PRESERVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS

PRESERVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS Ivano de Filippis colecao@incqs.fiocruz.br ivano.defilippis@incqs.fiocruz.br Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde INCQS

Porque preservar microrganismos? Utilização frequente de culturas para pesquisa, produção de biológicos ou ensaios Contaminação Diminuição da viabilidade Mutações

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Criopreservação - Congelamento e preservação na fase líquida ou gasosa de N2 líquido. - Congelamento e preservação abaixo de -70 C. Dessecação - Preservação por liofilização - Preservação por centrifugação - Preservação por L-drying

Metodologias de preservação metabolicamente ativas: - Repiques periódicos em ágar ou meio líquido - Manutenção de culturas em slant com óleo mineral - Preservação em água (Castellani)

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Congelamento: -20 C: Vantagens: barato, equip.simples, contam. reduzida, necessidade de pouco espaço. Desvantagens: monitoração do equip., manutenção frequente dos mos., estruturas biológicas instáveis. -70 C: Vantagens: estabilidade, armazenamento por longos períodos. Desvantagens: custo equip./manutenção constante.

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Liofilização Vantagens: - Produção, distribuição e armazenamento de lotes - Alta viabilidade durante a estocagem (50 anos) - Produção de grande número de ampolas/lote - Armazenamento simples/pouco espaço Desvantagens: - Alto custo inicial - Utilização de diversos reagentes/mat. laboratório

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Liofilização em ampolas Ampola estrangulada: Vantagens: - Maior durabilidade - Menor espaço p/estocagem - Menor custo Desvantagens: - Dois ciclos de liofilização - Menor resistência a impactos - Menor durabilidade

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Liofilização em ampolas Frasco-ampola: Vantagens: - Apenas um ciclo para liofilização - Menor tempo de liofilização - Maior resistência a impactos Desvantagens: - Menor durabilidade - Maior custo - Necessidade de equipamento p/fechamento das ampolas

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Liquid-drying Preservação de mo sensíveis ao estágio inicial de congelamento no processo de liofilização convencional. As culturas não são previamente congeladas e a dessecação ocorre a partir da fase líquida. Criopreservador submetido ao processo de liofilização convencional.

Metodologias de preservação metabolicamente inativas: Liquid-drying Suspensão do microrganismo no mesmo criopreservador é gotejada sobre o liófilo. Ampolas são novamente submetidas ao processo de lioflização O liófilo está apenas úmido com a suspensão do mo não há borbulhamento (fervura) do material durante o vácuo.

Metodologias de preservação Metabolicamente ativas: Repiques periódicos: Vantagens: barato, não requer equipamentos especiais. Desvantagens: mutações, contaminações, manutenção frequente, espaço. Óleo mineral: Repiques menos frequentes, menor taxa de contaminação/mutações.

Criopreservadores Skim Milk : mais utilizado para liofilização, baixo custo, boa recuperação. Carbohidratos: bastante utilizados, necessitam meio de cultura, resultados variáveis. Soro e sangue: específicos para alguns mo; podem inibir alguns mo. DMSO: congelamento de céls., tóxico p/alguns mo. Glicerol: procedimento simples, método de congelamento mais utilizado.

Criopreservadores Dois tipos básicos Proteção intra-celular: glicerol e DMSO congelamento -20 a -196ºC Proteção extra-celular: Skim Milk, glicose, lactose, manitol, sacarose, sorbitol, inositol, (apenas liofilização)

Criopreservadores Congelamento: gêlo dano à célula congelamento do soluto (mistura eutética) temperatura eutética (Ex.: NaCl = -21.8 C) Criopreservador: componente não-iônico substituição da água reduzindo o aumento da concentração iônica. Ex. glicerol, DMSO.

Criopreservação Preparo do criopreservador Sol. aquosa a 5% DMSO Sol. aquosa a 10% - 20% glicerol Congelamento Ressuspender o crescimento no criopreservador Congelar segundo metodologia específica.

Criopreservação Nitrogênio Líquido 1. Crescimento fase log em meio líquido 2. Criotubo de poliestireno com ou sem pérolas de vidro/plástico 3. Transferir a cultura para 100-200µl de meio líquido + glicerol estéril [C] final de 15-20% Células Congelar a 1-2ºC/min ou -20ºC-70ºC/30 Microrganismos Colocar em -70ºC/1 hora Imergir as ampolas na fase líquida do LN2

PRESERVAÇÃO DE ANAERÓBIOS Manter a atmosfera anaeróbica das ampolas ou criotubos lavando com mistura de N 2 /CO 2 Selar as ampolas ou criotubos com a mistura gasosa apropriada para o gênero. Utilizar criopreservador reduzido

CRIOPRESERVAÇÃO Considerações finais Durante o congelamento, quanto maior a temperatura, maior o tamanho dos cristais de gelo formados. Cristais de gelo grandes em temperaturas próximas de zero, causam maiores danos. Mesmo após congelamento perfeito, a recristalização do gelo (a partir de 120C), pode causar danos à célula (thawing damage). O descongelamento rápido evita a recristalização e diminui o tempo de contato de grandes cristais com estruturas celulares. Microrganismos Gram positivos são mais resistentes pela presença de peptideoglicana na parede.

Escolha do método de preservação Manutenção da viabilidade Frequência de mutações Pureza Custo de manutenção Número de culturas/espaço Valor das culturas Fornecimento e transporte Frequência de uso Disponibilidade de Recursos

Vida média de alguns gêneros bacterianos preservados por diferentes métodos Gênero Repiques a Óleo mineral -70C LN2 Liofilização (meses) (anos) (anos) (anos) (anos) Acetobacter 1-2 1 1-3 >40 >40 Achromobacter 1 1-2 1-3 >40 >40 Agrobacterium 1-2 1-2 -- >40 >40 Bacillus 2-12 1 2-3 >40 >40 Erwinia 1-4 1-2 -- >40 >40 Gluconobacter 1 -- -- >40 >40 Lactobacillus 1 semana -- -- >40 >40 Methanobacterium a 1 -- -- >40 5 Methanomonas a 1 -- -- >40 5 Xanthomonas -- -- 1-2 >40 >40 a Depende do meio utilizado e da espécie. (adapatado de Murray, 1994)

Teste acelerado de viabilidade após preservação A viabilidade de mo preservados por liofilização ou L-drying é diretamente afetada pela temperatura durante a estocagem. Ex.: 8 anos a 5 C = 2 semanas a 37 C. log S t = log S 0 (logs 0 logs ac ). t/8 Onde: S t = viabilidade após t anos a 5 C S 0 = viabiliadade imediatamente após liofilização/l-drying S ac = viabilidade após estoque a 37 C por 2 semanas Sendo: S 0 = 10 7 UFC/ml, S ac = 10 5 UFC/ml e t = 8 anos Temos: S t = 7 (7 5) 8/8 S t = 7-2 S t = 10 5 UFC/ml

Teste acelerado de viabilidade após preservação O tempo no qual os mo perdem totalmente sua viabilidade durante a preservação a 5 C pode ser calculado por: t = 8. log S 0 / (logs 0 logs ac ) Onde: t = anos necessários p/perda total da viabilidade S 0 = viabiliadade imediatamente após liofilização/l-drying S ac = viabilidade após estoque a 37 C por 2 semanas Sendo: S 0 = 10 8 UFC/ml e S ac = 10 5 UFC/ml Temos: t = 8.8 / (8 5) t = 64 / 3 t = 21 anos e 3 meses

TESTES PRÉ E PÓS-LIOFILIZAÇÃO Viabilidade (pré e pós): Diluições seriadas ou alça calibrada Pureza (pré e pós): Meio rico / 37 C / aerobiose Isoenzimas Identidade (pré e pós): Provas bioquímicas PCR-16S PCR genes funcionais específicos RAPD-PCR, Pulse-field Umidade (pós): Carl Fisher Vácuo (pós): Spart Tester

Na temperatura alcançada pelo Nitrogênio líquido (-160 a -190 C), a viabilidade celular não tem praticamente nenhuma relação com o período de armazenamento, e os sistemas biológicos estão geneticamente estáveis. Freeze-drying and cryopreservation of bacteria. (Perry, S.F. Molecular Biotechnology, 9:59-64, 1998) Congelamento e liofilização são os métodos mais usados para a conservação de microrganismos. Nenhum método é capaz de alcançar uma taxa de recuperação de 100%. Se a preservação de 100% das células for imprescindível, aconselha-se utilizar os dois métodos em paralelo.

Freeze-drying and cryopreservation of bacteria. (Perry, S.F. Molecular Biotechnology, 9:59-64, 1998) A criopreservação a -60/-80C, permite boa recuperação e pode ser usado quando não houver disponibilidade de N 2 líq., onde uma pequena perda da viabilidade é tolerada. De um modo geral temperaturas acima de -30 C não apresentam bons resultados devido à formação de misturas eutéticas. O método das contas ou pérolas de vidro, é aconselhado para diminuir espaço e evitar os constantes descongelamentos das amostras.

Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS/FIOCRUZ

HISTÓRICO Criada em 1983 1a cultura: Bacillus subtilis INCQS 00001 (ATCC 6633) lote 1083001 Coleção de Referência Nacional (Farmacopéia brasileira) 1989 inscrita na World Federation of Culture Collection (WFCC), INCQS-WDCM 575. 2008 Credenciamento - fiel depositário

HISTÓRICO 2009 ANVISA deposita cepa Mycobacterium massiliense INCQS 00594 Ensaio de avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes hospitalares para artigos semi-críticos RDC no. 75 de 23/10/08.

Depósito 4. Direitos de distribuição (marcar apenas uma opção) O depositante transfere os direitos de propriedade da cepa para o INCQS. O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa para o INCQS, mas permite sua distribuição irrestrita. O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa para o INCQS, mas permite sua distribuição restrita somente às instituições designadas pelo depositante. O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa para o INCQS, e não permite sua distribuição.

CARACTERÍSTICAS Aplicações: controle microbiológico de produtos farmacêuticos, vacinas, medicamentos, referências para pesquisa, etc. Serviços: preservação, fornecimento, identificação fenotípica/molecular, depósito, consultorias, etc. INCQS Sistema de Gestão da Qualidade Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025-2004

Origem das linhagens 19,50% 2,00% 2,20% 3,20% 3,80% 69,30% ATCC CCT DSMZ CDC NCTC Others* *Outros: (FDA, NIH, CIP, CCUG, SSI, UFRJ, UERJ, UFF, UFPE, LFB, IAL, etc.)

ACERVO Bacterias 630 linhagens (69 gêneros) Fungos 277 linhagens (36 gêneros) Archaea 29 linhagens (19 gêneros) TOTAL = 936 cepas de referência

SEGURANÇA E BIOSSEGURANÇA Segurança do acervo/dados Acesso físico Sistema de memória Serviço de Informática centralizado Backup diário Envio de amostras Normas internacionais - IATA Biossegurança 99% NB-2 NB-3 mantidas em condições NB-3

Métodos de preservação Bacterias: Criopreservação 5% do acervo, backup -70 C, N2 líquido Liofilização 95% do acervo Fungos e leveduras: Repiques periódicos Óleo mineral Criopreservação 5% do acervo, backup -70 C, N2 líquido Liofilização 95% do acervo Archaea: Liquid-Drying (L-Drying) 90% do acervo Cultura ativa 10% do acervo Criopreservação backup

Fornecimento de microrganismos 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 16 119 187 259 317 476 719 434 918 789 670 468 692 570 721 1097 1010 895 886 1164 1110 1148 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09* 1332 1003 901 1314 1013 Solicitações Ampolas fornecidas Depto. Microbiologia - Lab. Microrganismos de Referência 09*=até set/2009

Controle da Qualidade Vácuo Spart Tester Umidade Carl Fisher Viabilidade Pureza Identidade Métodos convencionais Métodos moleculares 16S, tdna-pcr, PCR genes funcionais, ERIC-PCR, RAPD, etc.

Pesquisa e Treinamento Linhas de pesquisa vinculadas às atividades da coleção Epidemiologia molecular de isolados clínicos Desenvolvimento de métodos rápidos de Diagnóstico molecular Taxonomia e Filogenia molecular de isolados clínicos e ambientais Diversidade Molecular Ambiental recursos hídricos, solo, sedimentos Isolamento e descrição de novas espécies e/ou gêneros de isolados brasileiros Micorremediação Treinamento (externo e interno) da equipe para as atividades da coleção ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005 Normas de Biossegurança Treinamento em centros nacionais e internacionais

Coleção de Microrganismos de Referência Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde INCQS Av. Brasil, 4365 Manguinhos Rio de Janeiro RJ 21045-900 Tel.: 21-3865-5236 FAX: 21-2290-0915 Ivano de Filippis colecao@incqs.fiocruz.br ivano.defilippis@incqs.fiocruz.br