ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA E ALIMENTOS

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1 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA E ALIMENTOS

2 Análise de alimentos Utilização de técnicas microbiológicas: Pesquisar Estimar presença de microrganismos; número de microrganismos; Identificar os microrganismos.

3 Microrganismos estressados A detecção é feita pelo cultivo dos microrganismos em meios seletivos e não seletivos. Os microrganismos isolados de alimentos geralmente são submetidos a condições de injúria, tais como aquecimento, refrigeração, conservantes, congelamento, desidratação, acidificação, salga, que irão afetar as células presentes.

4 Efeitos sobre os microrganismos: aumento da fase LAG maior sensibilidade aos agentes do meio de cultivo lesão na membrana citoplasmática lesão em enzimas do ciclo de Krebs deterioração de ribossomas lesão do DNA perda de componentes celulares incapacidade de multiplicação

5 Etapas da análise microbiológica Amostragem; Preparação da amostra; Contagem de microrganismos; Isolamento e identificação microrganismos; Sorologia. de

6 Amostragem Especificação de dados; Evitar contaminação com outros alimentos; Transporte: alimentos perecíveis: 0-4ºC; alimentos congelados: congelados; Análise no máximo em 36 horas.

7 Preparação da amostra Homogeneização da amostra; Cuidado: velocidade e tempo evitar aquecimento da amostra e danos aos microrganismos; Melhor método: Stomacher.

8 Contagem de Microrganismos MÉTODOS DIRETOS: 1) Contagem em placa; Método de filtração: Método do Número Mais Provável Contagem direta ao microscópio: Contador Coulter:

9 Contagem de Microrganismos MÉTODOS INDIRETOS: 1) 2) 3) 4) Peso seco Medida de turbidez Atividade metabólica Microcalorimetria

10 Isolamento e Identificação de Microrganismos Características morfológicas Morfologia bacteriana = diz pouco sobre as células; Útil na identificação de algumas bactérias = endoesporos, flagelos, cápsula

11 Coloração diferencial Coloração de Gram; GP Coloração de Ziehl-Neelsen; Coloração de esporos. GN

12 BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS Células fixadas à lâmina COLORAÇÃO DE GRAM Corante principal cristal violeta Cora em púrpura Cora em púrpura Mordente: solução de iodo Permanece púrpura Permanece púrpura Descorar com: álcool ou acetona Permanece púrpura Contratingir com Safranina Permanece púrpura Cora em vermelho

13 Testes bioquímicos Atividade metabólica = utilizada para diferenciar bactérias; Bactérias intimamente relacionadas = separadas por testes bioquímicos; Reduzir o tempo: Uso de técnicas seletivas: Utilização de meios seletivos e diferenciais e diferentes condições de cultivo; Utilização de testes rápidos.

14 Meios seletivos e diferenciais EMB = identificação de E. coli Ágar sangue = halo de hemólise

15 Meios seletivos e diferenciais Ágar Baird Parker = identificação de S. aures Ágar MYP = identificação de B. cereus

16 Testes rápidos = API 20E

17 Testes rápidos = tubos de compartimentos

18 Testes rápidos

19 Contagem de Microrganismos Aeróbios Mesófilos Pesar a amostra; Fazer as diluições; Plaqueamento: Superfície; Profundidade; Meio utilizado: PCA

20 Preparação da amostra Homogeneização e Diluição 25 g 1mL 225mL H2O peptonada 0,1% mL 9mL H2O pept. 0,1% mL H2O pept. 0,1% 10-3

21 Método de Profundidade Método de Superfície

22 Resultados em placas

23 Contagem de Bactérias Aeróbias Mesófilas: Método Profundidade ,0 ml ,0 ml Ágar Padrão de Contagem (PCA) 1,0 ml

24 Contagem e Identificação de Staphylococcus aureus: Método Superfície ,1 ml ,1 ml Ágar Baird Parker (BP) 0,1 ml

25 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus Diluições Baird-Parker AN

26 IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus TESTE CATALASE H2O2 BOLHAS AN H2O2 ESFREGAÇO CATALASE H 2O + O 2

27 IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus TESTE DNase e COAGULASE DNase COAGULASE Protrombina Fibrinogênio COAGULASE Trombina Fibrina

28 Pesquisa de Salmonella sp. PRÉ-ENRIQUECIMENTO H2O peptonada 1,0 % ENRIQUECIMENTO SELETIVO Rappaport Vassiliadis Caldo tetrationato

29 PLAQUEAMENTO DIFERENCIAL HE SS XLD HE SS XLD 35-37ºC/24hs IDENTIFICAÇÃO Provas Bioquímicas

30 Importância da Análise de Água Lavagem de matéria-prima; Lavagem de utensílios; Lavagem de superfícies; Lavagem de carcaças; Resfriamento; Composição dos alimentos.

31 Qualidade da água Garantida do mesmo modo que matéria-prima ou ingrediente; Programa de garantia de qualidade fonte, tratamento, distribuição armazenamento dentro da fábrica; Inspeção = padrões internos e legais Portaria 518 de 2004 a = e =

32 Coleta de Água Frasco limpo e estéril; Sistema de distribuição = esperar 2 a 3 minutos, abrir o frasco, coleta a água e fechar o frasco; Rios, lagos, fontes = cuidado com água parada e material flutuante; Água com cloro = tiossulfato de sódio; Análise = máximo 30 horas após coleta.

33 Análise da água Não deve ser baseada no isolamento e identificação de MOs patogênicos; Microrganismos indicadores: Contagem em placas; Coliformes totais; Coliformes fecais.

34 Análise Microbiológica Contagem de Coliformes totais e fecais: Técnica do Número Mais Provável (NMP); Técnica da membrana filtrante; Técnica do Collilert (Teste do ONPG e MUG).

35 Técnica do NMP COLIFORMES TOTAIS COLIFORMES TERMOTOLERANTES IDENTIFICAÇÃO DE E. coli

36 Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes (Fecais) 10mL 10mL LST 1mL 9mL LST Lauril Sulfato Triptose (LST) 0,1mL 9,9mL LST

37 35-37ºC/24hs Coliformes Totais Caldo Verde Brilhante Coliformes Termotolerantes Caldo Escherichia coli 44,5-45,5ºC/24hs Provas Bioquímicas Agar Eosina Azul de Metileno

38 Membrana Filtrante

39 Vantagem de cada método Filtração: Rápido; Exato; Método de esterilização a frio; NMP: Recupera microrganismos injuriados; Mais barato; Evita falso negativo.

40 Desvantagem de cada Método Filtração: Maior custo; Risco de perda de microrganismos, meio seletivo; Só pode ser utilizado para água e alimentos líquidos; NMP: Demorado; Trabalhoso;

41 Colilert

42 Método Rápido MUG e ONPG

43 MUG e ONPG - Resultado

44 Meios utilizados CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS PCA (ÁGAR PADRÃO DE CONTAGEM) Triptona 5,0g Extrato de levedura 2,5g Dextrose 1,0g Ágar15,0g Água destilada 1,0L

45 PESQUISA DE Salmonella sp. CALDO RAPPAPORT - VASSILIADIS Triptona Cloreto de magnésio Cloreto de sódio Verde malaquita Fosfato de potássio

46 PESQUISA DE Salmonella sp. CALDO TETRATIONATO Proteose peptona Carbonato de cálcio Sais biliares Tiossulfato de sódio Água destilada

47 PESQUISA DE Salmonella sp. AGAR Hectoen Enterico Proteose peptona, Extrato de levedura Salicina, Sais biliares Lactose, Sacarose Tiossulfato de sódio Citrato férrico Cloreto de sódio Azul de bromotimol Fuccina ácida Ágar Água destilada

48 PESQUISA DE Salmonella sp. AGAR SS (Salmonella/ Shigella) Extrato de carne, Proteose peptona Citrato de sódio Sais biliares Tiossulfato de sódio Citrato férrico Vermelho neutro Lactose Ágar Água destilada1,0l

49 PESQUISA DE Salmonella sp. ÁGAR CITRATO DE SIMMONS Citrato de sódio Fosfato de amônia Sulfato de manganês Azul de bromotimol Cloreto de sódio Fosfato dipotássio Ágar Água destilada

50 PESQUISA DE Salmonella sp. TSI (TRIPLE SUGAR IRON ÁGAR) Extrato de carne, Extrato de levedura Peptona, Proteose peptona Dextrose Lactose Sacarose Sulfato ferroso Tiossulfato de sódio Cloreto de sódio Vermelho de fenol Ágar Água destilada1,0l

51 PESQUISA DE Salmonella sp. CALDO LISINA Peptona de gelatina Glicose Extrato de levedura Lisina Púrpura de bromocresol Água destilada

52 PESQUISA DE Salmonella sp. ÁGAR URÉIA Peptona Uréia Dextrose Cloreto de sódio Fosfato monopotássio Vermelho de fenol Água destilada

53 PESQUISA DE Salmonella sp. ÁGAR MIO (MOTILIDADE, INDOL, ORNITINA) Extrato de levedura Ornitina Peptona Púrpura de bromocresol Dextrose Triptona Agar Água destilada

54 PESQUISA DE Salmonella sp. CALDO VERMELHO DE FENOL Proteose peptona Extrato de carne Cloreto de sódio Vermelho de fenol Água destilada

55 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus BP - BAIRD PARKER AGAR BASE Triptona, Extrato de carne, Extrato de levedura Cloreto de lítio Piruvato de sódio Glicina Ágar Água destilada Após esterilização, adicionar: Emulsão de gema de ovo, salina Telurito de sódio

56 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus ÁGAR DNASE Peptona caseína Ácido desoxirribonucléico Cloreto de sódio Agar Água destilada

57 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus Teste de Catalase

58 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST) Triptose Cloreto de sódio Lactose Lauril sulfato de sódio Fosfato de potássio dibásico Fosfato de potássio monobásico Água destilada

59 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2% Peptona Bile de boi Lactose Verde brilhante Água destilada

60 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA CALDO Escherichia coli (EC) Triptose Cloreto de sódio Lactose Sais biliares Fosfato de potássio dibásico Fosfato de potássio monobásico Água destilada

61 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB) Peptona Lactose Sacarose Fosfato de potássio dibásico Azul de Metileno Eosina amarela Ágar Água destilada

62 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA ÁGAR CITRATO DE SIMMONS Citrato de sódio Fosfato de amônia Sulfato de magnésio Azul de bromotimol Cloreto de sódio Fosfato dipotássio Ágar Água destilada

63 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA CALDO TRIPTONA Triptona Água destilada

64 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA ÁGAR MOTILIDADE Tripticase Fosfato dissódico Glucose Extrato de levedura Ágar Água destilada

65 EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA CALDO VM/VP Peptona Fosfato dipotásico Glicose Água destilada

66 Interpretação dos resultados Produtos em condições sanitárias satisfatórias: b. PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES. Produtos em condições sanitárias insatisfatórias: d. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR... e. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR...