hifas. Com relação à química do plasma, de acordo com os testes de viabilidade celular, o plasma de Argônio/ar comprimido mostrou-se mais efetivo na inativação do biofilme e foi possível observar este resultado na figura 17 que mostra as estruturas filamentosas mais

47 47 compactas e com uma considerável redução das células de C. albicans, quando comparadas com o controle e com as amostras tratadas com plasma de Argônio e plasma de ar. Certamente, as espécies reativas do plasma tiveram um efeito catalizador nas reações de inativação destes microrganismos, mesmo estando em uma organização de biofilme. Para o caso do plasma de Argônio, é possível observar na figura 19 que as células leveduriformes de C. albicans apresentam sua estrutura alterada, não mais apresentando a forma ovalada característica e apresentando uma espécie de descamação da membrana, provavelmente causados pelas espécies reativas características deste tipo de plasma. Um resultado bastante similar foi apresentado por Koban et al. (2010) utilizando descargas tipo DBD. No entanto, pouca explicação foi apresentada na ocasião, bem como não foi informada a temperatura do processo. Figura 19 Imagem do biofilme tratado com plasma de Argônio. Magnitude de 5000x. Fonte: A autora. Um outro ponto a ser discutido é a influência do plasma sobre o substrato que contém o biofilme. Devido a possíveis efeitos de aquecimento ou até mesmo corrosão do material

48 48 polimérico, se fez necessária a avaliação da integridade deste substrato visando uma possível aplicação deste tipo de técnica em processos de esterilização. Desta forma, realizou-se também a aplicação dos diferentes plasmas sobre os substratos de poliuretano, a fim de verificar por meio de técnicas como MEV e AFM, a presença de qualquer alteração morfológica do mesmo. A figura 20 ilustra a morfologia da superfície do substrato de poliuretano sem tratamento e tratado com os três tipos de plasma. Nas imagens de AFM podese observar uma redução da rugosidade do material com o plasma, provavelmente devido à ação de espécies de oxigênio, que são agentes que promovem o efeito de corrosão de materiais poliméricos. Para melhor evidenciar o efeito do oxigênio, é apresentada na figura 21 a rugosidade RMS para as imagens apresentadas na figura 20. Nota-se que para o caso em que se tem a inserção de ar comprimido no plasma, as rugosidades RMS ficaram da ordem de 9,3 nm, enquanto que para o plasma de Argônio puro a rugosidade foi de 14,6 nm. Portanto, plasmas contendo uma alta concentração de oxigenio são efetivos no processo de inativação, porém, podem causar uma mudança na rugosidade e provável perda de massa do material polimérico tratado.

49 49 Figura 20 Imagens de AFM e em 3 dimensões (3D) do material tratado com os diferentes plasmas. Fonte: A autora.

50 50 Figura 21 Rugosidade RMS extraída das imagens de AFM da figura 20. Fonte: A autora. 4.5 Efeito do aquecimento do biofilme/poliuretano: experimentos utilizando estufa e jato de ar quente. Um ponto importante quando é proposto o tratamento de materiais biológicos por tecnologia de plasmas, em especial de plasmas atmosféricos, é o aquecimento promovido sobre o material durante o tempo de exposição ao plasma ou à região de pós-descarga. Conforme apresentado na figura 11, as temperaturas medidas na superfície do material para diferentes químicas de plasma podem atingir valores acima de 100ºC, fato este que provavelmente já seria motivo da destruição do material biológico. Em contrapartida, a temperatura de superfície não possui o mesmo efeito que a temperatura no volume, uma vez que o processo de resfriamento superficial é mais rápido que o processo de resfriamento do volume do material. Nesta temática fica a pergunta: A ação do aquecimento pelo efluente do jato de plasma é um dos principais fatores no processo de inativação dos micro-organismos? Esta questão será abordada nesta seção. Tendo em vista evidenciar o efeito reativo do plasma sobre o processo de inativação, foram realizados dois experimentos distintos de aquecimento das cepas de C. albicans: (i) em estufa com temperatura controlada, visando ao aquecimento do volume como um todo; e (ii)

51 51 em jato de ar quente, visando ao aquecimento superficial da amostra, porém, sem a ação das espécies geradas pelo plasma. Os resultados do experimento utilizando a estufa de cultura são apresentados na tabela 5, e a imagem do biofilme tratado em ambiente de 60ºC, na figura 22. Tabela 5 - Resultados obtidos após experimento em estufa. Temperatura inicial Temperatura da Temperatura da amostra da amostra ( C) estufa ( C) após tratamento ( C) % Viabilidade Fonte: A autora. Figura 22 Imagem de MEV da amostra colocada em estufa a 60 C. Magnificação de 1500 e 5000x. Fonte: A autora. Os resultados do experimento utilizando o jato de ar quente estão apresentados na tabela 6, e a imagem do biofilme tratado com aquecimento superficial de 60ºC, na figura 23.

52 52 Tabela 6 - Resultados obtidos após experimento com jato de ar quente. Temperatura inicial Temperatura do jato Temperatura da amostra da amostra ( C) de ar quente ( C) após tratamento ( C) % Viabilidade Fonte: A autora. Figura 23 Imagem de MEV da amostra submetida ao jato de ar quente a 60 C. Magnificação de 1500 e 5000x. Fonte: A autora. Os experimentos de aquecimento das amostras, tanto em estufa quanto com jato de ar quente, mostraram que, apesar do ambiente estar com temperatura elevada, as mudanças da estrutura da hifa e também das células de C. albicans foram mínimas, conforme apresentam os resultados de MEV nas figuras 22 e 23. Porém, os resultados de viabilidade celular

53 53 apresentados nas tabelas 7 e 8 demonstram que houve inativação celular devido ao aquecimento do biofilme. Para melhor ilustrar os resultados apresentados anteriormente, a figura 24 apresenta imagens das placas contaminadas com C. albicans após o aquecimento em estufa e com jato de ar. Estes resultados, quando comparados com os obtidos pelo processo a plasma, evidenciam a ação das espécies do plasma sobre o biofilme. Figura 24 Imagem das placas contaminadas com C. albicans após realização do aquecimento em estufa e com jato de ar. Fonte: A autora. Em uma análise mais detalhada, por meio da comparação dos resultados de viabilidade celular obtidos após os tratamentos com as três diferentes composições de plasma, com o aquecimento em estufa e com jato de ar quente, é possível observar que no tratamento com plasma de Argônio/ar, que se manteve com temperatura de saturação após 3 min de processo em uma temperatura média da ordem de 65 C, o percentual de viabilidade celular foi de 8%, enquanto que com o jato de ar quente (aparato experimental que melhor simulou as condições de aquecimento do ambiente de plasma) na temperatura de 60 C, a viabilidade foi de 27%. No caso do experimento, utilizando a estufa em 60 C, a viabilidade celular foi de 10%, valor muito próximo ao obtido com o tratamento com plasma de Argônio/ar; porém, é necessário levar em consideração que a estufa de cultura bacteriológica é um equipamento que proporciona um ambiente fechado e com temperatura controlada, onde todo o interior permanece em uma temperatura aproximadamente isotrópica. Portanto, é válida a consideração dos resultados do jato de ar quente para comparar com os resultados da viabilidade celular. A figura 25 apresenta um comparativo entre a viabilidade celular e a temperatura para os diferentes processos analisados.