Licenciatura em Ciências da Saúde

Licenciatura em Ciências da Saúde Gené4ca Humana 3º Ano 1º Semestre 2013-2014

PRINCIPAIS METODOLOGIAS PARA PREPARAÇÃO E ANÁLISE DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1. Extração de DNA 2. Eletroforese * 3. Amplificação in vitro (PCR ou polymerase chain reac4on) 4. Ensaios de hidrólise enzimá4ca 5. Sequenciação direta 6. * SSCP (Single Strand Conforma4onal Polymorphisms)

1. EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS célula núcleo RNA

EXTRAÇÃO DE DNA Destruição das membranas celulares e nucleares e dissociação do complexo DNA : proteína agentes desnaturantes (detergentes SDS) proteases (proteínase K) Isolamento DNA Sal4ng out - u4lização de uma solução salina saturada, 6M de NaCl faz precipitar as proteínas mantendo o DNA em solução mistura fenol / clorofórmio Precipitação DNA etanol ou isopropanol

OBTENÇÃO DE DNA ÍNTEGRO Corte de ligações fosfodiéster DNases, ph<2, t>90ºc Corte das ligações β- N- glicosídicas ph<2 Destruição das pontes de hidrogénio ph>10, ph<3, t>80ºc, redução da força iónica do meio Cisão da dupla hélice agitação mecânica

2. ELETROFORESE A eletroforese em gel é um método de separação de uma mistura de moléculas através de uma fase estacionária (agarose ou poliacrilamida) subme4da a um campo elétrico Agarose géis com poro mais largo; análise de moléculas de maiores dimensões (ácidos nucleicos) Poliacrilamida géis com poro mais pequeno; ideal para análise de moléculas de menores dimensões (proteínas, ácidos nucleicos de baixa MM)

AGAROSE

POLIACRILAMIDA

A voltagem aplicada aos extremos de um gel gera um campo elétrico com uma força definida pelo comprimento do gel e pela diferença de potencial nas extremidades (v/cm) Ácidos nucleicos migram em direção ao ânodo grupos fosfato carregados (- ) Como razão carga/massa é idên4ca para todas as moléculas de ácidos nucleicos separação efe4va pelo tamanho

Agarose (%) kb Poliacrilamida (%) bp 0.3 60-5 3.5 100-1000 0.6 20 1 5.0 80-500 0.7 10 0.8 8.0 60-400 0.9 7 0.5 12.0 40-200 1.2 6 0.4 20.0 10-100 1.5 4 0.2 2.0 3 0.1

PARÂMETROS QUE AFECTAM A MIGRAÇÃO DO DNA/RNA NO GEL Concentração de agarose / Dimensão molecular do ácido nucleico - determina a gama da dimensão das moléculas que podem ser separadas adequadamente. Voltagem aplicada - moléculas de ácidos nucleicos migram a uma velocidade proporcional à voltagem aplicada; contudo, à medida que se aumenta esta úl<ma, verifica- se que as moléculas de maiores dimensões migram a uma velocidade proporcionalmente mais elevada que os fragmentos mais pequenos. Tampões de eletroforese - os dois tampões mais u<lizados são o Tris/acetato/EDTA (TAE) e o Tris/borato/EDTA (TBE). Ambos apresentam um efeito pra<camente idên<co na mobilidade das moléculas, contudo diferem bastante na sua capacidade de tamponamento. TBE > capacidade de tamponar o meio

Conformação do DNA - fragmentos de DNA com a mesma massa molecular mas com conformação diversa (linear, circular super- enrolada ou circular relaxada) migram com velocidades diferentes num gel de agarose. Este fator revela- se importante sobretudo quando se analisa DNA plasmídico. - relaxado linear superenrolado +

Amostra de DNA - quan4dade de DNA a analisar depende: largura do poço - tamanho dos dentes do pente espessura do gel - volume da solução de agarose e altura do molde número e tamanho dos fragmentos de DNA (5 200 ng fragmentos únicos; 10 µg amostras com vários fragmentos e de várias dimensões, ex. ensaios de restrição DNA genómico) Corantes indicadores de migração - monitorização da separação eletroforé4ca e são incorporados na solução de deposição da amostra: Azul de Bromofenol (em gel agarose 0,8% acompanha fragmentos de 300 bp) Xileno Cianol (em gel agarose 0,8% acompanha fragmentos de 9 kb) Podem interferir com a visualização dos fragmentos com os quais migram conjuntamente

VISUALIZAÇÃO DIRETA NO GEL COM BROMETO DE ETÍDIO Atenção: Protecção dos olhos quando se usa luz UV Atenção: Potente mutagénico, suspeito de ser cancerígeno

300 600 Emite fluorescência vermelho- alaranjada (600nm) quando iluminado por UV

MARCADORES DE MASSA MOLECULAR

3. AMPLIFICAÇÃO IN VITRO - PCR Vida a 100ºC Até aos anos 60 pensava- se que a temperatura máxima suportada pelos os seres vivos era 55ºC Em 1960, com o estudo das fontes termais no Parque Nacional Yellowstone, USA, Thomas Brock e Hudson Freeze isolaram um microrganismo que vivia a 70ºC:Thermus aqua0cus Pyrococcus furiosus 100ºC: 70-103ºC Brock TD and Freeze H (1969). "Thermus aqua+cus, a Nonsporula<ng Extreme Thermophile". J. Bact. 98 (1): 289 97

Açores - Furnas

POLIMERASES Enzimas que catalizam a polimerização do DNA Necessitam de uma cadeia molde e de uma sequência iniciadora, o primer Adicionam nucleó4dos trifosfatados à extremidade 3 hidroxilada Quando encontram um erro, corrigem- no

PROPRIEDADES DAS DNA POLIMERASES ACTIVIDADE POLIMERÁSICA 5 3 NECESSIDADE DE UM MOLDE A cadeia molde complementar é copiada no sen0do 3 5 NECESSIDADE DE UM PRIMER ACTIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3 5 E 5 3 PROCESSIVIDADE Número de nucleó0dos adicionados antes que a enzima se dissocie do molde. Esta propriedade pode ser potenciada por proteínas associadas.

PCR Tecnologia que permite amplificar uma sequência de DNA milhões de vezes Desenvolvida em 1983 por Kary Mullis, que trabalhava para a Cetus (Nobel da Química 1993) Permite amplificar fragmentos de DNA com 40 kb

T. ambiente 95-98ºC T. hibridação depende composição ATCG primer T. extensão depende da polimerase Repe<ção

PCR Hoje é uma técnica com múl4plos usos: Sequenciação de DNA (basta um primer) Eng. Gené4ca Mutação pontual Deteção de patologias Aplicações forenses

Que polimerase? hep://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/polymerases/confidentpcr.asp

DESENHO DE PRIMERS É necessário conhecer a sequência de DNA a amplificar A temperatura de hibridação pode ser calculada somando 2ºC por cada A ou T e 4ºC por cada C ou G Certas Polimerases necessitam de cálculos um pouco mais elaborados

Links T hibridação h p://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/tmcalc/default.asp?#.uhhoprtv_4c h p://www.finnzymes.fi/tm_determina4on.html h p://www.finnzymes.fi/java_applets/mul4ple_primer_analyzer.html

4. ENSAIOS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SISTEMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO: O QUE SÃO? Sistemas enzimá4cos de complexidade variável possuindo, pelo menos, dois 4pos de ac4vidades sobre dsdna: 1) fosfodiesterase específica 2) me4ltransferase

1) Fosfodiesterase RESTRIÇÃO

RESTRIÇÃO 1) Fosfodiesterase específica / endonuclease / enzima de restrição - REase. Sequência de dsdna reconhecida pela EcoRI " " " "5 NNNNGAATTCNNNN 3 " " " " "3 NNNNCTTAAGNNNN 5 " dsdna + EcoRI (Mg2+, ph 7, 37 C, 1h) 5 NNNNG^ AATTCNNNN 3 " " " "3 NNNNCTTAA ^GNNNN 5 "

MODIFICAÇÃO = METILAÇÃO 2) Me<ltransferase - MTase - específica para a mesma sequência da Rease Sequência de dsdna reconhecida pela M.EcoRI " " " "5 NNNNGAATTCNNNN 3 " " " " "3 NNNNCTTAAGNNNN 5 " dsdna + M.EcoRI (SAM, ph 7, 37 C, 1h) " " " " CH3" " " " " " " " " "5 NNNNGAATTCNNNN 3 " " " " "3 NNNNCTTAAGNNNN 5 " " " " " " CH3"

CONSEQUÊNCIAS Para um dado sistema de RM, a restrição e a me4lação incidem sobre a mesma sequência de DNA de tal forma que a me4lação da sequência pela MTase impede a hidrólise dessa sequência pela REase.

CH3" " " " " " " " " "5 NNNNGAATTCNNNN 3 " " " " "3 NNNNCTTAAGNNNN 5 " " " " " " CH3 dsdna + EcoRI (Mg2+, ph 7, 37 C, 1h) " " " " CH3" " " " " " " " " "5 NNNNGAATTCNNNN 3 " " " " "3 NNNNCTTAAGNNNN 5 " " " " " " CH3"

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO: ONDE SE ENCONTRAM? Ubiquitários em procariotas. Presentes em alguns vírus e plasmídios Ex: Escherichia coli, Virus de Chlorela, pri13. Não foram encontrados em eucariotas Roberts, R. J. (1976). Restriction endonucleases, CRC Crit. Rev. Biochem. 4: 123-164

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO: IMPLICAÇÕES BIOLÓGICAS A presença de um ou vários destes sistemas enzimá4cos numa célula bacteriana tem duas consequências: o seu cromossoma e eventuais elementos extracromossomais estão me4lados na sequência reconhecida pela REase e qualquer DNA estranho contendo a sequência reconhecida que penetre na célula, por meios naturais ou ar4ficiais, será degradado se essa sequência não es4ver me4lada.

SISTEMA DE PROTEÇÃO BACTERIANO

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO: PARA QUE SERVEM? Segundo Levin*, protegem o pool gené4co das populações bacterianas Envolvidos na recombinação? Barreiras à troca gené4ca bacteriana - Especiação Genes egoístas

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO E MODIFICAÇÃO: NOMENCLATURA ER Gene MTase Gene Especificidade Gene Controlo Gene AluI aluir M.AluI aluim - - - - BamHI bamhir M.BamHI bamhim - - C.BamHI bamhic EcoKI ecokir M.EcoKI ecokim S.EcoKI ecokis - - HindII hindiir M.HindII hindiim - - - - Sau3AI sau3air M.Sau3AI sau3aim - - - - Roberts RJ., et al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 2003 Apr 1; 31(7): 1805-1812.

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Catalisam reações de hidrólise das ligações fosfodiéster entre nucleó4dos situados no interior das cadeias duplas de DNA e atuam de forma reprodu vel em locais específicos (sí4os de restrição) que correspondem a sequências palindrómicas Consoante o 4po de enzima, os fragmentos resultantes podem apresentar extremidades: Protuberantes, Coesivas ou S0cky Francas, Não- coesivas ou Blunt

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO : NOMENCLATURA EcoRI E co R I género Escherichia espécie E. coli es<rpe RY13 primeira enzima isolada a par<r desta es<rpe

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO : NOMENCLATURA Espécie Nome Sequência reconhecida Local de corte Escherichia coli RY13 EcoRI 5 GAATTC 3 G^AATTC Bacillus amyloliquefaciens H BamHI 5 GGATCC 3 G^GATCC Helicobacter pylori 60190 HpyVIII 5 GANTC 3? Streptomyces aureofaciens IKA 18/4 SauI 5 CCTNAGG 3 CC^TNAGG Staphylococcus aureus PS96 Sau96I 5 GGNCC 3 G^GNCC

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO : NOMENCLATURA Enzimas naturais : designadas por três letras indicando o microrganismo, podendo ser seguidas seguidas de uma designação alfanumérica designando a es4rpe e terminando com um numeral romano. Exemplos: BamHI, PaeI e Sau96I. Enzimas puta4vas: iden4ficadas pela letra P após o algarismo romano, e.g. HindIP. Roberts RJ., et al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 2003 Apr 1; 31(7): 1805-1812.

SISTEMAS DE RESTRIÇÃO : NOMENCLATURA Enzimas ar4ficiais: designadas por três letras indicando o microrganismo, podendo ser seguidas de uma designação alfanumérica designando a es4rpe. O numeral romano que é empregue nas enzimas naturais é omi4do. Exemplo: EcoDR2 é a designação actual da enzima ar4ficial ob4da por recombinação entre as es4rpes de E. coli produtoras da EcoR124I e EcoDXXI. Roberts RJ., et al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 2003 Apr 1; 31(7): 1805-1812.

ER: TIPOS DE SEQUÊNCIAS RECONHECIDAS E LOCAIS DE HIDRÓLISE Sistema/Exemplo Sequência reconhecida Local de hidrólise*! Tipo II: Palindroma No interior, em local definido! EcoRI 5 GAATTC 3!!5 G^ AATTC 3!!!3 CTTAAG 5!!3 CTTAA ^G 5! Tipo IIs: Assimétrica No exterior, em local definido! HphI!!5 GGTGA 3!!5 GGTGANNNNNNNN^ 3!!!3 CCACT 5!!3 CCACTNNNNNNN^ 5!!!! * Em relação à sequência de reconhecimento

UNIDADE ENZIMÁTICA Definição: 1U ER - quan4dade de endonuclease de restrição necessária para digerir completamente 1µg de DNA substrato, numa hora, num volume de reacção de 50µl. É normal esta quan4dade ser diferente quando se compara, para a mesma enzima, a quan4dade necessária para digerir completamente DNA linear ou plasmídico. hep://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restric<on_enzymes/cleavage_supercoiled_dna.asp

TAMPÕES SISTEMA NEB NEBuffer 1(yellow): 10 mm Bis Tris Propane-HCl, 10 mm MgCl2, 1 mm DTT (ph 7.0 at 25 C). NEBuffer 2 (blue): 10 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl2, 50 mm NaCl, 1 mm DTT (ph 7.9 at 25 C). NEBuffer 3 (red): 50 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl2, 100 mm NaCl, 1 mm DTT (ph 7.9 at 25 C). NEBuffer 4 (green): 20 mm Tris-acetate, 10 mm magnesium acetate, 50 mm potassium acetate, 1 mm DTT (ph 7.9 at 25 C).

DIGESTÕES DUPLAS

DIGESTÕES EXTREMIDADES PRODUTOS PCR http://www.neb.com/nebecomm/ tech_reference/restriction_enzymes/ cleavage_linearized_vector.asp

ACTIVIDADE STAR Condi4ons that contribute to Star Ac4vity 1. High glycerol concentra4on [>5% v/v] 2. High units to µg of DNA ra4o [Varies with each enzyme, usually >100 units/µg] 3. Low ionic strength [<25 mm] 4. High ph [>ph 8.0] 5. Presence of organic solvents [DMSO, ethanol ethylene glycol, dimethylacetamide, dimethylformamide, sulphalane] 6. Subs4tu4on of Mg 2+ with other divalent ca4ons [Mn 2+, Cu 2+, Co 2+, Zn 2+ ] http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/star_activity.asp

52 http://rebase.neb.com

53

PARA SABER MAIS: http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/ restriction_enzymes/default.asp

4. SEQUENCIAÇÃO A sequenciação é o método u4lizado para determinar a sequência nucleo dica de um fragmento de DNA O método de Sanger baseia- se na cópia repe4da de uma única cadeia de DNA, sendo cada cópia terminada prematuramente pela incorporação de um didesoxinucleó4do Produz- se assim uma série de cópias de DNA diferindo entre si pelo comprimento de uma única base Estes fragmentos são separados num gel de poliacrilamida e a sequência nucleo dica determinada pela leitura sequencial no gel da úl4ma base de cada fragmento

MÉTODO DE SANGER Amostra DNA + Primer + Polimerase + 4 dntp (1 marcado) i 4 reações separadas Cada uma tem 1 ddntp

MÉTODO DE SANGER Sequenciação em que cada ddntp é marcado com um corante fluorescente diferente 1 única reação

6. SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM SSCP A mobilidade eletroforé<ca de uma molécula de DNA em cadeia simples num gel desnaturante é função da sua sequência nucleoqdica e do seu comprimento. Ambos os parâmetros determinam a forma, a dimensão efe<va e a densidade de carga superficial da molécula de DNA. Assim, torna- se possível dis<nguir cadeias simples que diferem entre si por apenas um nucleó<do

Coloração do gel de poliacrilamida com nitrato de prata sensibilidade superior ao brometo de eqdio (1 pg versus 1 ng) Cadeias simples Cadeias duplas

COLORAÇÃO COM NITRATO DE PRATA Os geis de poliacrilamida são impregnados com ião prata solúvel (Ag + ) e revelados por tratamento com um agente redutor. As macromoléculas no gel promovem a redução do ião prata a prata metálica (Ag 0 ), a qual é insolúvel e visível, permi<ndo a visualização de ácidos nucleicos e proteínas con<dos nas bandas. A deposição inicial de prata metálica promove a deposição posterior de mais prata metálica, num processo autocatalí<co de que resulta uma elevada sensibilidade.

Fixação tratamento com ácido acé4co que torna as moléculas insolúveis e impedem a sua difusão para fora do gel durante os passos seguintes. Substâncias que podem interferir com processo de coloração (tampões, iões, desnaturantes, detergentes, anfólitos) são também removidas neste passo. Impregnação com prata o gel é tratado com nitrato de prata. As condições moderadamente acídicas evitam que o ião Ag seja reduzido a Ag metálica. O gel é lavado com água para remover o excesso de prata da supervcie do gel.

Revelação a solução contém formaldeído que reduz o ião prata a prata metálica. Esta reacção só tem lugar a ph elevado, que é dado pelo bicarbonato de sódio. O 4ossulfato de sódio fornece o ião sulfureto (S 2- ) que reage directamente com a Ag, acelerando e desenvolvendo o processo. O <ossulfato forma também um complexo com o ião Ag livre evitando a sua redução a Ag metálica, o que reduz o background. Paragem e preservação esta solução evita a con<nuação da redução do ião prata. Além disso contém glicerol que evita que o gel se quebre durante o processo de secagem.

RASTREIO DE MUTAÇÕES Métodos que localizam a zona do gene onde se situa a mutação. Evita a sequenciação de grandes porções de um gene de modo a iden<ficar uma mutação

RASTREIO DE MUTAÇÕES Situações em que se usam estes métodos: Gene isolado e sequenciado, mas poucas mutações iden<ficadas Gene com elevada frequência de alguns alelos mutados, mas nenhum deles foi detetado no doente através de métodos diretos Gene com muitos alelos mutados conhecidos, mas todos apresentando uma baixa frequência