Análise de Imagens: Método Alternativo de Mensuração do Comprimento de Plântulas para testes de vigor Image Analysis: Alternative Method of seedlings length measurement for vigor tests Marcos Pinheiro Vilhanueva 1,Amaury Antonio de Castro Jr 2, Elisângela Silva da Cunha Rodrigues 3, Fabrício Augusto Rodrigues 4 1 Departamento de Informática, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil, marcos.vilhanueva@ifms.edu.br 2 Departamento de Informática, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Ponta Porã, Mato Grosso do Sul, Brasil, amaury.junior@ufms.br 3 Departamento de Informática, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Ponta Porã, Mato Grosso do Sul, Brasil, elisangela.rodrigues@ufms.br 4 Departamento de Informática, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Ponta Porã, Mato Grosso do Sul, Brasil, fabricio.rodrigues@ufms.br RESUMO Para verificar se uma semente é de boa qualidade, destacam-se os testes de vigor. Um dos testes de vigor mais simples e utilizados por pesquisadores da área é o de comprimento de plântulas, que consiste da aferição manual do comprimento de sementes germinadas. As sementes são mantidas em um germinador, durante 7 dias e, depois, retiradas e medidas com uma régua. Dessa forma, o processo torna-se trabalhoso e custoso para grandes lotes de sementes. Nesse contexto, este trabalho apresenta um método alternativo e automatizado, que faz uso de técnicas de processamento e suavização de imagens, bem como de um método de extração de contornos. Além das técnicas de processamento de imagens utilizadas, foi desenvolvido o protótipo de um dispositivo para captura de imagens das sementes germinadas. As imagens obtidas são tratadas e analisadas pelo software, através das técnicas implementadas, para obtenção do comprimento da plântula a partir da imagem. Além da aplicação de técnicas de processamento de imagens em problemas da agricultura, o método proposto é inovador, pois torna o processo de aferição mais rápido, preciso e menos custoso, quando comparado ao método manual. PALAVRAS-CHAVE: sementes, limiarização, visão computacional.
ABSTRACT To verify that seeds have good quality, there are the vigor tests methods. One of the simplest and more used vigor tests used by researchers is the seedling length, that consists of manual measurement of length of germinated seeds. The seeds are kept in a germination chamber for 7 days and then removed and measured with a ruler. This process becomes complicated and expensive for large batches of seeds. Thus, this work presents an automated alternative method, which uses techniques os processing and smoothing of images and a contour extraction method. In addition to image processing techniques it has been developed a device to capture images of germinated seeds. The obtained images are processed and analyzed by software, through the techniques implemented to obtain the length of the seedling from the image. Besides the application of imaging techniques in agricultural problems, the proposed method is innovative because it makes the process of measurement faster, accurate and less costly compared to the manual method. KEYWORDS: seed, thresholding, computer vision. INTRODUÇÃO A semente possui grande utilidade para o ser humano, desde a descoberta de sua capacidade de plantio e reprodução da mesma espécie. A revolução industrial estimulou uma evolução na produção e armazenamento de sementes, em razão da concentração urbana, do aparecimento de novas cidades, o aumento da expectativa de vida humana e de outros fatores, que demandam o aumento de produção de alimentos. Em paralelo surgiu a necessidade da criação de órgãos para verificar a qualidade das sementes produzidas, evitando as fraudes e outros problemas que pudessem afetar a produção e a saúde das pessoas. Nesse contexto, surgiram os laboratórios de sementes, com regras e manuais para verificar a qualidade das mesmas. Esta qualidade pode ser conceituada como o conjunto dos atributos genéticos, físicos, fisiológicos e sanitários que influenciam a capacidade de originar plantas com maior produtividade. O teste de germinação é o meio para se avaliar a qualidade das sementes, mas tem limitações por fornecer resultados que superestimam o potencial fisiológico das sementes e por ser realizado em um ambiente ideal e artificial (CARVALHO e NAKAGAWA, 2012) (MENEZES, 2007). Para complementar as informações do teste de germinação criou-se o conceito de vigor. A Association of Official Seed Analysts (AOSA,1983), definiu o vigor de sementes como sendo as propriedades que determinam o potencial para uma emergência rápida e uniforme e para o desenvolvimento de plântulas normais, sob uma ampla faixa de condições ambientais.
Vários testes de vigor foram desenvolvidos procurando precisar o comportamento de lotes de sementes, em campo, com dados obtidos em laboratório. Os testes de vigor são utilizados para diferenciar os níveis de vigor entre os lotes de sementes. Esses testes são classificados em métodos diretos e indiretos. Os diretos procuram simular as condições (às vezes adversas) que ocorrem no campo e os indiretos procuram avaliar atributos que, indiretamente, se relacionam com o vigor (físicos, biológicos e fisiológicos). Os testes indiretos se dividem em fisiológicos e bioquímicos. Neste trabalho, são estudados os fisiológicos, que avaliam aspectos da germinação e crescimento da plântula. Entre os testes de vigor que podem ser feitos com a semente tem-se: velocidade de germinação, primeira contagem do teste de germinação, comprimento da plântula, peso da massa seca da plântula e classificação do vigor das plântulas, que são realizados em condições laboratoriais e percentagem de emergência de plântulas, velocidade de emergência de plântulas, altura de plântula e peso da massa fresca da plântula, que são realizados em campo. Um dos testes indiretos que tem grande vantagem em relação aos demais, por ser relativamente rápido, com boa precisão e com custo muito reduzido, é a medida do crescimento de plântulas, que é realizado com uma régua. No entanto, este teste torna-se inviável para uma grande quantidade de sementes, pois exige trabalho manual extenso. As características de um teste de vigor são: simplicidade, rapidez, baixo custo, objetivo, reproduzível e com resultados relacionados com a emergência das plântulas em campo (NAKAGAWA, 2009) (MARTIN, 2012). Segundo Carvalho e Nakagawa (2012), apesar de diversos estudos que buscam a padronização dos testes de vigor, são encontradas certas dificuldades em função de que o vigor pode ser refletido através de várias características, como velocidade de germinação, uniformidade de emergência, resistência ao frio, temperatura e umidade elevadas, substâncias tóxicas, entre outros. Mcdonald (1975) classificou e incluiu novos métodos de análise de sementes, como testes físicos, fisiológicos, bioquímicos e de resistência. Vários testes de vigor têm sido desenvolvidos, aprimorados e utilizados com o objetivo de estimar a qualidade fisiológica das sementes. Na Tabela 1 são apresentados os testes de vigor mais utilizados. Este trabalho propõe o desenvolvimento de um produto composto por software e hardware (midleware) para a análise do vigor das sementes através do comprimento da plântula, trazendo agilidade e precisão ao processo manual. O sistema fará o processamento das imagens das plântulas para determinar seu vigor. Comprimento de plântulas
Este teste tem como base o crescimento das sementes. As que crescem mais são consideradas mais vigorosas, pois originam plântulas com maior taxa de crescimento, em função da maior translocação das reservas dos tecidos de armazenamento para o crescimento do eixo embrionário. As plântulas depois de germinadas são medidas com uma régua e suas medidas expressas em centímetros. Tabela 1: Tabela descritiva dos testes de vigor. teste de vigor objetivo tipo Envelhecimento acelerado Colocar sementes sob estresse de temperatura e umidade Condutividade elétrica Avaliar a quantidade de eletrólitos que é liberada pelas sementes embebidas em água Frio Comprimento plântulas Massa seca de Testar as sementes em condições adversas de excesso de água e baixas temperaturas Testar o crescimento das plântulas da semente Extrair toda a água da plântula através de um aquecimento controlado em laboratório e depois pesar a massa seca Resistência Bioquímico Resistência Fisiológico Fisiológico Atualmente, o testes de comprimento de plântulas estão sendo bastante empregados nos laboratórios de análise de sementes, por apresentarem baixo custo, serem rápidos, não necessitarem de equipamentos especiais, nem demandar treinamento específico sobre a técnica empregada. A metodologia básica para a obtenção do comprimento de plântula é a utilização de dez a vinte sementes colocadas em uma ou duas fileiras, no substrato por repetição, sendo utilizadas, geralmente, quatro repetições. O procedimento pode ser realizado em rolos de papel ou em caixas próprias para a germinação. Se for feito nestas caixas, ela deve ser mantida a um ângulo de 45º ou mais com a bandeja do germinador. Depois de preparadas, as sementes são colocadas na câmara de germinação, na temperatura recomendada para cada espécie a ser testada. A escolha da estrutura adequada para avaliação é importante para ter-se resultados consistentes e comparáveis. Segundo Nakagawa (1999), o comprimento médio da plântula ou da(s) sua(s) parte(s) eleita(s) é obtido somando as medidas tomadas de cada plântula normal, em cada repetição e dividindo, a seguir, pelo número de plântulas normais mensuradas. Os resultados são expressos em milímetros ou centímetros, com uma casa decimal. A temperatura deste teste deve ser bem controlada, já que é um teste minucioso e pequenas diferenças podem ser
consideráveis no momento da avaliação. O escalonamento das amostras colocadas no germinador deve ser de intervalo de tempo pequeno entre a primeira e a última amostra. MATERIAL E MÉTODOS Na pesquisa sobre o crescimento de plântulas, as sementes de milho e soja foram escolhidas por terem um crescimento mais uniforme e retilíneo, além da sua importância econômica e agronômica. A análise da imagem destas sementes, por este método, torna-se mais rápida e passível de implementação através de um software e este pode fazer o tratamento da imagem extraindo o comprimento da plântula. O hardware é composto de uma camera na parte superior e uma local na parte inferior do tamanho de uma folha de papel A4, onde serão colocadas as sementes. Para entender, com detalhes, o teste de comprimento de plântulas, foram realizados experimentos com a supervisão de um pesquisador da área. A realização deste teste consiste em 8 repetições de 10 a 12 sementes que são colocadas em rolos de papel para germinação. Para o preparo do rolo são usadas três folhas, duas sob as sementes e uma cobrindo-as. Elas deverão ser umedecidas com água destilada com a quantidade de duas vezes e meia o seu peso. O processo de verificação do vigor é feito com uma régua e se dá da seguinte maneira: a raiz e a parte aérea das plântulas são medidas separadamente, que serão utilizadas posteriormente para o cálculo da média. Este será realizado somando-se todas as medidas da parte aérea e dividindo pelo número de sementes normais, anormais e mortas. O mesmo procedimento é realizado com as medidas da raiz. Processamento de imagens digitais Segundo Gomes (2001), o Processamento e Análise Digital de Imagens (PADI) é uma ferramenta relativamente recente que cresce acompanhando o desenvolvimento dos recursos computacionais. Consiste na utilização de operações matemáticas para alterar os valores dos pixels de imagens digitais, modificando-as, para facilitar sua visualização e/ou para proceder à extração de dados quantitativos. O PADI pode ser descrito em três etapas básicas que são: aquisição, PDI (Processamento Digital de Imagens) e ADI (Análise Digital de Imagens). A primeira é a aquisição da imagem que vai ser processada, que pode ser feita de forma digital ou analógica, e neste caso precisa passar por um processo de digitalização. A segunda é composta pelo pré-processamento, segmentação e pós-processamento, que tem como saída uma imagem processada e trabalhada diretamente sobre os seus pixels. A última é a extração
de atributos, reconhecimento de padrões e classificação, que constitui a fase quantitativa do processo. Toda imagem digital é representada por uma matriz de pixels (abreviação de picture element), que é a cor de um ponto na imagem. A resolução da imagem pode também ser definida, de forma imprópria, pelo seu tamanho, ou seja, pelo número de pixels por linha e por coluna. Um outro conceito da imagem digital é o histograma, que faz uma representação gráfica da função de distribuição dos tons de cinza dos pixels da imagem e fornece uma descrição global da aparência da imagem, mas nada diz sobre seu conteúdo. Apesar disto, os histrogramas possuem informações cruciais para o processamento digital de imagens. Um exemplo do uso de histrogramas é a retirada automática do fundo da imagem e que foi utilizado neste trabalho. Conceituado a imagem digital e levando em conta que a imagem já foi adquirida, serão descritos em detalhes o PDI e a ADI. De acordo com Gomes (2001), o pré-processamento é composto por vários procedimentos: manipulação do brilho, expansão do contraste, correção de iluminação irregular, redução de ruídos e realce de bordas. As duas grandes categorias desta fase são os procedimentos realizados no domínio do espaço real e das frequências. A segmentação tem como objetivo reconhecer regiões de uma imagem com objetos. Para isto ela divide uma imagem em regiões distinguindo-as como objetos independentes deles mesmos e do fundo da imagem. No caso de diferenciar objetos de um fundo, pode-se ter uma imagem binária com fundo representado pela cor preta e os objetos pela cor branca. De acordo com Gomes (2001), a segmentação costuma ser a etapa crítica da sequência padrão de PADI, pois é através dela que se reconhece e se identifica os objetos de interesse, sobre os quais será feita a análise. No entanto, muitas vezes o resultado da segmentação não é adequado, sendo necessária, para se corrigir as imagens binárias resultantes da segmentação, a aplicação de procedimentos de pós-processamento, como a separação de objetos que se tocam ou o agrupamento de objetos para formar objetos mais complexos. A extração de atributos, segundo o mesmo autor, é a etapa da sequência padrão onde se inicia a análise da imagem. Nela são realizadas medidas sobre a imagem segmentada e/ou sobre a imagem em tons de cinza, extraindo-se atributos característicos. Solução desenvolvida Para que o teste de vigor através do comprimento de plântulas seja feito de forma automática é necessário desenvolver um sistema que captura a imagem da plântula, faz o seu processamento, separando o fundo da imagem e das plântulas e finalmente verifique o
tamanho de cada uma delas em centímetros. Para fazer isto, foi projetado um sistema constituído de uma estrutura de isopor, cuja parte superior será utilizada para colocação de uma câmera e uma fonte de luz. Essa caixa será utilizada para a captura da imagem das plântulas que serão colocadas dentro dela. Através da análise dos contornos das plântulas elas são separadas e depois medidas. Para estimar o tamanho da plântula a partir da imagem, é realizada a aferição do comprimento utilizando-se, como parâmetro, uma marcação especial, com 1cm de comprimento, fixada no canto superior esquerdo da caixa e, portanto, capturada juntamente com a imagem das plântulas. A marcação servirá como referência nas imagens para o cálculo e a determinação da proporção de tamanho de cada pixel em relação à imagem da plântula. Dessa forma, é possível determinar o comprimento total da plântula através do número de pixels de seu contorno, identificado na imagem. Por exemplo, se cada pixel corresponde à 0,01cm na imagem capturada, basta multiplicar o número de pixels do contorno da plântula para obtermos seu o comprimento total. Durante a pesquisa, foi encontrado um programa que realiza a segmentação por limiarização desenvolvido na linguagem C e usa a biblioteca opencv (PISTORI et al, 2013). O programa isola um objeto pela composição de sua cor do resto da imagem da seguinte forma: primeiro ativa a câmera do computador e inicia a captura de quadros da imagem, que são processados de acordo com valores máximos e mínimos das cores RGB (Red, Green, Blue) que podem ser configurados em um painel do programa. Compreendido o funcionamento do programa de limiarização, foram realizadas modificações no código para atender as necessidades do sistema, tomando o cuidado de não perder a característica de separação do fundo da imagem. No primeiro teste, realizado com uma imagem da internet, foi possível separar o fundo das plântulas e estas entre si. Este resultado foi excelente, mas no segundo teste, com uma imagem de fundo azul, não foi possível a separação. Depois de alguns ajustes e modificações no programa, foi possível retirar o fundo, deixando somente as plântulas. Nestas imagens as plântulas não ficam totalmente separadas (Figura 1), podendo uma invadir a região da outra no sentido vertical, o que dificultou a separação delas com o algoritmo desenvolvido. O sistema foi refatorado, usando-se a biblioteca ImageJ para processamento de imagens, que permitiu fazer um tratamento mais detalhado dos pixels da imagem e manipulá-los de maneira mais fácil com a linguagem Java. O sistema criado, basicamente consiste de um formulário principal que se chama processamento de imagens e tem um menu Arquivo com 3 opções:
1. Adquirir Imagem - ativa a câmera do computador para que seja capturada e processada (retirar o fundo da imagem, separar e medir as plântulas ) a imagem das plântulas. 2. Processar Imagem - permite a escolha de uma imagem de um diretório que contenha plântulas para ser processada. 3. Sair Finaliza o programa. O item que processa a imagem, transforma-a em tons de cinza, retirando o fundo automaticamente pelo histograma. O próximo passo é a separação das plântulas em imagens distintas, mesmo que elas se interceptem. Foi criado um diretório para armazenar todas as imagens geradas pelo sistema. Após o término da separação é contado o número de pixels na vertical de cada plântula e feita uma conversão dos pixels para centímetros. As Figuras 2 e 3 mostram um exemplo de processamento de uma imagem de milho, com a retirada do fundo e a separação das plântulas em arquivos. O hardware desenvolvido para ser usado no sistema tem apresentado um resultado satisfatório, mas alguns pontos precisam de correções como a iluminação que será feita dentro da caixa, a altura que ficará a câmera e o ponto de luz. Inicialmente, o ponto de luz foi feito com luz amarela, mas não apresentou bom resultado sendo substituído por um foco com luz branca. Figura 1 - Programa com todas as imagens: original, com fundo azul e tentando separar as plântulas. RESULTADOS E DISCUSSÃO No mercado atual existem softwares comercias que fazem o processamento de imagens para verificar o vigor de plântulas, mas com valores que inviabilizam sua aquisição para pesquisas em instituições públicas. A proposta aqui apresentada é a criação de um conjunto de
hardware de baixo custo e software gratuito, para ser usado em pesquisas na área da agricultura que otimizam a análise de vigor das sementes. O funcionamento básico descrito anteriormente é que, por meio de uma câmera, as imagens sejam capturadas e processadas por um sistema desenvolvido na linguagem java com os framework swing e a biblioteca ImageJ da mesma linguagem, em que a imagem capturada passa por processos de retirada de fundo, limpeza de ruídos e termina com a separação das imagens das plântulas, indicando, posteriormente, se ela tem um alto vigor ou não, pelo seu comprimento medido em centímetros. Alguns fundos de imagens com cores diferenciadas foram testados, tais como, a verde, a branca, a azul e a preta, sendo que, para as sementes de milho e soja, a cor mais satisfatória de fundo foi a preta, uma vez que ela possibilitou melhor apresentação na separação entre as imagens das plântulas. Os resultados obtidos pelo protótipo foram promissores, uma vez que foi possível o processamento adequado das imagens das plântulas e a obtenção de medidas compatíveis com as realizadas manualmente. No entanto, novos testes serão realizados com o objetivo de estabelecer as relações entre o comprimento da plântula aferido pelo sistema e o seu vigor. Com isso, pretende-se incorporar dados e informações que permitam a produção de resultados mais detalhadas pelo sistema. Figura 2 - Programa desenvolvido em Java com imagej Ressalta-se que a qualidade das imagens utilizadas nos testes realizados até o momento pode ser melhorada com o uso de uma câmera mais moderna e com mais recursos. Dessa forma, imagens com maior resolução possibilitariam resultados mais satisfatórios no processamento das imagens das plântulas e nos resultados produzidos pelo sistema.
Figura 3 Contorno das plântulas de milho separadas pelo programa. CONCLUSÕES O sistema proposto mostrou-se mais rápido e eficaz que o método manual para utilização no teste de comprimento de plântulas para determinação do vigor de sementes. Além disso, o baixo custo é um fator que pode ser apresentado como uma das vantagens do sistema. A interface simples e de fácil entendimento, possibilita a utilização por pesquisadores de diversas áreas de conhecimento, sem a necessidade de um treinamento específico. Além disso, a partir dos resultados dos testes realizados pelo novo método de aferição, é possível concluir que houve uma melhora significativa com relação à rapidez, à eficiência e à eficácia, quando comparado ao método manual. Adicionalmente, com a ajuda de especialista da área de sementes, é possível, a partir das imagens, extrair e utilizar outras informações sobre as sementes, bem como segmentar outras partes das plântulas, possibilitado a obtenção de informações morfológicas mais precisas e que podem ser utilizadas em outras técnicas e estudos. No entanto, ainda é necessário um pouco mais de trabalho nesta etapa, pois em muitos casos, a segmentação da imagem para a extração de partes específicas das plântulas pode ocasionar perda de informação em razão da variação de cores e luminosidade. Outra contribuição do trabalho é a técnica implementada para a extração do contorno das sementes, o que possibilitou a determinação do comprimento da plântula. Os testes de velocidade da análise mostraram que o processamento da imagem com um processador i3, com 4 Gb de RAM, 64 bits com o sistema operacional Linux Ubuntu, ficaram próximo de 10 segundos para uma imagem contendo 5 (cinco) plântulas, indicando que são bem mais rápidos que os testes manuais. Isto gera uma economia de tempo em pesquisas nesta área, agilizando e reduzindo custos do processo, além de aumentar a precisão dos dados coletados em relação ao método manual. Como trabalhos futuros, pretende-se realizar estudos sobre técnicas de processamento de imagens e classificação mais modernas que possam ser utilizadas para o refinamento do software e, além disso, realizar testes de vigor complementares, obtendo resultados que servirão como base para a busca de padrões e relações mais diretas e imediatas entre o
comprimento obtido pelo sistema proposto e o vigor da semente. Com isso, pretende-se agregar valor ao sistema proposto, possibilitando ainda mais agilidade aos testes de vigor. REFERÊNCIAS CARVALHO, N. M. de; NAKAGAWA, J. Sementes: ciência, tecnologia e produção. Editora FUNEP, 2012. AOSA, A. Seed vigor testing handbook. Revista Brasileira de Sementes, 1983. MENEZES, N. L. de. Teste de condutividade elétrica em sementes de aveia preta. Rev. bras. sementes, Londrina, v. 29,n. 2, p. 138-142, Agosto, 2007. PISTORI, H.; ALVAREZ, M. A.; PEREIRA, M. C.; QI, X. Open Source Tools and Project- Based Teaching as Enablers of Research Experience in Computer Vision Students XLI Congresso Brasileiro de Educação em Engenharia, Gramado, RS, Brasil, 23 a 26 de Setembro de 2013. MARTIN, G. H. Germinação E Vigor De Sementes De Feijão Comum Em Condição De Submersão Em Água. Dissertação de Mestrado. Unoeste, Presidente Prudente/SP, 2012. MCDONALD, M. A review and evaluation of seed vigor tests. Proceedings of the Association of the Official Seed Analysts, v. 65, n. 1, p. 109 139, 1975. NAKAGAWA, J. Testes de vigor baseados no desempenho das plântulas. ABRATES, 1999. GOMES, O. D. F. M. Processamento e análise de imagens aplicados à caracterização automática de materiais (dissertação de mestrado). PUC, Rio de Janeiro, 2001.