MICROBIOLOGIA. Atividades Práticas 4º ANO

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1 Centro Universitário Fundação Santo André Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras CURSO: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MICROBIOLOGIA Atividades Práticas 4º ANO NOME: Nº: 4º Profa. Dra. Márcia Zorello Laporta Profa. Me. Priscila Reina Siliano da Silva 2006

2 Índice Normas adotadas no laboratório de Microbiologia... 2 Atividade 1 Técnica da Coloração de Gram... 3 Atividade 2 Coloração de Cápsula... 6 Atividade 3 Coloração de Esporos... 8 Atividade 4 Coloração de BAAR (Método de Zielh-Neelsen) Atividade 5 Coloração de Espiroqueta Atividade 6 Preparo de Meios de Cultura Atividade 7 Técnicas de Inoculação Atividade 8 Leitura dos Experimentos de Semeadura Atividade 9 Técnicas de Semeadura em Placa após Diluição Atividade 10 Técnica de Semeadura em Placa Pour-Plate Atividade 11 Isolamento e Identificação de Enterobactérias Atividade 12-A Leitura e Interpretação dos Testes Bioquímicos Atividade 12-B Leitura e Interpretação dos Testes Bioquímicos Atividade 13 Semeadura em Meio Ágar Sangue Atividade 14 Técnica de Semeadura em Anaerobiose Atividade 15 Redução do Azul de Metileno Atividade 16 Antibiograma Atividade 17 Ação de Antissépticos sobre Microorganismos Atividade 18 Conjugação bacteriana Atividade 19 - Preparação para Estudos Microscópicos de Fungos Atividade 20 Microcultivo de Fungos Atividade 21 Estudo dos Vírus

3 MICROBIOLOGIA NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas práticas de microbiologia têm como objetivo ensinar ao estudante os princípios e os métodos utilizados em um laboratório de microbiologia. Nessas aulas trabalharemos com uma variedade de bactérias, algumas patogênicas para o homem. Portanto, é essencial seguir as normas de segurança estabelecidas para um laboratório de microbiologia, a fim de se evitar contaminação dos estudantes, professores e funcionários. 01. Usar sempre avental. Não utilizá-lo fora do laboratório, caso tenha sido contaminado acidentalmente. 02. Manter cabelos longos sempre presos. 03. Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática. Para essa finalidade, utiliza-se álcool 70%. Com este procedimento, os microrganismos que poderiam contaminar as culturas na área de trabalho são removidos. 04. Lavar as mãos ao entrar e sair do laboratório e sempre que suspeitar de contaminação. 05. Não comer, beber, fumar, aplicar cosméticos, mexer em lentes de contato ou colocar objetos (lápis, dedo etc) na boca. Comer ou fumar são meios eficientes para uma autocontaminação. Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com qualquer microrganismo, comunique imediatamente ao seu professor. 06. Cuidado ao utilizar o bico de gás. Ao acender, verificar se não existem substâncias inflamáveis por perto. Ao término da aula, desligar corretamente o gás. 07. Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso. A correta flambagem dos materiais, evita a formação de aerossóis. 08. Não utilizar pipeta sem a devida proteção de algodão. Isso evita que você seja contaminado se estiver pipetando uma cultura bacteriana em caldo. 09. Não colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas etc.) sobre a bancada. Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que serão dispostos em cada bancada. 10. Seguir as normas de uso dos aparelhos. O microscópio é um instrumento de trabalho valioso e deve ser manipulado cuidadosamente. 11. Avisar ao professor em caso de contaminação acidental ou qualquer outro tipo de acidente. 12. Cada aluno é responsável pelo material que receber. 2

4 ATIVIDADE 1 TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM INTRODUÇÃO A coloração de Gram é uma das principais técnicas utilizadas para a visualização microscópica da forma e dos arranjos dos diferentes tipos de bactérias. Considerado um método diferencial, permite classificar as bactérias em Gram positivas ou Gram negativas, de acordo com as propriedades tintoriais da célula bacteriana. MATERIAL material retirado da boca iogurte fermento Fleischmann (fermento biológico) ou fungo Sacharomyces cerevisae culturas bacterianas corante para o Gram lâminas de vidro alça bacteriológica cotonetes violeta genciana lugol álcool 95 fucsina ou safranina recipiente para a coloração de Gram PROCEDIMENTO a) Preparação dos esfregaços: Para Meios Líquidos (iogurte, fermento em água, cultura bacteriana em caldo). Com auxílio da alça de platina estéril, colocar 2-3 alíquotas das amostras em meio líquido, numa lâmina de vidro. Espalhar bem sobre a superfície da lâmina, fazendo movimentos circulares. Flambar a alça e deixar a lâmina secar à temperatura ambiente. Para Meios Sólidos (culturas bacterianas em placa) Com auxílio da alça de platina, colocar uma gota de solução salina na superfície de uma lâmina de vidro. Flambar a alça, deixar esfriar e colher crescimento bacteriano. Misturar na gota de solução salina, fazendo uma suspensão homogênea. Flambar a alça e deixar a lâmina secar a temperatura ambiente. Para Material Retirado da Boca Friccionar a superfície da mucosa oral com um cotonete estéril. Fazer um esfregaço com o material coletado, na superfície de uma lâmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar secar à temperatura ambiente. b) Fixação dos Esfregaços Quando estiverem secos, os esfregaços são fixados, passando as lâminas 3 vezes pela chama de um bico de gás. Deixar esfriar e corar. c) Coloração de Gram Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante no recipiente. Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto e desprender o corante no recipiente. Inclinar a lâmina, gotejar álcool etílico a 95% até que não haja desprendimento de corante. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente. 3

5 Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lâmina. Secar com papel toalha sem esfregar a lâmina. Observar ao microscópio inicialmente ao menor aumento e depois colocar 1 gota de óleo mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão. Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -), a forma e o arranjo das células. Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente. RESULTADOS Desenhe o que você observou caldo iogurte fermento cultura bacteriana em cultura bacteriana em placa material retirado da boca Complete a tabela abaixo. Material Morfologia Arranjo Gram iogurte fermento cultura em caldo cultura em placa material da boca 4

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7 DISCUSSÃO 1. Complete a tabela seguinte, descrevendo o que ocorre na coloração de Gram. Solução cristal violeta Gram + B a c t é r i a Gram - lugol álcool fucsina 2. Como você explica o comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram? 3. As bactérias do gênero Mycobacterium não se coram pelo método de Gram. Qual seria o motivo? 4. Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixação do esfregaço, as bactérias G+ passam a se comportar como G-. Por que isso ocorre? 5. Em geral, os corantes não penetram nas células vivas. Qual a relação entre esta informação e as etapas que você seguiu para realizar a coloração de Gram? 6. Quem idealizou o método de Gram? Qual a primeira bactéria a ser visualizada com esta técnica? 6

8 ATIVIDADE 2 COLORAÇÃO DE CÁPSULA INTRODUÇÃO Certas bactérias Gram + e Gram - produzem cápsula, camada viscosa, externa à parede celular. Essa estrutura não constitui caráter morfológico permanente, aparecendo somente sob certas condições de cultura. A cápsula constitui um dos antígenos de superfície das bactérias e é geralmente formada por polissacarídeos e mais raramente por proteínas. A cápsula pode ser visualizada por coloração negativa onde estruturas que não são coradas, são visualizadas contra um fundo escuro. MATERIAL culturas recentes de bactérias vermelho congo 25 mg/ml ácido hidroclorídrico 0,15 mol/l -1 fucsina de Ziehl-Neelsen lâminas de vidro alça bacteriológica PROCEDIMENTO (Método de White modificado) Colocar 1 a 2 gotas de vermelho congo na extremidade de uma lâmina de vidro. Misturar uma alçada da cultura bacteriana no vermelho congo. Com auxílio de outra lâmina de vidro, espalhar a mistura por toda a lâmina, formando uma película fina. Aquecer fracamente para secar. Cobrir a lâmina que contém a película com ácido hidroclorídrico. Retirar o excesso do ácido, aquecendo rapidamente. Cobrir com fucsina de Ziehl-Neelsen por 10 a 15 segundos. Retirar o excesso de corante e secar delicadamente com papel toalha. Observar ao microscópio. RESULTADO Desenhe o observado e coloque legendas. Cultura A Cultura B 7

9 DISCUSSÃO 1. Por que a técnica é denominada coloração negativa? 2. Qual a forma das bactérias em A? E em B? 3. Se eu fizer coloração para cápsula o que posso dizer sobre o Gram da bactéria? 8

10 ATIVIDADE 3 COLORAÇÃO DE ESPOROS INTRODUÇÃO Esta coloração baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao corante, comparada com o resto da célula bacteriana, tornando possível sua diferenciação. O esporo bacteriano é uma célula de parede espessa formada no interior de algumas bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e a outros agentes químicos e físicos; é capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa. O esporo é, portanto, mais resistente às condições desfavoráveis do meio que a célula vegetativa. A estrutura do esporo é constituída de uma primeira camada interna, próximo ao cerne do esporo - a parede do esporo -, composta de peptidoglicano, a qual vai dar origem à parede da célula vegetativa, por ocasião da germinação. Envolvendo a parede do esporo fica a córtex, camada espessa, composta de um peptidoglicano existente na parede da célula que o originou. Externamente ao córtex fica a capa do esporo, estrutura rígida composta de proteína rica em ligações de dissulfetos intramoleculares; ela confere resistência aos agentes químicos. A camada mais externa recebe o nome de exósporo e consiste numa membrana lipoprotéica que contém aminoaçúcares. MATERIAL cultura bacteriana cultura de solo em meio líquido e sólido verde malaquita safranina lâminas de vidro alça bacteriológica PROCEDIMENTO (método de Wirtz-Conklin) fazer um esfregaço da cultura bacteriana em lâmina e de cultura de solo em outra. secar ao ar. fixar pelo calor. corar a quente durante 6 minutos, com solução aquosa de verde malaquita: aquecer até a emissão de vapores. lavar suavemente em água corrente. corar com safranina, por 30 segundos. lavar suavemente em água corrente. secar ao ar e observar ao microscópio. 9

11 RESULTADO Desenhe o observado com legendas. Cultura bacteriana em caldo Cultura de solo DISCUSSÃO 1. Em qual cor é visto o esporo? E a célula vegetativa? 2. Por que a coloração com verde malaquita é feita a quente? 3. A célula vegetativa retém o verde malaquita após a 1ª lavagem com água? E o esporo? 4. Qual a função da safranina? 10

12 ATIVIDADE 4 COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS ÁLCOOL ÁCIDO RESISTENTES (MÉTODO DE ZIEHL- NEELSEN) INTRODUÇÃO Através desta coloração, podemos visualizar um grupo restrito de bactérias que possuem sua parede celular constituída de grande concentração de lipídeos, devido à presença de ceras e ácidos graxos (ácidos micólicos). O mecanismo da coloração de Ziehl-Neelsen está relacionado com a estrutura e a composição da parede celular de um grupo de bactérias. Estas bactérias possuem a parede celular constituída de lipídeos complexos (ácidos graxos e ceras); é provável que sejam os responsáveis pela propriedade de álcool ácido resistência. Quando os lipídeos são removidos pelo éter, perde-se esta propriedade. Durante a coloração, a fucsina se fixa firmemente a certos lipídeos da parede celular, não sendo removida durante a lavagem com álcool-ácido. Essas bactérias ficam, portando, coradas de vermelho. As bactérias que não contêm alto teor de lipídeos complexos na sua parede celular não retêm a fucsina durante a lavagem de álcool ácido; portanto, adquirem a cor do corante de fundo que é o azul-de-metileno. MATERIAL BCG (bacilo de Calmette e Guerin) Mycobacterium bovis material retirado da boca fucsina de Ziehl-Neelsen álcool-ácido clorídrico azul de metileno lâminas de vidro alça bacteriológica cotonete estéril PROCEDIMENTO cobrir esfregaço seco e fixado pelo calor com fucsina de Zielh-Neelsen; aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos; lavar a lâmina em água, suavemente; cobrir com álcool-ácido clorídrico, por um minuto; lavar a lâmina com água: cobrir o esfregaço com azul-de-metileno (durante um minuto); lavar a lâmina com água; deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão. IMPORTANTE O aquecimento não deve ser muito drástico, a ponto de ferver o corante, mas apenas até ligeira emissão de vapores. A coloração de fundo é feita para corar bactérias e outras estruturas, descoradas prelo álcool-ácido. 11

13 RESULTADO Desenhe o observado e coloque legendas. BCG Material retirado da boca DISCUSSÃO 1. Complete a tabela abaixo: Reação e aspectos da bactéria Soluções em ordem de aplicação BAAR BNAAR 1 - Fucsina de Ziehl Bactérias coradas em Bactérias coradas em 2 - álcool - ácido clorídrico A fucsina se fixa nos lipídeos complexos e não abandona a célula, que permanece A fucsina não se fixa nos componentes da parede celular e abandona a célula, que permanece sem corante no seu interior 3 - azul de metileno A célula não é afetada e permanece A célula adquire o corante, tornando-se 2. Por que os BAAR se coram em vermelho e os outros não BAAR se coram em azul? 12

14 ATIVIDADE 5 COLORAÇÃO DE ESPIROQUETA (MÉTODO DE FONTANA-TRIBONDEAUX) INTRODUÇÃO A técnica utilizada é o método de Fontana-Tribondeaux, que não é propriamente um processo de coloração, mas, sim, de impregnação pelo nitrato de prata. De fato, estes microorganismos não possuem afinidade pelos corantes comumente empregados, razão pela qual coram-se com muita dificuldade. As espiroquetas são bactérias espiraladas, delgadas e flexíveis. As mais finas medem aproximadamente de 0,1 a 0,2 µm de diâmetro e, assim, não podem ser vistas ao microscópio comum, a não ser em campo escuro ou quando tratadas com sais de prata, que se deposita na superfície da bactéria e as tornam mais espessas. Assim as espiroquetas coram-se em marrom-escuro ou negras sobre um fundo castanhoamarelado. MATERIAL material retirado da boca material retirado do aquário solução fixadora álcool absoluto mordente (solução de tanino) solução de nitrato de prata amoniacal lâminas de vidro cotonete estéril PROCEDIMENTO 1. Coloração de espiroquetas colocar material da boca na lâmina e deixar secar ao ar livre ( não fixar pelo calor ); cobrir a lâmina com algumas gotas de solução fixadora e renová-la durante 30 a 60 segundos. cobrir com álcool absoluto e deixar evaporar; cobrir com solução de tanino (mordente), aquecendo a lâmina até a emissão de vapores, durante 30 segundos; lavar em água corrente / água destilada; tratar pela solução de nitrato de prata amoniacal, durante 10 a 15 segundos e em seguida aquecer ligeiramente a lâmina, até o desprendimento de vapores, por 30 segundos (a preparação deve adquire a cor marrom); lavar bem em água destilada; secar com papel-filtro, sem aquecer; examinar com objetiva de imersão. 2. Preparação a fresco Colocar 1 a 2 gotas de água de aquário numa lâmina e cubra com lamínula. Observar ao microscópio com objetiva de imersão. 13

15 RESULTADO Desenhar o observado com legendas. Material da boca Material retirado de aquário DISCUSSÃO 1. Qual o princípio da coloração para espiroquetas? 2. Qual o objetivo da preparação à fresco de espirilos? 3. Após ter realizado as atividades de coloração das bactérias, monte uma tabela com os seguintes dados: - nome da coloração; - microorganismo utilizado; - corantes utilizados; - tipo de coloração. 14

16 Para classificar os tipos de coloração, considere as seguintes informações: 1. Coloração simples: um único corante é aplicado sobre o esfregaço fixado, corando toda a célula. 2. Coloração diferencial: é utilizada uma combinação de corantes, o que possibilita observar as diferenças químicas entre os diferentes tipos de bactérias. 3. Coloração estrutural: utilizam corantes que coram apenas uma parte da célula o que permite distingui-la das demais. 15

17 ATIVIDADE 6 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA INTRODUÇÃO Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microorganismos. Estes meios fornecem os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutritivas estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais minerais. Alguns microorganismos também necessitam de fatores de crescimento que são substâncias que eles não podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos, etc. Outras condições inerentes ao meio de cultura necessário ao desenvolvimento são as condições de ph, pressão osmótica e grau de umidade. De um modo didático, podemos classificar os meios de cultura em diversos tipos, mas na prática vemos que vários deles se enquadram em mais de um tipo. Quanto a Consistência Líquido: Thioglycollate medium (THIO), Brain Heart Infusion (BHI) Semi-Sólido: Sulfeto Indol Motilidade (SIM) Meios de Cultura Quanto a função Sólido: Manitol Salt Ágar (MSA), Ágar Sangue (AS) Enriquecedor: BHI, AS Seletivos: MSA, Mac Conkey (MC) Diferenciadores: MC, AS Manutenção: Nutriente Ágar (NA) Animados: cultura celular Quanto Natural: leite à Inanimados: Sintéticos: MSA Semi-sintéticos: AS Natureza Meio Líquido: é aquele em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa e é desprovido de ágar (polissacarídeo extraído de algas). Meio Semi-Sólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, ágar em porcentagem de 0,5 a 0,7%. Meio Sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes e em torno de 15 g de ágar. Meio Enriquecedor: é aquele que permite o crescimento de microorganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outros. Este meio, além das fontes nutritivas usuais, citadas anteriormente, pode possuir sangue, soro ou extratos teciduais. Meio Seletivo: é aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, porém permitem o crescimento de outros. Pode ser adicionado no meio cristal violeta e outros. Meio Diferenciador: este meio possui substâncias que evidenciam uma característica que permite identificar um grupo ou uma espécie de microorganismo. Meio de Manutenção: este meio mantém os microorganismos viáveis, sem que ocorra uma grande multiplicação que poderia provocar morte celular, devido à eliminação de substâncias 16

18 tóxicas como produtos de metabolismo de microorganismos. Por exemplo, normalmente o meio de manutenção não apresenta glicose porque sua utilização resulta na eliminação de ácidos que podem prejudicar os microorganismos. Meio animado: é formado de células vivas (animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo embrionário). Meio inanimado: não possui células vivas. O natural é aquele que contém substâncias provenientes da natureza e o sintético é formado por substâncias químicas preparadas em laboratório. Semi-sintético: formado pela união de componentes naturais e sintéticos. (ex.: ágar sangue). É enorme a quantidade de meios recomendados para o cultivo de microorganismos e a escolha é feita pelo laboratorista. Os meios usados devem ser frescos e, a não ser em casos especiais, conter ainda umidade. Ao preparar meios de cultura, deve-se ter em mente alguns fatores que podem interferir em um resultado satisfatório de crescimento bacteriano, tal como o ph que, geralmente, é o do meio final, pronto para inoculação e determinado à temperatura ambiente. Outro fator que influencia na preparação é a temperatura. Ao preparar um meio de cultura, não podemos manter à temperatura ambiente uma solução não estéril por mais de uma hora, devido a dois problemas: possibilidade de evaporação de água e crescimento microbiano. O meio seria contaminado com metabólitos bacterianos e teria sua composição inicial alterada: alguns componentes são utilizados pelas bactérias e os demais, pelo efeito da evaporação, se concentram. As soluções não estéreis, não podem também, ser mantidas em altas temperaturas antes de serem autoclavadas, por exemplo, dentro de autoclave quente, esperando o momento conveniente para iniciar a autoclavação, uma vez que haverá quebra de vários ingredientes do meio. Nesta atividade, você vai preparar quatro tipos de meios de cultura, a partir de produtos desidratados: ágar nutriente, caldo nutriente e ágar-ágar. MATERIAL POR GRUPO Balança digital 2 tubos de ensaio 13 x 100 mm (para o meio líquido) 2 tubos de ensaio 13 x 100 mm (para o meio semi-sólido) 2 tubos de ensaio 16 x 100 mm (para o ágar inclinado) 2 placas de Petri esterilizadas 1 pipeta de 5 ml 3 pipetas de 10 ml 2 béqueres de 50 ml (meio líquido e meio semi-sólido) 1 balão de vidro (125 ml) ou erlenmeyer de 125 ml algodão em rama para tampões papel alumínio 1 estante para tubos de ensaio sacos plásticos para embalar os meios de cultura em placa 3 espátulas de madeira 1 tripé e tela de amianto frasco contendo ágar nutriente (em pó) frasco contendo caldo nutriente (em pó) frasco contendo ágar-ágar (pó) água destilada PROCEDIMENTO Preparo do meio líquido Preparar os tampões de algodão para os tubos de ensaio. 17

19 Calcular a quantidade do caldo nutriente desidratado necessário para preparar os 2 tubos de ensaio, com 2 ml de meio líquido cada um. Indicar os cálculos no espaço abaixo. Pesar o meio, transferir para o béquer, acrescentar a quantidade de água destilada necessária. Dissolver o meio, aquecendo-o em bico de Bunsen. Distribuir 2 ml do meio dissolvido em cada tubo. Tampar os tubos com os tampões de algodão. Autoclavar a 121 C por 15 minutos. Preparo do Meio Sólido em Placa Preparo do Meio Sólido em Tubo (ágar inclinado) Calcular a quantidade de ágar nutriente desidratado suficiente para preparar 2 placas de Petri, considerando que serão colocados 10 ml de meio em cada placa e, suficiente também para preparar 2 tubos 16 x 100 mm contendo 4 ml de meio sólido (ágar inclinado). Deixar os cálculos indicados no espaço abaixo. Pesar o meio desidratado e transferir para um erlenmeyer. Acrescentar a quantidade de água destilada necessária para o preparo do meio sólido em placa e em tubo. Aquecer para completa dissolução. Com uma pipeta, distribuir 4 ml de meio para cada tubo. Tamponar os tubos. Tamponar o erlenmeyer com o meio restante. Autoclavar por 15 minutos a 121 C. Distribuir, aproximadamente 10 ml do meio de cultura esterilizado em cada placa de Petri estéril. Este procedimento deverá ser realizado próximo à chama de um bico de Bunsen para evitar contaminação. Manter as placas na posição horizontal até completa solidificação do meio. Manter os tubos de ensaio com o meio sólido em posição inclinada, até completa solidificação do meio. Preparo do Meio Semi-Sólido Calcular a quantidade de caldo nutriente desidratado necessária para preparar 2 tubos de ensaio, contendo 2,5 ml de meio cada. Calcular a quantidade de ágar necessária para obter uma concentração de 0,7% no meio a ser preparado. 18

20 Deixar os cálculos indicados no espaço abaixo. Pesar o caldo nutriente desidratado e o ágar e transferir para o béquer. Acrescentar a quantidade de água destilada necessária para o preparo do meio semi-sólido. Aquecer para completa dissolução. Com uma pipeta, distribuir 2,5 ml do meio em cada tubo. Tampar os tubos com os tampões de algodão. Autoclavar por 15 minutos a 121 C. Manter os tubos em posição vertical até a completa solidificação do meio. Identificação dos Meios Identificar os meios de cultura com o número de seu grupo e de sua turma. Armazenamento dos Meios As placas serão acondicionadas em sacos plásticos. Todos os meios serão armazenados em geladeira. DISCUSSÃO 1. Por que a esterilização é realizada a 121 C e não a 100 C? 19

21 ATIVIDADE 7 TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO Como descrito, os microorganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento in vitro. Mas, além dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu desenvolvimento: são fatores ambientais como temperatura e tensão do oxigênio. Inoculando um microorganismo em um meio de cultura que possua todos os requisitos nutritivos e fatores ambientais adequados, o microorganismo inicia seu desenvolvimento neste meio, passando pelas diversas fases da curva de crescimento: latência, logarítmica, estacionária. A fase logarítmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade ou binária), podendo originar, em meios sólidos, um grupamento de bactérias da mesma espécie, denominado colônia. A colônia bacteriana é visualizada sem o auxílio do microscópio, como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, as colônias podem ser analisadas quanto à elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação. Denomina-se cultura pura quando é observado um único tipo de colônia no meio, e cultura mista, quando se observam vários tipos de colônias. Em microbiologia, há várias técnicas de inoculação, dependendo do objetivo que se quer atingir. Nessa atividade, você vai aprender essas técnicas e para que servem. MATERIAL culturas bacterianas em caldo e em placa. alça de inoculação. agulha (fio) de inoculação. meios de cultura líquido, sólido em tubo (ágar inclinado), sólido em placa, semi-sólido, preparados pelos alunos. IMPORTANTE As seguintes normas devem ser seguidas nas inoculações dos meios de cultura: a) o fio e a alça de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer inoculação, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com meio de cultura: b) os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura devem sempre ser abertos próximos ao bico de Bunsen: c) a boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada e antes da colocação da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balcão, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão direita durante a inoculação. PROCEDIMENTO Identifique todos os meios semeados. Utilize as letras constantes das figuras. 20

22 1. Técnica de semeadura em meios líquidos Inocular as culturas bacterianas em caldo e em placa em um meio líquido, com auxílio da alça de platina. A B 21

23 2. Técnica de semeadura em meio sólido inclinado Inocular a cultura bacteriana em caldo em um meio inclinado fazendo estrias na superfície do ágar, utilizando a alça de platina. C - Caldo -----> alça > ágar inclinado D - placa > ágar inclinado 22

24 3. Técnica da semeadura em meio semi-sólido (picagem profunda) Inocular a cultura de bactérias em caldo em um meio semi-sólido utilizando o fio: a inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma única picada. E fio F 4. Técnica de semeadura em meio sólido em placa (técnica de esgotamento) A técnica do esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfície do meio uma alíquota do material e depois espalhá-lo em dois ou três setores, por meio de alça de platina, sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material. Temos que obter rarefação suficiente do material, de modo a formar colônias perfeitamente isoladas. 23

25 Esta técnica de semeadura é esquematizada a seguir: O sucesso da semeadura está em: a) grande número de estrias; b) não perfurar o meio; c) não voltar a alça sobre a estria d) pegar pequena quantidade de material para semear. Inocular as culturas bacterianas em caldo e em placa, em placas com ágar nutriente. G 24

26 H IMPORTANTE: SEMPRE DEIXE O MATERIAL PRÓXIMO À CHAMA PARA EVITAR CONTAMINAÇÃO EXTERNO. 25

27 26

28 DISCUSSÃO 1. Qual a função dos meios de cultura? 2. Quais são as exigências básicas de um microorganismo? 3. Quanto à consistência, como estão classificados os meios de cultura? 4. O que é um meio seletivo? 5. Como se classifica um meio constituído por células vivas? 6. Após preparar um meio de cultura, é adequado deixá-lo dentro de uma autoclave aquecida, antes da autoclavação? 7. Além dos nutrientes presentes no meio de cultura que outros fatores podem interferir no crescimento bacteriano? 27

29 8. O que você entende por de crescimento bacteriano? 9. Observe o seguinte gráfico: 3 4 nº de bactérias 1 2 Tempo Gráfico 1 Curva de crescimento bacteriano num meio de cultura Um aluno quer estudar a produção de uma enzima por uma bactéria. Utilizou para isso uma cultura bacteriana na fase de crescimento 4. Você concorda? Justifique. 10. Utilizando um cotonete estéril, um aluno recolheu bactérias da garganta de outro aluno. Qual das técnicas de semeadura apresentadas, seria adequada para obtenção de uma cultura pura? 11. Quais as vantagens de se usar meios sólido, líquido e semi-sólido? 12. A partir do crescimento no meio semi-sólido, como poderíamos proceder para identificar a bactéria? 28

30 ATIVIDADE 8 LEITURA DOS EXPERIMENTOS DE SEMEADURA MATERIAL Meios semeados na aula anterior Alça bacteriológica Lupas PROCEDIMENTO MEIO LÍQUIDO Para realizar a leitura dos resultados desta técnica devem-se observar os seguintes itens: a) Quantidade de crescimento: pode ser escassa, moderada ou abundante. b) Distribuição de crescimento no meio de cultura: pode ter crescimento uniformemente distribuído (nitidamente turvo); crescimento confinado à superfície do meio como uma espuma ou filme (película); ou crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso. c) Odor: pode ser pútrido, aromático, ou desprezível. Registrar os resultados no quadro abaixo: A Cultura bacteriana em meio líquido para meio líquido Bactéria item a b c B Cultura bacteriana em placa para meio líquido Bactéria item a b c C - MEIO ÁGAR INCLINADO Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os seguintes itens: a) Quantidade: pode ser descrita como escassa, moderada ou abundante. 29

31 b) Margem ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou nítida, ou mostrando várias irregularidades. c) Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à de manteiga, facilmente removível com a alça de platina: viscosa ou mucóide; seca ou quebradiça. d) Cromogênese ou pigmentação: pode ser opaca, translúcida ou com pigmento. Bactéria item a b c d D - MEIO SEMI-SÓLIDO O modo de se observar um resultado quando utiliza-se esta técnica é o seguinte: Resultado positivo: há crescimento por todo o meio de cultura, semelhante a um "pinheiro invertido". Resultado negativo: há crescimento somente no local da inoculação. Registrar o resultado no quadro abaixo: Bactéria Resultado Interpretação: O meio de cultura utilizado foi o mesmo do item anterior (AN), sendo que o objetivo foi o de verificar a locomoção das bactérias; para tal, foi colocada uma quantidade menor de ágar (7,5 g por 1000 ml de água). 30

32 MEIO DE CULTURA SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA DE ESGOTAMENTO) RESULTADO Quando há desenvolvimento de colônias isoladas na superfície do meio, considera-se o isolamento correto. Neste método verificam-se as características de colônias quanto aos seguintes aspectos: a) tamanho: o tamanho das colônias varia desde dimensões muito pequenas (puntiformes), com apenas uma fração de milímetros de diâmetro, até colônias muito grandes, com 5 a 10 mm de diâmetro. Outras bactérias, como, por exemplo Proteus sp espalham-se sobre toda a superfície do ágar. b) borda: a periferia das colônias bacterianas pode formar muitos desenhos diferentes, dependendo da espécie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, denticulada ou franjada. c) elevação: as colônias podem ser achatadas, espraiadas, convexas (baixa e alta), umbilicada, centro saliente. d) cromogênese ou pigmentação: opaca, translúcida ou com pigmento. e) forma: as colônias podem ser circulares, irregulares ou rizóides. f) consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à da manteiga, facilmente removível com a alça de inoculação: viscosa ou mucóide; seca ou quebradiça. Anotar seus resultados no quadro abaixo: E Cultura de caldo para placa Bactéria Características das colônias Isoladas ou não a b c d e f 31

33 F Cultura de placa para placa Bactéria Características das colônias Isoladas ou não a b c d e f 32

34 ATIVIDADE 9 TÉCNICAS DE SEMEADURA EM PLACA APÓS DILUIÇÃO INTRODUÇÃO Em diversos estudos microbiológicos é necessária a determinação do número de bactérias vivas presentes em uma amostra. Nessa atividade você vai aprender a calcular o número de bactérias em uma amostra previamente diluída. MATERIAL Caldos com cultura de Escherichia coli 2 placas com ágar nutriente 6 tubos contendo 9 ml de salina estéril 1 pipeta (0,1 ml) estéril 2 alças de Drigalski estéreis PROCEDIMENTO Diluir a cultura em caldo de E. coli: passar 0,1 ml da cultura no 1º tubo com salina, misturar bem; transferir 0,1 ml da suspensão do tubo 1 para o tubo 2 e assim sucessivamente até o tubo 6. Colocar 0,1 ml de cada diluição feita sobre as 2 placas com ágar nutriente e espalhar por toda a superfície, com da alça de Drigalski. Incubar a 37º C, por h. RESULTADO Desenhe o observado em cada uma das placas. DILUIÇÃO 1 2 Conte o número de colônias: escolha a placa mais adequada para a contagem. Número total de colônias da cultura em caldo: Deixe os cálculos indicados. 33

35 DISCUSSÃO 1. Faça uma pesquisa sobre a) padrões microbiológicos de balneabilidade. b) como se determina uma infecção urinária. c) como se classifica, microbiologicamente, leites do tipo A, B e C. 2. Relacione o que você aprendeu na atividade realizada no laboratório e as pesquisas realizadas em 1. 34

36 ATIVIDADE 10 TÉCNICA DE SEMEADURA EM PLACA POUR-PLATE INTRODUÇÃO A técnica da semeadura em placa pour-plate pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placa (estudo quantitativo). MATERIAL Escherichia coli cultivada em caldo nutriente 6 tubos de ensaio contendo 0,9 ml de salina estéril 1 placa de Petri estéril 20 ml de meio de cultura (ágar nutriente) fundido pipeta estéril (0,1 ml) PROCEDIMENTO Transferir 0,1 ml da cultura em caldo de E. coli para o tubo 1. Agitar o tubo 1 e transferir 0,1 ml dessa suspensão para o tubo 2. Agitar o tubo 2 e transferir 0,1 ml dessa suspensão para o tubo 3, e assim sucessivamente até o tubo 6. Transferir 0,1 ml do tubo 6 para a placa de Petri estéril.. Colocar 20 ml de ágar nutriente fundido sobre o fundo da placa, realizando movimentos rotatórios, em forma de 8, para a perfeita mistura da cultura com o ágar nutriente (não muito quente para não matar as bactérias). Esperar solidificar, inverter a placa e incubar a 37 o C, por h. Proceder à contagem de colônias (a placa deve ter 30 a 300 colônias no máximo, para ser possível a contagem). Calcular o número de unidades formadoras de colônias / ml. RESULTADO (deixar os cálculos indicados no espaço abaixo) DISCUSSÃO 1. Faça uma pesquisa sobre bactérias heterotróficas, explicando a) O que são essas bactérias. b) Como podem ser utilizadas como padrão de higiene. 35

37 2. Relacione o que você aprendeu na atividade realizada no laboratório e a utilização de bactérias heterotróficas. 36

38 ATIVIDADE 11 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS A PARTIR DE MATERIAL FECAL INTRODUÇÃO A maioria dos estudos de bactérias geralmente envolve uma etapa de isolamento da bactéria e sua identificação. A etapa de isolamento exige a obtenção de colônias bacterianas, de forma isolada, pois a partir de uma delas, será feita a identificação. A etapa de identificação geralmente envolve o cultivo da bactéria, a partir da colônia isolada, em meios de cultura cujos componentes reagem com substâncias produzidas pela bactéria, de modo a permitir a distinção das propriedades bioquímicas do microorganismo estudado e sua identificação. MATERIAL 1 meio de transporte Cary Blair 1 placa com ágar Mac Conkey 1 tubo com meio EPM 1 tubo com meio MILi 1 tubo com meio Citrato de Simmons 1 alça de inoculação 1 fio de inoculação PROCEDIMENTO 1. COLETA DO MATERIAL As fezes deverão ser mantidas em meio de transporte Cary Blair, conforme as instruções do professor, até o momento da semeadura. 2. ISOLAMENTO Utilizando uma alça de inoculação, semear as fezes em uma placa de ágar Mac Conkey, de modo a obter colônias isoladas. Incubar a o C, por 24 horas. 3. SEMEADURA NOS TESTES BIOQUÍMICOS Escolher uma colônia crescida no Mac Conkey e semear, nos seguintes meios de cultura A. EPM - semear com fio de inoculação, picando o meio e semeando em estria na superfície. Anote a cor inicial do meio de cultura: B. MILi - semear com fio de inoculação, picando apenas uma vez o meio de cultura. Anote a cor inicial: Este meio de cultura é transparente ou opaco? C. CITRATO DE SIMMONS - semear com alça de inoculação a superfície do meio. Anote a cor inicial: 37

39 1. MEIO MAC CONCKEY ATIVIDADE 12 - A LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS TESTES BIOQUÍMICOS O meio MC é seletivo para bactérias Gram negativas porque possui sais biliares e cristal violeta, que impedem o crescimento das bactérias gram positivas. O meio é também diferencial devido à presença de lactose na sua composição, que diferencia as bactérias fermentadoras da lactose das que não fermentam este açúcar. O meio possui como indicador de ph o vermelho neutro, que em meio ácido é rosa e em ph alcalino é incolor. Quando as bactérias fermentam a lactose, liberam ácido e suas colônias se tornam róseas. Quando não fermentam o açúcar, as colônias são incolores. RESULTADO Crescimento em Mac Conkey Cor da colônia Fermentação da lactose 2. Provas Bioquímicas Enterokit B O ENTEROKIT B consiste dos meios EPM, MILi e Citrato de Simmons. O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás em glicose, produção de H 2 S, hidrólise da uréia e desaminação do triptofano. O meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina. O Citrato de Simmons oferece o teste de utilização do citrato como única fonte de carbono. Os três meios totalizam 8 testes que somados ao da fermentação da lactose na placa de isolamento, permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas de espécimes clínicos. 2.1 Meio EPM O meio EPM permite investigar:. fermentação da glicose;. produção de: gás, H 2 S, urease, L-Triptofano Desaminase (LTD). A. Fermentação da glicose Bactérias que fermentam glicose produzem ácidos que acidificam a base do meio, tornando-a amarela pela viragem do indicador azul de bromotimol (ph ácido = amarelo, ph neutro = verde, ph alcalino = azul). A superfície do meio, que contém O 2, torna-se alcalina (azul), devido a degradação aeróbica da glicose e a utilização de peptonas, que resulta na liberação de amônia. Quando a bactéria não fermenta glicose, a cor da base do meio permanece inalterada (verde). B. Produção de gás A formação de gás, a partir da fermentação da glicose, é verificada pela formação de bolhas, ou rachaduras, na base do meio. 38

40 C. Produção de H 2 S Bactérias que possuem a enzima tiossulfato redutase reagem com o tiossulfato de sódio, produzindo H 2 S, que é um gás incolor. Combinando-se com compostos que contêm ferro, ou chumbo, o H 2 S dá origem ao sulfeto correspondente, que tem cor preta. Tiossulfato Tiossulfato de sodio H 2 S (gas incolor) redutase H 2 S + íons Fe sulfeto de ferro (precipitado preto). D. Produção de urease A urease cataliza a hidrólise da uréia em amônia e CO 2, o que torna o meio alcalino. Portanto, no EPM, quando a reação é positiva, a base do meio torna-se azul, ou azul-esverdeada (reação fraca). H 2 N H 2 N uréia C = O + 2 HOH urease CO 2 + H 2 O + 2 NH 3 E. Produção de L-triptofano desaminase (LTD) A desaminação oxidativa do L-triptofano catalisada pela L-triptofano desaminase resulta na formação de cetoácido que, em presença de ferro provoca o desenvolvimento de cor verdegarrafa na superfície do meio. A. Cor do base EPM superfície fermentação da glicose B. Presença de bolhas ou rachaduras Produção de gás C. Presença de precipitado preto Produção de H 2 S D. Cor da base do meio. Produção de urease E. Cor da superfície do meio Produção de LTD 2.2. Meio MILi Permite investigar:. motilidade. produção de: indol, lisina descarboxilase. A. Motilidade 39

41 As bactérias móveis (que possuem flagelos), quando inoculadas em meio sem-sólido, se movimentam, turvando total ou parcialmente o meio. As imóveis só crescem no local onde foram inoculadas. B. Produção de lisina descarboxilase A descarboxilação da lisina resulta na formação de amina (cadaverina) que torna o meio alcalino. L-lisina L lisina cadaverina + CO 2 descarboxilase A enzima é formada apenas quando a bactéria é cultivada em meio ácido, na presença do substrato. O indicador de ph do MILi é o bromocresol púrpura, que em ph ácido vira a cor do meio para amarelo, e em ph neutro, ou alcalino, para roxo. O MILi, além de outros componentes, contém lisina e glicose. Quando a lisina não é descarboxilada, o meio torna-se ácido (amarelo), devido a fermentação da glicose. Quando a lisina é descarboxilada, o meio torna-se alcalino, passando de amarelo para roxo. Reação positiva: O meio adquire cor roxa discreta ou acentuada. Reação negativa: O meio adquire cor amarela nítida, nos seus 2/3 inferiores. C. Produção de indol A enzima triptofanase, produzida por certas bactérias, cataliza a degradação do triptofano, o que resulta na produção de indol. L-triptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico + amônia. O indol pode ser detectado pela adição de 3 a 4 gotas de uma solução de p-dimetilaminobenzaldeído Reativo de Kovacs) na superfície do meio. O desenvolvimento de um anel de cor rosa, ou vermelha, indica presença de indol. Quando a reação é negativa, o anel conserva a cor do reativo. Nota: Só colocar o reativo de Kovacs após a leitura dos testes de motilidade e lisina. A. Modo de crescimento Motilidade B. Cor do meio Produção da lisina descarboxilase C. Formação do anel cor de rosa Produção de Indol 2.3. Meio de Citrato de Simmons Permite determinar se uma bactéria é capaz de utilizar citrato como única fonte de carbono para o seu metabolismo. O meio também contêm sais inorgânicos de amônio. Um microrganismo que utiliza o citrato, como única fonte de carbono, também utiliza os sais de amônio como única fonte de nitrogênio. A utilização dos sais de amônio resulta na formação de amônia (NH 3 ), que provoca alcalinização do meio. O meio contêm como indicador do ph o azul de bromotimol (ph alcalino = azul; ph neutro = verde, ph ácido = amarelo). 40

42 Reação positiva: crescimento bacteriano na superfície do meio e desenvolvimento de cor azul (ph alcalino). Reação negativa: ausência de crescimento e a cor do meio permanece inalterada (verde). Crescimento Cor do meio Utilização de citrato Após leitura de todos os testes consultar a tabela 1 para identificar a bactéria. Identificação da bactéria: 41

43 TABELA 1 - IDENTIFICAÇÃO DE ALGUMAS ENTEROBACTÉRIAS PELOS TESTES DOS MEIOS EPM, MILi e CITRATO Lactose EPM MILi Citrato Enterobactéri a (Mac Gás H 2 S Urease LTD Mot. Lisina Indol Conkey) E. coli V a V EIEC,outros, E. coli V - + Enterobacter Klebsiella pneumoniae V - Shigella, EIEC Salmonella V Citrobacter freundii Serratia Providencia rettgeri V - Yersinia enterocolitica V Proteus mirabilis V Proteus vulgaris DISCUSSÃO 1. Seria adequado semear o iogurte no meio de Mac Conkey? Justifique. 2. Seria adequado utilizar essa série bioquímica para identificar estafilococos? Justifique. 42

44 ATIVIDADE 12 - B LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS TESTES BIOQUÍMICOS Amostra: 1. Meio Mac Conkey Crescimento em Mac Conkey Cor da colônia Fermentação da lactose 2. Meio EPM A. Cor do base EPM superfície fermentação da glicose B. Presença de bolhas ou rachaduras Produção de gás C. Presença de precipitado preto Produção de H 2 S D. Cor da base do meio. Produção de urease E. Cor da superfície do meio Produção de LTD 3. Meio MILi A. Modo de crescimento Motilidade B. Cor do meio Produção da lisina descarboxilase C. Formação do anel cor de rosa Produção de Indol 43

45 4. Meio Citrato de Simmons Crescimento Cor do meio Utilização de citrato IDENTIFICAÇÃO DA BACTÉRIA: 44

46 ATIVIDADE 13 SEMEADURA EM MEIO ÁGAR SANGUE (AS) INTRODUÇÃO O ágar sangue é classificado como meio enriquecedor porque é rico em nutrientes. É também diferenciador porque indicar se a bactéria produz ou não uma proteína denominada hemolisina. Essa proteína hemolisa as hemácias presentes no meio. Assim, a bactéria que produz hemolisina, forma uma colônia com um halo transparente em seu redor. A hemólise pode ser total (halo bem transparente: β-hemólise) ou parcial (halo esverdeado: alfa hemólise). Se a bactéria não produzir hemolisina, a colônia não forma o halo ao seu redor (gama hemólise). MATERIAL 2 cotonetes estéreis 1 tubo com salina estéril 1 placa com meio ágar sangue 1 frasco conta-gotas com água oxigenada palitos de dente lâminas de vidro material para coloração de Gram PROCEDIMENTO Dividir a placa ao meio, utilizando caneta para retroprojetor. Coletar, com auxílio de um cotonete, material de mucosa bucal ou nasal. Semear, por esgotamento, numa das metades da placa. Umedecer o outro cotonete em salina e coletar material da superfície da pele. Semear, por esgotamento a outra metade da placa. Incubar a placa a 37 0 C por h. Observar na placa se há formação de halos de hemólise. Teste da Catalase Com auxílio de um palito, transferir a colônia a ser testada para uma lâmina, contendo 1 gota de água oxigenada. Observar o desprendimento de bolhas. Coloração de Gram Realizar a coloração de Gram nas colônias testadas (ver pág. 3). DISCUSSÃO 1. Comparando o meio ágar sangue com o meio Mac Conkey, podemos afirmar que o primeiro é seletivo? Justifique. 2. Por que o meio ágar sangue é considerado diferenciador? 3. Há possibilidade de identificar as bactérias isoladas neste experimento? 45

47 RESULTADOS Completar a tabela com as características gerais das colônias. Colônias (*) Tipo de hemólise Teste da catalase Gram Morfologia (*) anotar características como cor, tamanho etc 46

48 ATIVIDADE 14 TÉCNICA DE SEMEADURA EM ANAEROBIOSE INTRODUÇÃO As bactérias apresentam diferenças a sua necessidade de O 2, sendo classificadas em: 1. aeróbicas estritas: não crescem na ausência de O microaerófila: crescem melhor em uma atmosfera com baixo teor de O anaeróbicas estritas: crescem somente na ausência de O anaeróbicas facultativas: crescem tanto na presença quanto na ausência de O 2. Nessa atividade você vai conhecer um método para se cultivar bactérias. MATERIAL 1 cotonete estéril 1 placa contendo ágar chocolate 1 jarra de plástico com tampa 1 vela PROCEDIMENTO Com auxílio do cotonete, coletar material da mucosa nasal ou faringe. Semear, por esgotamento, na placa com ágar chocolate. Colocar a placa dentro da jarra, colocar a vela acesa em cima da placa e fechar a jarra. Incubar a 37 C, por h. LEITURA Observar a placa para visualizar colônias. Fazer coloração de Gram. Desenhar o observado. RESULTADOS 1. Descrever o aspecto geral das colônias encontradas. 2. Desenhar o observado na coloração de Gram. Morfologia: Gram: DISCUSSÃO 1. Pesquisar bactérias que crescem, preferencialmente, no ambiente estudado nesta prática. 2. Relacionar o uso de vela, como feito nesta prática, com o uso de água oxigenada ao se trabalhar com bactérias anaeróbicas estritas. 47

49 ATIVIDADE 15 REDUÇÃO DO AZUL DE METILENO INTRODUÇÃO O azul de metileno age como aceptor de hidrogênio, descolorindo-se. A rapidez da descoloração indica a taxa de oxidação. Se o azul de metileno for colocado em contato com o ar ou o oxigênio, será reoxidado, reaparecendo a coloração azul. CH3 CH3 N S N N CH3 CH3 Cl + 2 H Azul de Metileno Colorido CH 3 CH 3 N S N CH 3 N CH 3 Cl + HCl H Azul de Metileno Incolor MATERIAL Azul de metileno 0,005% (conserva-se em geladeira por 1 semana) 4 tubos de ensaio estéreis 4 pipetas de 10 ml estéreis amostras de leite (tipo A, B, C, longa vida) PROCEDIMENTO Agitar a amostra de leite. Colocar em um tubo estéril 10 ml de cada amostra de leite. Acrescentar 1 ml de azul de metileno. Misturar bem. Incubar a 37 C. Anotar a cor inicial: 48

50 Observar as amostras depois de 10 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas. Anotar a cor na tabela abaixo. Amostra Leite A Leite B Leite C Longa vida nº de bactérias Leitura 10 min 15 min 30 min 1 hora 2 horas 3 horas INTERPRETAÇÃO menos de 15 minutos: excessivamente contaminado 15 a 60 minutos: fortemente contaminado 1-3 horas: ligeiramente contaminado mais de 3 horas: satisfatório Na contagem, os resultados são os seguintes: menos de 2 h 30 min: + de de germes 2 h 30 min a 4 h 30 min: + de germes mais de 4 h 30 min: - de germes. DISCUSSÃO 1. De que modo a mudança de cor indica multiplicação bacteriana? 2. As amostras de leite analisadas são adequadas ao consumo? 49

51 ATIVIDADE 16 ANTIBIOGRAMA INTRODUÇÃO O antibiograma é uma prova de sensibilidade aos antimicrobianos utilizada para alguns grupos de bactérias, principalmente para os que adquirem resistência facilmente, como Enterobactérias, Pseudomonas, Staphylococcus, etc. O tratamento eficaz de uma infecção por essas bactérias implica na realização do antibiograma da bactéria isolada, a partir do material clínico. Nesta atividade vamos realizar antibiogramas de culturas de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Cada grupo trabalhará com uma amostra diferente. MATERIAL 1 placa com ágar Müeller-Hinton 2 cotonetes estéreis 1 tubo contendo salina estéril 1 pinça 1 frasco com álcool discos de antibiograma culturas em caldo de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Escala de Mac Farland - padrão de turvação: intensidade de multiplicação - fórmula nefelométrica de Mac Farland - Cloreto de bário em ácido sulfúrico - Sulfato de bário (precipitado) PROCEDIMENTO 1. Embeber o cotonete na cultura bacteriana e diluir salina até obter turvação similar aquela do padrão da escala de Mac Farland (10 8 bactérias/ml). 2. Embeber o mesmo cotonete na cultura diluída em salina, retirar o excesso comprimindo-o contra a parede interna do tubo e fazer uma semeadura uniforme em toda a superfície da placa de Müller-Hinton em três direções, conforme esquema abaixo. 3. Deixar a placa secar e aplicar os discos de antimicrobianos com uma pinça, que deve ser sempre flambada. É conveniente marcar com a caneta na base da placa de Petri os locais onde os discos serão colocados. Pressioná-los levemente com a pinça após a aplicação. 50

52 4. As placas serão incubadas a 37 0 C por h e lidas na próxima aula. LEITURA DO ANTIBIOGRAMA 5. Medir o diâmetro dos halos de inibição com o auxílio de uma régua, anotar os dados e interpretar os resultados utilizando a tabela anexa. RESULTADOS 1. Resultados do seu grupo Bactéria utilizada: Bactéria Antimicrobiano Diâmetro do halo Interpretação (R - I - S) 2. Resultados da classe Amostra Modelo de Resistência 51

53 52

54 DISCUSSÃO 1. É possível encontrar amostras da mesma espécie com padrões de sensibilidade diferentes? 2. Uma pessoa está com uma infecção urinária. Foi identificada a bactéria Pseudomonas sp. De acordo com os resultados obtidos, qual(is) antibiótico(s) não deveria(m) ser utilizado(s)? Justifique. 53

55 TABELA I Tabela para interpretação de halos de inibição (*) antibacterianos para organismos Gram positivos e negativos Conc. Zona de Inibição em mm Antibacterianos Discos Código (a) (a) Moder. Resistente intermediári sensível Sensível o Amicacina (b) 30 µg AMI Ampicilina (c) - p/ Gram negativos entéricos 10 µg AMP p/ Staphylococcus (d) 10 µg AMP p/ Haemophilus sp (e) 10 µg AMP p/ enterococos (f,g) 10 µg AMP (g) - p/ estreptococos não enterococos (f,g) 10 µg AMP Carbenicilina - p/ Enterobactérias (d) 100 µg CAR p/ Pseudomonas 100 µg CAR Cefazolina (h) 30 µg CFZ Cefotaxima (h) 30 µg CTX Cefoxitina (h) 30 µg CFO Cefalotina (h) 30 µg CFL Cefoperazona (h) 75 µg CPZ Ceftazidima (h) 30 µg CTZ Cefuroxima (h) 30 µg CRX Cloranfenicol 30 µg CLO Clindamicina (j) 2 µg CLI Doxiciclina (l) 30 µg DOX Eritromicina 15 µg ERI Estreptomicina 10 µg EST Gentamicina (b) 10 µg GEN Minociclina (l) 30 µg MIN Nalidixico. Ac (i) 30 µg NAL Netilmicina (b) 30 µg NET Nitrofurantoina(i) 300 µg NIT Oxaciclina - p/ Staphyloccocus (m) 1µg OXA p/ pneumococus penicilina sensível (e) 1µg OXA Penicilina G - p/ Staphylococcus (d) 10 UI PEN p/ N. gonorrhoeas 10 UI PEN p/ enterococos (f,g) 10 UI PEN (g) - - outros Gram positivos (f,g) 10 UI PEN Sulfonamidas (i,n) 300 µg SUL Tetraciclina (l) 30 µg TET Trimetoprima (i,n) 5 µg TRI Sulfametoxazil / Trimetoprima 25 µg SUT Tobramicina (b) 10 µg TOB Vancomicina 30 µg VAN (*) Adaptado do NCCLS - (a, b, c,...) ver bula Cefar 54

56 TABELA COMPLEMENTAR II Tabela padrão para interpretação de halos de inibição de antibacterianos não tabulados em I Conc. Zona de Inibição em mm Antibacterianos Discos Código (a) (a) Moder. Resistente intermediári sensível Sensível o Amoxacilina 10 µg AMO segue Ampicilina Bacitracina 10 UI BAC Cefalexina 30 µg CEF Cefaloridina 30 µg CFA Cefadroxil 30 µg CFD Cefapirina 30 µg CFP Cefradina 30 µg CFI Ceftriaxona 30 µg CRO Ciprofloxacina 5 µg CIP Cotrimazina Sulfadiazina + Trimetoprima 25 µg SZT Dicloxacilina 1 µg DIC segue Oxacilina Fosfomicina 20 µg FOS Lincomicina 2 µg LIN Neomicina 30 µg NEO Norfloxacina (**) 10 µg NOR Pefloxacina (**) 5 µg PEF Pipemidico, Ac. (**) 20 µg PIP Polimixina - B 300 UI POL Rifamicina - B 30 µg RFM Rifampicina (**) - p/ N. meningitidis 5 µg RIF p/ outros organismos 30 µg RIF Rifampicina / Trimetoprima (**) 35 µg RIT Sisomicina 10 µg SIS Tianfenicol 30 µg TIA REFERÊNCIAS: 1 - Bauer, A. W.; Kirby, W. M. M.; Sherris, J. C. and Turck, M. - Antibiotic susceptibilly testing by standardized single disc method. Amer. J. Clin. Poth. 45: Federal Register. col. 37, nº 191, September NCCLS (National Commithes for Clinical Laboratory Standards). Oct Performance Standard for Antimicrobic Disc Susceptibility Test. Vol. 3. nº Ximenes, J. Importância da padronização da prova de sensibilidade bacteriana (Antibiograma). A Folha Médica vol. 66. nº 3, p (**) Limites fornecidos pelo laboratório detentor do antibacteriano. 55

57 ATIVIDADE 17 AÇÃO DE ANTISSÉPTICOS SOBRE MICROORGANISMOS INTRODUÇÃO Antissepsia consiste na inativação ou redução dos microorganismos presentes no organismo humano ou de outros animais. Para ser eficiente, o agente antisséptico deve afetar diretamente o microorganismo. Nessa atividade, você vai investigar a ação de diversos agentes químicos sobre microorganismos pertencentes à microbiota humana. MATERIAL 1 placa de ágar sangue 3 placas de ágar nutriente 1 recipiente com cepacol 1 frasco com mertiolate 12 cotonetes estéreis 1 frasco com salina estéril iodopovidina (iodo ativo a 10%) 1 sabão em barra PROCEDIMENTO 1. Ação de detergentes (cloreto de cetil peridínio-cepacol) Dividir a placa de ágar sangue em 3 partes e marcá-las: t 0, t 1 e t 2. Friccionar um cotonete estéril na mucosa da bochecha e semear em t 0, em zigue-zague. Bochechar com solução de cepacol, diluído 1:2 em água, durante 1 minuto. Aguardar 3 minutos, repetir a coleta de material e semear em t 1. Repetir o procedimento anterior e semear em t 2. Incubar a placa a 37 0 C por 18/24 horas. 2. Ação do mertiolate Dividir a placa de ágar nutriente em 2 partes e marcá-las: com M, sem M. Passar mertiolate cuidadosamente na palma de uma das mãos. Esperar secar. Umedecer um cotonete estéril e friccionar na palma da mão, onde foi utilizado o mertiolate. Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com M. Umedecer outro cotonete estéril na salina estéril e friccionar na palma da mão onde não foi utilizado o mertiolate. Semear na metade da placa marcada sem M. Incubar a 37 0 C por 18/24 horas. 3. Ação da solução de iodo ativo Dividir a placa de ágar nutriente em 2 partes e marcá-las: com I, sem I. Passar iodo cuidadosamente na palma de uma das mãos. Esperar secar. Umedecer um cotonete estéril e friccionar na palma da mão, onde foi utilizado o mertiolate. Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com I. Umedecer outro cotonete estéril na salina estéril e friccionar na palma da mão onde não foi utilizado o mertiolate. Semear na metade da placa marcada sem I. Incubar a 37 0 C por 18/24 horas. 4. Ação de sabão em barra Dividir a placa de ágar nutriente em 2 partes e marcá-las: com S, sem S. Lavar uma das mãos com sabão e enxugar com toalha de papel. 56

58 Umedecer um cotonete estéril em salina e friccionar na palma da mão lavada. Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com S. Umedecer outro cotonete estéril na salina estéril e friccionar na palma da mão não lavada. Semear na metade da placa marcada sem S. Incubar a 37 0 C por 18/24 horas. RESULTADOS Complete as tabelas com os resultados obtidos. ÁGAR SANGUE Sem cepacol (t 0 ) Com cepacol (t 1 ) Com cepacol (t 2 ) ÁGAR NUTRIENTE Com mertiolate Sem mertiolate Com sabão Sem sabão QUESTÕES 1. Os antissépticos utilizados são eficientes? Justifique. 2. Suponha que a partir dos resultados obtidos, você quisesse comparar a eficiência dos antissépticos testados. Como você poderia fazer? 3. Observe as colônias crescidas no ágar sangue. Alguma produziu hemolisina? Justifique. 4. Faça o teste da catalase com as colônias crescidas em ágar sangue. Quais os resultados obtidos? OBS.: TESTE DA CATALASE Coloque 1 gota de água oxigenada (H 2 O 2 ) na superfície de uma lâmina de vidro. Com auxílio de um palito, retire material da colônia escolhida e misture com a água oxigenada. Observe se ocorreu a formação de bolhas, o que corresponde à resultado positivo: a bactéria em questão produz a enzima catalase. 5. Faça a coloração de Gram para uma colônia catalase +. Qual o resultado? 57

59 ATIVIDADE 18 CONJUGAÇÃO BACTERIANA INTRODUÇÃO Há várias maneiras pelas quais as bactérias adquirem material genético de outras bactérias. A conjugação é um desses processos, e envolve troca de material genético entre duas células bacterianas íntegras e em contato célula-célula. Nessa atividade você vai investigar um processo de conjugação bacteriana que envolve a aquisição de marcas de resistência a antibióticos. MATERIAL 1 ml de caldo nutriente 3 placas de ágar MacConkey contendo ácido nalidíxico (50 µg/ml) e ampicilina (50 µg/ml) 1 placa com ágar nutriente 1 alça bacteriológica 2 amostras bacterianas cultivadas em meio líquido, apresentando as seguintes características: Amostra Fermentação de lactose Marcas de Resistência cromossômica plasmidiais s A (E. coli J53 (pr1)) lac + - Et, Clo, Ap* B (E. coli MA 3456) lac - NaI - *Et = estreptomicina, Clo = cloranfenicol, Ap = ampicilina PROCEDIMENTO: 1. Em um tubo de ensaio adicionar: - 1 ml de crescimento em caldo nutriente da amostra A - 1 ml de crescimento em caldo nutriente da amostra B - 1 ml de meio nutriente. - Incubar a 37 C durante 1 hora no mínimo. 2. Semear as placas contendo meio seletivo MacConkey + NaI50 + Ap50 as amostras A, B e a mistura M. 3. Semear com alça bacteriológica, as mesmas culturas em meio não seletivo. Incubar as placas por horas. RESULTADOS Descreva o que ocorreu nas placas contendo ágar MacConkey e ágar nutriente. DISCUSSÃO 1. Como você interpreta os resultados obtidos? 2. Por que você semeou as amostras em ágar nutriente? 58

60 INTRODUÇÃO ATIVIDADE 19 PREPARAÇÃO PARA ESTUDOS MICROSCÓPICOS DE FUNGOS COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL-ALGODÃO O método com lactofenol azul-algodão é usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras. MATERIAL Culturas de fungos diversos 1 frasco conta-gotas com Lactofenol azul-algodão Lâminas e lamínulas Alças de platina PROCEDIMENTO a) Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina. b) Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de levedura, com auxílio de uma alça de platina estéril. c) Colocar o fragmento da cultura sobre a gota de lactofenol ou a alíquota de levedura. d) Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio na objetiva de 10 e 40 vezes. RESULTADO Visualizar e esquematizar os fungos observados ao microscópio. Fungo: Fungo: Fungo: Fungo: 59

61 DISCUSSÃO 1. Os fungos observados têm a mesma morfologia? Explique. 2. Há alguma classificação dos fungos baseada na morfologia? Exemplifique. 3. Um aluno escreveu que os esporos de fungos têm a mesma função daqueles encontrados nas bactérias. Você concorda? Justifique. 60

62 ATIVIDADE 20 MICROCULTIVO DE FUNGOS INTRODUÇÃO Este método possibilita a obtenção de estruturas em boas condições para o estudo morfológico detalhado. 1ª ETAPA: Preparo do microcultivo MATERIAL 1 Placa de microcultivo esterilizada, montadas conforme o esquema, com o seguinte material 1 placa de Petri 1 pedaço de papel filtro 1 bastão de vidro em U 1 lâmina de vidro 1 lamínula de vidro placas com ágar Sabouraud com culturas de fungos diversos placa de Petri pequena com ágar Sabouraud estéril 1 pinça estéril 1 alça de platina 1 tubo de ensaio com 5 ml de água destilada estéril PROCEDIMENTO Com a pinça, coletar um quadrado de aproximadamente 1 cm de lado, de ágar Sabouraud estéril e colocar sobre a lâmina da placa de microcultivo. Com auxílio da alça de platina, coletar uma alíquota da cultura de fungo e semear num dos lados do quadrado de ágar Sabouraud (veja letra g do esquema). Repetir, semeando no lado oposto. 61

63 Cobrir o ágar semeado com lamínula. Colocar 5 ml de água destilada na placa de Petri, embebendo o papel filtro. Colocar as placas de microcultivo dentro de um recipiente com tampa. Incubar a 37 0 C, durante o período necessário (aproximadamente 1 semana). Incubar a temperatura ambiente, por 12 horas e, a seguir a 37 0 C por 48 horas. 2ª ETAPA - COLORAÇÃO DO MICROCULTIVO MATERIAL 1 placa de microcultivo crescida 1 lâmina de vidro 1 lamínula de vidro 1 pinça 1 frasco com formol a 10% 1 frasco conta-gotas com lactofenol azul algodão recipiente com desinfetante para desprezar o ágar Sabouraud crescido. 1 frasco de esmalte para unhas incolor. papel filtro PROCEDIMENTO Após as colônias estarem crescidas, acrescentar 10 ml de formol a 10% na placa de microcultivo. Aguardar 24 horas: todos os fungos estarão mortos. Numa lâmina de vidro limpa, colocar 1 gota de lactofenol azul algodão. Com cuidado e utilizando a pinça, retirar a lamínula da placa de microcultivo e depositá-la, com a face onde cresceram as colônias de fungos, sobre a gota de lactofenol azul algodão. Com a pinça, retirar o quadrado de ágar Sabouraud da placa de microcultivo e desprezá-lo no recipiente com desinfetante. Colocar 1 gota de lactofenol azul algodão sobre a lâmina de vidro onde estava o quadrado de ágar Sabouraud. Cobrir com lamínula. Temos, então, duas lâminas com as colônias crescidas. Com auxílio do papel filtro, secar o excesso de corante das bordas das lamínulas, dessas duas lâminas, procure não mover as lamínulas. Após as bordas estarem secas, passar o esmalte cuidadosamente nas bordas das lamínulas. Esperar secar e passar novamente o esmalte. Observar ao microscópio e desenhar o observado. RESULTADOS Desenhe os fungos observados com legendas. 62

64 DISCUSSÃO 1. Classifique os fungos observados de acordo com sua morfologia. 2. Por que foi utilizado papel filtro embebido em água? 3. Por que o cultivo foi mantido em recipiente fechado, durante o período de incubação? 4. De acordo com os resultados obtidos nos diversos experimentos, o que você pode dizer a respeito da velocidade de crescimento de bactérias e fungos? Justifique. 63

65 ATIVIDADE 21 ESTUDO DE VÍRUS INTRODUÇÃO Os vírus podem ser estudados, indiretamente, pelos efeitos que causam às células hospedeiras. Nesta atividade, você vai investigar a ação de vírus parasitas de bactérias. MATERIAL Cultura de E. coli 1 placa de Petri com ágar nutriente 1 alça de Drigalski estéril 1 recipiente com álcool 1 pipeta de 1 ml estéril 1 cotonete estéril PROCEDIMENTO Embeber o cotonete na cultura de E. coli, retirar o excesso e semear na placa de ágar nutriente. Esperar secar. Colocar sobre essa semeadura 0,5 ml de esgoto, com auxílio de uma pipeta estéril. Espalhar com alça de Drigalski. Esperar secar. Incubar a 37 C por 24 horas. Observar cuidadosamente a placa, verificando a ocorrência de falhas no crescimento bacteriano. RESULTADO Número de falhas observado: DISCUSSÃO 1. Como você explica a formação dessas falhas? 2. Por que foi utilizado esgoto? 3. A que se relaciona o número de falhas encontrado? 64