UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 6- Biotecnologia Vegetal Marcadores Moleculares Prof a. Renata Faier Calegario
INTRODUÇÃO Marcadores Características que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares (BORÉM, 997).
Aplicações: diversas áreas do conhecimento Melhoramento Genética mendeliana Genética de populações Marcadores Genéticos Genética molecular Organização do genoma Sequenciamento Transferência gênica
Fenótipo Características visíveis de um indivíduo Sofre influência: ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Genótipo Fatores ambientais Genótipo Constituição genética de um organismo => o conjunto de genes
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos Local ocupado pelo gene no cromossomo Haplóide Diplóide
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos
DOMINÂNCIA Gene Recessivo Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa) Presente em dose dupla (dois alelos iguais) Gene Dominante Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose (AA) e heterozigose (Aa)
MARCADORES DOMINANTES A A A A 2 A 2 A 2 Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose => exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto
MARCADORES DOMINANTES Resultados são codificados matriz de dados binários (presença/ausência) L L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 2 3 4 5 6 7 8 9 Ind. L L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 2 3 4 5 6 7 8 9 Interpretada por análise estatística e softwares (Genes, Statistica, etc) Gera índices de similaridade e distância genética
MARCADORES CO-DOMINANTES A A A A 2 A 2 A 2 Genes no mesmo locus Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose => Expressão de ambos os alelos no heterozigoto
MARCADORES CO-DOMINANTES Resultados são codificados matriz de coincidência alélica 2 3 4 2 3 4 5 6 7 8 9 Ind. 2 3 4 5 6 7 8 9 Linha /3 3/4 2/3 3/3 /3 / /3 /4 3/3 /2 Interpretada por análise estatística e softwares (Genes, Statistica, etc) Gera índices de similaridade e distância genética
TIPOS DE MARCADORES Marcadores Morfológicos Características fenotípicas do organismo Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala ou morfologia foliar Marcadores Bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex. isoenzimas e proteínas Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR Reprodutibilidade Amplamente distribuído através do genoma Poder de discriminação Ausência de influências ambientais Barato Fácil de mensurar
MARCADORES MOLECULARES Vantagens Não sofre influência do ambiente Neutros em relação a efeitos fenotípicos N ilimitado de marcadores e de polimorfismo Desvantagens Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos
TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares Eletroforese Eletroforese Enzimas de restrição Restrição PCR Termociclador PCR
CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES A partir 98... Varia de acordo com a técnica RFLP Restrição e Hibridização de sequências DNA RAPD, Microssatélites PCR AFLP PCR + restrição
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfirmo no tamanho de fragmentos de restrição Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição Examina diferenças no tamanho de fragmentos de restrição de DNA Polimorfismo: resultado de mutação pontual, inserção, deleção Requer conhecimento sequência
RFLP Hibridização Southern Blot
RFLP - METODOLOGIA. DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos: Eletroforese 3. Transferência para a membrana e Hibridização com sonda 4. Visualização dos fragmentos na membrana sondas marcadas ( 32 P) ou Fluorescência 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada
ANÁLISE DOS RESULTADOS
Homozigotos para alelos A - (3, 5, 6, 7, 8, 9) Homozigotos para os alelos A2 - (, 2,4)
RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate + T + T + T + T + T + T Fragmentos que hibridizarem com a sonda + Grupo 6 SrIII Fonte: Mello et al., 27.
RFLP Vantagens Reprodutível Marcadores co-dominantes Simples Desvantagens Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Fragmentos de DNA amplificados por PCR Método mais rápido para detecção de polimorfismos DNA genômico amplificado por PCR Uso de um único primer aleatório (8- bases): função de R e F Marcador dominante
RAPD - METODOLOGIA. DNA é amplificado via PCR com primer aleatório = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por eletroforese 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas
RAPD - METODOLOGIA A B A B
PRIMERS ALEATÓRIOS DNA Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos) Quando se anela em direções opostas = Amplificação Anelamento em pequenas distâncias Vários Fragmentos
RAPD - Feijoeiro Fonte: Moura, 25 Não Resistentes à raça 65 marcador ligado à Co- Ausência banda 53pb = Resistentes Co- = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum
RAPD Vantagens Rápido e simples - não envolve hibridização Baixo custo Sem uso de radioisótopos Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA Desvantagens Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos Problemas de interpretação: co-migração - mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro! - uma banda: um fragmento? Pode ser dois! Fonte: IPGRI
MICROSSATÉLITES Pequenas sequências com a 4 nucleotídeos, repetidas em tandem (em sequência) Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC Dinucleotídeos Trinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC Amplificadas por PCR Marcador Co-dominante Maior grau de polimorfismo Requer conhecimento prévio da sequência
MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA. Digestão DNA Enzimas de Restrição 2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor 3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas com sequências repetidas) 4. Sequenciamento dos clones 5. Desenho dos primers
MICROSSATÉLITES cada ilha microssatélite constitui um locus, multialélico Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus
DETECÇÃO DE LOCUS SSR Simple Sequence Repeats = Microssatélites (CA) 3 CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT (CA) 3 Amostra Amostra 2 Amostra 3
MICROSSATÉLITES Marcador multialélico Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus) Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo
MICROSSATÉLITES Marcador Co-dominante M homozigoto heterozigoto Gel de poliacrilamida ou agarose de alta resolução Perceber diferenças de nucleotídeos
MICROSSATÉLITES Vantagens Reprodutibilidade Requer pequena quantidade de DNA Baixo custo Grande poder de resolução Alto nível polimorfismo útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade Desvantagens Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (sem primers aleatórios) Trabalhoso Porém: uma vez desenvolvido é fácil Caro
Atributos Isoenzimas Proteínas de sementes RFLPs RAPDs Microssatélites AFLPs Nível de baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta alta alta alta ambiental Número de locos moderado (<5) baixo (<) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por 2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2 loco Distribuição no regiões de cópia regiões de cópia várias ao acaso ao acaso ao acaso genoma única única Acessibilidade muito alta muito alta média muito alta muito baixa média tecnológica Aplicabilidade no melhoramento rápido, baixo custo rápido, baixo custo lento, custo médio rápido, baixo custo lento, custo alto rápido, custo baixo Identificação de baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta genótipos Avaliação de média baixa alta alta alta muito alta germoplasma Mapeamento baixa muito baixa alta alta muito alta alta genético Mapeamento de baixa inadequado média muito alta média muito alta regiões específicas Mapeamento baixa inadequado muito alta baixa alta baixa comparativo Genética de baixa baixa média alta muito alta muito alta Autógamas Genética de média baixa média alta muito alta muito alta Alógamas Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (993) e Ferreira & Grattapaglia (995).
Fingerprints = impressões digitais de DNA => perfis genéticos únicos de elevada precisão e reprodutibilidade
APLICAÇÕES Diversidade genética de organismos Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de qualquer outra variedade da mesma espécie Análise da pureza genética de semente Mapeamento de genes e características (associação do marcador com os genes de interesse) Impressão digital do DNA identificação de padrão único de combinação alélica (identificação de cultivares e organismos) Seleção de genitores Retrocruzamento assistido...
BIBLIOGRAFIA. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares Viçosa, MG, 26 2. Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA Cerrados, Planaltina, DF, 27. 2. Luciano Arruda Ribas Variabilidade isoenzimática e sistema de cruzamento de Parapiptadenia rigida em um pomar de sementes. Tese de mestrado, UFV, 999. 3.http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicosextras/marcadores-moleculares/