FÁBIO DA SILVA MATUDA

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1 FÁBIO DA SILVA MATUDA AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE REPARAÇÃO DOS TECIDOS APÓS A TREPANAÇÃO DE FURCAS DE CÃES, UTILIZANDO-SE PLASMA RICO EM PLAQUETAS, PROTEÍNA DERIVADA DO ÓRGÃO DO ESMALTE E HIDRÓXIDO DE CÁLCIO. Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTOR, pelo programa de Pós-Graduação em Odontologia Restauradora, Especialidade em Dentística. Orientadora: Prof a Adj o Marcia Carneiro Valera São José dos Campos 2005

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3 2 Obrigado meu Deus, Por nunca ter me desamparado mesmo em momentos em que falhei diante de ti. Procurei o Senhor e ele me atendeu; Feliz o homem que se refugia junto dele. Sal 33 5a e 9b.

4 3 Aos meus pais, Joaquim e Diva Minha eterna admiração, amor e orgulho de tê-los como pais e pelo carinho e proteção que sempre me deram. A minha irmã Tangryani Pela amizade, amor e carinho que sempre teve por mim.

5 4 À Minha Orientadora, que teve muita compreensão e paciência durante as etapas finais deste trabalho, sempre me apoiando e incentivando em todos os aspectos da minha vida pessoal e profissional.

6 5 AGRADECIMENTOS À Prof a Adj o Marcia Carneiro Valera, minha orientadora, pela orientação, participação ativa e ajuda na realização deste trabalho. Sem a sua participação e seu profissionalismo este trabalho não seria possível. Sua dedicação pelo ensino é uma lição para todos aqueles estão a sua volta. Ao Prof. Adj o. Clovis Pagani, Coordenador do Programa de Pós- Graduação em Odontologia Restauradora, pela ajuda, compreensão, amizade e esforço durante a minha formação nesta etapa tão importante da minha vida. À Prof a. Titular Maria Amélia Máximo de Araújo, pela determinação e empenho em ensinar a todos nós, minha gratidão e admiração pelo exemplo de profissionalismo e seriedade. A Prof a. Dr a. Yasmin Rodarte Carvalho, pela disposição, pelo convívio e ajuda na execução da leitura, interpretação e fotografia dos cortes histológicos não somente deste trabalho, mas de muitos outros. Ao grande Amigo, Dr. Luis Henrique Cardoso Cipolloti, médico-veterinário do canil da UNISA, pela paciência, participação e colaboração na execução dos experimentos com os animais deste trabalho. A grande amiga Carolina Baptista Miranda, pela participação, ajuda no desenvolvimento deste trabalho. Convivendo, me apoiando e me incentivando não somente nos momentos fáceis, mas também nas horas de maior aflição e tristeza.

7 6 Ao Prof. Dr. José Antonio Silveira Neves, agradeço o apoio, a amizade e a colaboração no desenvolvimento deste trabalho, sem o qual não conseguiria realizá-lo. Ao Prof. Dr. Nelson Luiz de Macedo, difícil são as palavras para descrever a admiração, o carinho e a eterna gratidão que tenho por este amigo e mestre que me ensinou a ser uma pessoa sincera e digna, muitas vezes evidenciando meus erros, mas para que com eles eu aprendesse. Ao meu grande amigo Carlos Magno Goshi, agradeço por ter me ajudado nos momentos mais difíceis que passei na minha profissão. Obrigado pela amizade, pelo carinho e pela força que hoje me inspira e que tenho como exemplo de pessoa e profissional. Ao amigo Luis Guilherme Scavonne de Macedo, agradeço o companheirismo e convívio. Sua dedicação profissional é digna de admiração e inspiração. À amiga Adriana Monteiro, obrigado pelo convívio alegre, pela paciência, e pela ajuda em todos os momentos. Agradeço o companheirismo e o apoio na vida profissional e pessoal. À amiga Marianne Spalding, agradeço o apoio, a paciência e o incentivo. Ao Professor Lafayette Nogueira Júnior, pela participação e convívio profissional, e pela amizade e apoio que me dispõe. Ao Professor Dr. Eduardo Miyashita, pelo incentivo profissional, amizade e confiança em minha pessoa.

8 7 Ao Prof. Ivan Balducci, pela paciência e empenho na análise estatística dos resultados deste trabalho. Aos companheiros do curso de Doutorado, Ricardo, Alexandre Resende, Alexandre Borges, Élson Mello, Neuza, Luzia, Andréia, Cláudio Kubo e Marcelo, agradeço o companheirismo e apoio. Ao amigo Carlos Henrique Ribeiro Camargo, agradeço o convívio, o apoio e a ajuda em todos os momentos. À UNISA Universidade Santo Amaro, por me permitirem utilizar suas dependências e pelo apoio técnico na execução deste trabalho. À Prof a. Dr a. Ingrid Dragan Taricano, responsável pelo Laboratório Unitox e pelo Canil da UNISA, por ceder gentilmente os serviços do Laboratório e animais do canil. Aos Alunos dos 2 0 e 3 0 anos da faculdade de veterinária da UNISA, pela paciência e ajuda na execução da parte experimental. À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro durante o curso de Doutorado. À Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento desta pesquisa. A todos os professores e funcionários do departamento de odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP, por terem me recebido com carinho e disposição e pela atenção que me deram nestes três anos de convivência.

9 8 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS E QUADROS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS RESUMO INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Tratamento com Hidróxido de Cálcio (Ca(OH) Mineral Trióxido Agregado Proteína derivada do órgão do esmalte - EMDOGAIN (EMD) Plasma rico em plaquetas PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODO Procedimentos pré-operatórios e operatórios Eutanásia dos animais Preparo dos espécimes Análise dos espécimes Análise estatística... 5 RESULTADOS Análise descritiva Grupo Ca(OH) 2 / 30 dias Grupo Ca(OH) 2 / 60 dias Grupo Emdogain/ 30 dias Grupo Emdogain/ 60 dias Grupo PRP/ 30 dias Grupo PRP/ 60 dias Análise descritiva dos resultados

10 9 6 DISCUSSÃO Da metodologia Dos resultados CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA ANEXO A ABSTRACT

11 10 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Início do acesso a câmara pulpar. 80 FIGURA 2 Obturação dos canais pela técnica da condensação lateral. 80 FIGURA 3 Trepanação da furca executada com broca 2137F (KG Sorensen- São Paulo). 81 FIGURA 4 Vista oclusal da trepanação realizada no assoalho da câmara pulpar. 81 FIGURA 5 Kit Emdogain gel (Biora R - Espanha). 84 FIGURA 6 Aplicação do Emdogain. 85 FIGURA 7 Câmara pulpar preenchida com Emdogain. 85 FIGURA 8 Coleta de sangue do animal pelo médico veterinário. 87 FIGURA 9 Sangue do animal em tubo anticoagulante. 88 FIGURA 10 Centrífuga para obtenção do PRP. 88 FIGURA 11 Sangue após a primeira centrifugação. 89 FIGURA 12 Plasma após a segunda centrifugação. 89 FIGURA 13 Tromboplastina e cloreto de cálcio. 90 FIGURA 14 Gel de PRP. 90 FIGURA 15 Irrigação do plasma rico em plaquetas líquido (PRP). 91 FIGURA 16 Gel de PRP sendo aplicado na trepanação. 91 FIGURA 17 Gel de PRP extravasado sobre o assoalho da câmara pulpar. 92 FIGURA 18 Radiografia após obtenção do espécime. 95 FIGURA 19 Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Defeito ósseo provocado pela broca. (Tricômico de Masson - Aumento de 25x). (P= perfuração; D= defeito ósseo; I= infiltrado inflamatório intenso). 97 FIGURA 20a Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Infiltrado inflamatório intenso (I). (Tricômico de Masson - Aumento de x). FIGURA 20b Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Detalhe do infiltrado inflamatório. (Tricômico de Masson - Aumento de 400x). ( = neutrófilos; = Macrófagos espumosos). 98 FIGURA 21 Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Fragmentos ósseos no

12 11 interior do defeito. H.E. Aumento de 100x. (*= necrose; = fragmentos ósseos; = infiltrado inflamatório). 98 FIGURA 22 Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Infiltrado inflamatório com predominância neutrofílica. Tricômico de Masson. Aumento de 200x. ( = infiltrado inflamatório com predominância de neutrófilos). 99 FIGURA 23a Grupo Ca(OH) 2-60 dias: Infiltrado Inflamatório moderado a intenso. Tricômico Masson. 100x. ( = infiltrado inflamatório moderado). 101 FIGURA 23b Grupo Ca(OH) 2-60 dias: Detalhe da região do defeito ósseo. Tricômico de Masson. 200x. (*= fibroblastos; = células gigantes mutinucleadas; = material matriz). 101 FIGURA 24a Grupo EMD - 30 dias: Tecido conjuntivo com numerosos fibroblastos jovens. Tricômico de Masson. 100x. (*= fragmentos ósseos com células multinucleadas gigantes; = fibroblastos jovens e volumosos; = infiltrado inflamatório discreto). 102 FIGURA 24b Grupo EMD - 30 dias: Detalhe dos Fibroblastos (*) e vasos sanguíneos congestos ( ). Tricômico de Masson. 200x. 103 FIGURA 25 Grupo EMD - 30 dias: Defeito preenchido com tecido conjuntivo. Tricômico de Masson. 25x. (*= tecido conjuntivo; = tecido de granulação bem vascularizado). 104 FIGURA 26 Grupo EMD - 30 dias: Indícios da formação de matriz óssea. Tricômico de Masson. 100x. ( = osteoblastos jovens e volumosos; = osteócitos). 105 FIGURA 27 Grupo EMD - 30 dias: Início do processo de reparo ósseo na margem do defeito. Tricômico de Masson. 200x. ( = osteoblastos jovens e volumosos). 105 FIGURA 28 Grupo EMD - 30 dias: Detalhe dos osteoblastos e da

13 12 matriz óssea em formação. Tricômico de Masson. 200x. ( = osteoblastos jovens e volumosos; = matriz óssea). 106 FIGURA 29 Grupo EMD - 30 dias: Infiltrado inflamatório moderado mais superficial. H.E. 100x. ( = neutrófilos). 106 FIGURA 30 Grupo EMD - 60 dias: Defeito ósseo preenchido com tecido conjuntivo. Tricômico de Masson. 25x. (*= tecido conjuntivo; = defeito ósseo). 108 FIGURA 31a Grupo EMD - 60 dias: Tecido conjuntivo com grande número de fibroblastos jovens e volumosos, e discreto infiltrado inflamatório. Tricômico de Masson. 100x. (*= discreto infiltrado inflamatório; = fibroblastos). 108 FIGURA 31b Grupo EMD - 60 dias: Osteoblastos na margem do defeito indicando neoformação óssea. Tricômico de Masson. 100x. ( = osteoblasto). 109 FIGURA 32 Grupo EMD - 60 dias: Presença de MTA fagocitado por células gigantes multinucleadas ( ). H.E. 100x. 109 FIGURA 33 Grupo EMD - 60 dias: Trabéculas ósseas circundadas por osteoblastos ( ). Tricômico de Masson. 100x. 110 FIGURA 34 Grupo EMD - 60 dias: Presença de linhas reversas no osso remanescente ( ). H.E. 100x. 110 FIGURA 35 Grupo EMD - 60 dias: Indícios de reparação do topo da crista óssea ( ). Tricômico de Masson. 100x. 111 FIGURA 36 Grupo EMD - 60 dias: Tecido ósseo circundando fragmentos de MTA ( ). H.E. 100x. 111 FIGURA 37 Grupo PRP - 30 dias: Região da perfuração (*) demonstrando o edema local ( ). H.E. 25X. 112 FIGURA 38 Grupo PRP - 30 dias: Osso remanescente circundado por osteoblastos ( ). H.E. 200x. 113 FIGURA 39 Grupo PRP - 30 dias: Edema separando as fibras do tecido conjuntivo ( ). H.E. 100x. 114 FIGURA 40 Grupo PRP - 30 dias: Detalhe da reabsorção ( ) do

14 13 topo da crista óssea. Tricômico de Masson. 100x. 114 FIGURA 41 Grupo PRP - 30 dias: Discreto infiltrado inflamatório. H.E. 200x. ( = células mononucleadas). 116 FIGURA 42 Grupo PRP - 30 dias: Reabsorção das paredes internas do defeito. H.E. 200x. ( = osteoclastos). 116 FIGURA 43 Grupo PRP - 30 dias: Neoformação óssea nas extremidades do defeito. Tricômico de Masson. 200x. ( = osteoblastos). 117 FIGURA 44a Grupo PRP - 30 dias: Detalhe do infiltrado inflamatório na área da perfuração ( ). H.E. 100x. 117 FIGURA 44b Grupo PRP - 30 dias: Tecido conjuntivo próximo a perfuração ( ). H.E. 100x. 118 FIGURA 45 Grupo PRP - 30 dias: Aspecto de vitalidade do osso remanescente. Tricômico de Masson. 200x. ( = osteoblasto, *= osteócitos). 118 FIGURA 46 Grupo PRP - 60 dias: Crista óssea aplainada com a presença de discreto infiltrado inflamatório. Tricômico de Masson. 25x. 120 FIGURA 47a Grupo PRP - 60 dias: Espaços medulares. H.E. 200x. ( = osteoblasto, *= vasos sanguíneos). 121 FIGURA 47b Grupo PRP - 60 dias: Detalhe dos espaços medulares com osteoclastos e grande quantidade de vasos sanguíneos. H.E. 200x. ( = osteoclasto). 121 FIGURA 48 Grupo PRP 60 dias: Região da perfuração. (H.E.- 100X). 122 FIGURA 49 Grupo PRP - 60 dias: Osteoblastos ( ) circundando as trabéculas ósseas. H.E. 200x. 122 FIGURA 50 Grupo PRP - 60 dias: Detalhe dos osteoblastos ( ) e osteócitos (*) das trabéculas ósseas. Tricômico de Masson. 200x. 123 FIGURA 51 Representação gráfica dos escores da intensidade infiltrado inflamatório. 126

15 14 FIGURA 52 Representação gráfica dos escores da reparação óssea. 127 FIGURA 53 Representação gráfica dos escores da reabsorção radicular. 128

16 15 LISTA DE TABELAS E QUADROS QUADRO 1 Divisão dos grupos experimentais. 83 QUADRO 2 Escores dos parâmetros avaliados. 95 TABELA 1 Escores da intensidade do infiltrado inflamatório nos diferentes espécimes dos grupos avaliados. 124 TABELA 2 Escores da reparação óssea nos diferentes espécimes dos grupos avaliados. 124 TABELA 3 Escores da reabsorção radicular nos diferentes espécimes dos grupos avaliados. 125 TABELA 4 Teste de Dunn (5%) da comparação entre tratamentos quanto a reparação óssea- 30 dias. 129 TABELA 5 Teste de Dunn (5%) da comparação entre tratamentos quanto a intensidade do Infiltrado inflamatório- 30 dias. 130 TABELA 6 Teste de Dunn (5%) da comparação entre tratamentos quanto a reparação óssea- 60 dias. 131 TABELA 7 Teste de Dunn (5%) da comparação entre tratamentos quanto a intensidade do Infiltrado inflamatório- 60 dias. 131 TABELA 8 Teste de Dunn (5%) da comparação entre tratamentos quanto a reabsorção radicular- 60 dias. 132 TABELA 9 Reparação óssea. Estatística descritiva e resultado do teste de permutação (p-valor) para comparação de tempos. 132 TABELA 10 Infiltrado inflamatório. Estatística descritiva e resultado do teste de permutação (p-valor) para comparação de tempos. 133 TABELA 11 Reabsorção radicular. Estatística descritiva e

17 16 resultado do teste de permutação (p-valor) para comparação de tempos. 133

18 17 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS PDGF= Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas TGF-β= Fator de Crescimento de Transformação Beta Emdogain= Proteína Derivada do Órgão do Esmalte Emdogain = EMD PGA= Alginato de proprileno glicol RTD= Regeneração tecidual dirigida PRP= Plasma Rico em Plaquetas Ca(OH) 2 = Hidróxido de Cálcio MTA= Mineral Trióxido Agregado IL-1α= Interleucina 1 Alfa IL-1β= Interleucina 1 Beta PPP= Plasma Pobre em Plaquetas µg/ml= micro gramas por mililitros EDTA= Etileno diamino tetra acético

19 18 MATUDA, F.S. Avaliação da capacidade de reparação dos tecidos após a trepanação de furcas de cães, utilizando-se plasma rico em plaquetas e proteína derivada do órgão do esmalte f. Tese (Doutorado em Odontologia Restauradora, Especialidade em Dentística) - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista, São José dos Campos, RESUMO O Objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de reparação dos tecidos após a trepanação de furca de cães, utilizando-se como materiais matrizes o hidróxido de cálcio pró-análise, o plasma rico em plaquetas e a proteína derivada do órgão do esmalte. Para tanto, utilizamos 48 dentes, terceiros e quartos premolares superiores e inferiores de seis cães saudáveis da raça beagle. Os dentes receberam isolamento absoluto, foi realizado o acesso à câmara pulpar, tratamento endodôntico e a perfuração na região central da furca. Foi realizada avaliação nos períodos trinta e sessenta dias. Após a eutanásia dos animais, os dentes foram removidos com o tecido ósseo adjacente, sendo então preparados para serem submetidos à análise histológica, após a descalcificação com solução de ácido Plank e coloração de H.E. e tricômico de Masson. Empregouse para obter os resultados quanto a reparação óssea, intensidade do infiltrado inflamatório e reabsorção radicular, as análises estatísticas de Kruskal-Wallis, teste de permutação e teste de Dunn (5%). Pode-se concluir que os grupos tratados com EMD e PRP apresentaram melhores resultados do que o grupo tratado com Ca(OH) 2, com relação a reparação óssea nos dois períodos observados. Quanto a intensidade do infiltrado inflamatório foi notada somente diferença estatística no período de 60 dias, sendo o grupo EMD e PRP melhores que o Ca(OH) 2. PALAVRAS-CHAVE: Trepanação; endodontia; plasma; plaquetas; animal; in vitro; proteínas do esmalte dentário; hidróxido de cálcio.

20 19 1 INTRODUÇÃO Os dentes quando acometidos por alterações patológicas podem ter como conseqüências, alterações irreversíveis dos tecidos pulpares, necessitando de intervenções endodônticas a fim de eliminar o efeito destas alterações sobre o remanescente pulpar e tecidos periapicais ou até mesmo para impedir a difusão deste processo inflamatório que pode levar a danos de várias extensões ao ligamento periodontal, cemento radicular e osso alveolar. Ao realizar o tratamento endodôntico, alguns fatores como falta de habilidade do operador, desconhecimento ou variações da anatomia do dente, dificuldade de acesso à câmara pulpar e canais radiculares, utilização de instrumental impróprio, podem favorecer a ocorrência de erros como a perfuração de furcas de dentes multirradiculados. A trepanação de furca ou perfuração radicular pode ser causada por reabsorções externas e internas da raíz (NICHOLLS 88, 1962; AGUIRRE et al. 1, 1986), lesões cariosas no assoalho da câmara pulpar (AUSLANDER & WEINBERG 7, 1969), ou por iatrogenia (AGUIRRE et al. 1, 1986; AUSLANDER & WEINBERG 7, 1969). Estas perfurações podem ter como conseqüências clínicas o comprometimento da longevidade do dente, e levar a alterações no plano de tratamento de reabilitação dental (CATHEY 14, 1974). A necessidade de solucionar este tipo de acidente tem levado pesquisadores e clínicos a estudarem materiais e várias alternativas de tratamento a fim de se obter a obliteração destas perfurações. Dentre os materiais aplicados diretamente sobre a perfuração, também denominados de matriz, podemos citar o hidróxido de cálcio (HIMEL et

21 20 al. 43, 1985), Cavit (HIMEL et al. 43, 1985; JEW et al. 59, 1982), fosfato tricálcio (HIMEL et al. 43, 1985), hidroxiapatita (LEMOM 70, 1992) e o mineral trióxido agregado (LEE et al. 68, 1993). Sobre estes materiais são aplicados os materiais de preenchimento, como o cimento de ionômero de vidro, amálgama e resina composta, para promover a obliteração mecânica da perfuração. Entretanto, avaliações clínicas, radiográficas e histológicas demonstraram que nenhum destes materiais foi capaz de promover a regeneração dos tecidos traumatizados. O hidróxido de cálcio puro foi introduzido por Hermann em 1920, com o a finalidade de agir como um anti-séptico biológico forte e, para o tratamento dos tecidos pulpares e para obturação dos canais, sem causar efeitos prejudiciais (LEONARDO 71, 1998). Desde então o hidróxido de cálcio têm sido aplicado em forma de pó, principalmente em casos de tratamento conservador da polpa, ou na consistência de pasta misturada a vários tipos de veículos, como medicação de demora, e como material obturador para estimular o fechamento de ápices abertos (NICHOLLS 89, 1981). Segundo Anthony 4, (1982), a alcalinidade do ph do hidróxido de cálcio, que possui função de neutralizadora do ph em processos inflamatórios, pode sofrer alterações dependendo do tipo de veículo que é utilizado para se obter a pasta, e que isto pode interferir na dissociação dos íons de cálcio e hidroxilas nas suas propriedades indutoras de formação de tecido mineralizado, compatibilidade tecidual e anti-séptica (BINNIE & ROWE 10, 1973; JAVELET et al. 58, 1985). A alcalinidade excessiva do hidróxido de cálcio em muitas ocasiões pode levar a formação de áreas de reabsorção e exposição de dentina (TRONSTAD et al. 117, 1981). A capacidade antibacteriana do hidróxido de cálcio o elege como um excelente material de descontaminação em casos de canais radiculares contaminados, acelerando as funções normais de cicatrização nos tecidos periapicais (MATSUMITA & KITAMURA 79, 1960).

22 21 Inúmeros estudos comprovaram a efetividade deste material devido ao seu alto poder de induzir a formação de tecido mineralizado quando utilizado como material de obturação em casos de dentes sem vitalidade e com ápice aberto. (HEITHERSAY 41, 1970; HOLLAND et al. 44, 1973; GUTMANN & HEATON 31, 1981; GHOSE et al. 28, 1983). A eficiência na utilização do hidróxido de cálcio em perfurações nas regiões de furca pode ser comprovada, sendo caracterizada pela estimulação de formação de cemento hiperplásico e algumas áreas de necrose. (BRAMANTE & BERBET 11, 1987). Atualmente, materiais vêm recebendo destaque em pesquisas devido às suas características de utilização e capacidade de induzir a regeneração, dentre eles, a proteína derivada do órgão de esmalte e o plasma rico em plaquetas. A proteína derivada do órgão do esmalte, comercializada com o nome de Emdogain R (Biora Inc.) têm sido utilizada com sucesso no tratamento de defeitos periodontais (ZETTERSTRÖM et al. 124, 1997; HIROOKA 51, 1998; ROBINSON, et al. 99, 1998; MELLONIG 81, 1999; PONTORIERO et al. 95, 1999; SCULEAN et al. 106, 1999; SILVESTRI et al. 111, 1999). O Emdogain provou ser capaz de regenerar a maior parte dos componentes teciduais da inserção periodontal (HAMMARSTRÖM et al. 35, 1997) e promover a verdadeira regeneração periodontal dos tecidos de suporte perdidos, como novo cemento acelular, ligamento periodontal e osso alveolar (HEIJL 39, 1997). O plasma rico em plaquetas é um material indicado para ser utilizado, principalmente no campo da regeneração óssea guiada e é obtido do sangue do próprio indivíduo durante a intervenção cirúrgica de tratamento. O plasma possui fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator de crescimento de transformação β (TGF-β), e outros que têm a capacidade de intensificar a osteocondução, aumentar a adesão de células migratórias à medula óssea durante o enxerto e aumentar a quantidade e a velocidade do novo osso a ser formado. Esses fatores resultam da degranulação das

23 22 plaquetas (MARX et al. 76, 1998). O plasma rico em plaquetas tem sido utilizado com sucesso em sítios que necessitam de aumento no volume do tecido ósseo em defeitos horizontais e verticais (SHANAMAN et al. 110, 2001; ROBIONY et al. 100, 2002) e do tecido mole (TISCHLER et al. 114, 2002). Diversos trabalhos mostraram a capacidade de regeneração tecidual do Emdogain (EMD) e dos fatores de crescimento presentes no plasma rico em plaquetas (PRP), despertando interesse estudá-los em perfurações de furca.

24 23 2 REVISÃO DA LITERATURA A revisão da literatura foi dividida em tópicos de acordo com os materiais utilizados na pesquisa. 2.1 Tratamento com Hidróxido de Cálcio (Ca(OH) 2 ) Matsumita & Kimura 79 (1960) avaliaram a capacidade do hidróxido de cálcio e outros quatro tipos de desinfetantes na descontaminação de dentes de cães. Foi induzida experimentalmente a contaminação de 215 raízes de 17 cães, por meio de exposição dos canais por um período de vinte a 83 dias, sendo que em 172 casos foi aplicado fenol canforado com terramicina, em 21 casos foi aplicado soro fisiológico e em 22 casos não se aplicou nenhum material. Todos os canais foram preenchidos com hidróxido de cálcio, e os dentes foram observados imediatamente após o preenchimento com a pasta (58 casos), 25 dias após (setenta casos) e após cinqüenta dias (44 casos). Todos os dentes foram removidos e preparados para análise histopatológica e histobacteriológica em microscopia. Os autores observaram que os métodos de esterilização usados agiram superficialmente e por pouco tempo, permitindo a permanência de bactérias não somente nas ramificações apicais, mas também nas lacunas de cemento e túbulos dentinários. Também observaram que o hidróxido de cálcio agiu como um excelente material de preenchimento, acelerando a cicatrização dos tecidos periapicais e

25 24 auxiliou na descontaminação de canais; e a presença de bactérias mesmo em regiões mais profundas, diminuiu e finalmente desapareceu no decorrer do tratamento. Segundo Auslander & Weinberg 7 (1969) as perfurações nas furcas de dentes podem ocorrer como resultado de lesões de cáries no assoalho da câmara pulpar ou adjacente a ele ou iatrogenicamente durante a instrumentação endodôntica ou preparação do canal radicular para colocação de pinos. Heithersay 41 (1970) em estudo clínico com 17 pacientes avaliou clinica e histologicamente a estimulação da formação radicular em dentes com ápice incompleto após o tratamento com hidróxido de cálcio. Vinte e um dentes foram submetidos ao tratamento endodôntico, preenchidos com hidróxido de cálcio e acompanhados por um período de 14 a 75 meses. Um dente com fratura vertical foi extraído e submetido a análise histológica. Durante o período de observação 14 dentes apresentaram desenvolvimento completo da raiz, cinco desenvolvimento parcial e dois nenhum desenvolvimento. A reparação periapical foi observada em vinte dos 21 dentes. Histologicamente não foi observada a deposição da barreira no terço cervical do canal, mas houve a presença de uma fina camada de cemento celular e acelular recobrindo não somente o novo tecido formado, mas também a junção com a raiz remanescente. O autor evidencia a importância da ausência do trauma durante o tratamento endodôntico. Seltzer et al. 108 (1970) relataram que a comunicação dos tecidos de suporte com o sulco gengival na área com perfuração resultaram em lesões irreversíveis do periodonto iniciado pelo trauma da perfuração resultando numa lesão crônica. Binnie & Rowe 10 (1973) realizaram um estudo histológico da influência do Ca(OH) 2 nos tecidos periapicais de dentes de cães com as raízes incompletas. Dentes premolares tiveram suas polpas removidas e foram submetidos aos seguintes tratamentos: 37 canais preenchidos com

26 25 hidróxido de cálcio com água destilada; 19 canais com hidróxido de cálcio mais um composto de sais; 12 canais preenchidos com cimento endodôntico convencional, e dez canais permaneceram abertos sem preenchimento. Após o sacrifício dos animais, os espécimes foram submetidos a análise histológica e os autores observaram que o hidróxido de cálcio apresentou efeito biológico satisfatório, não interrompeu o processo de formação de cemento e levou ao fechamento dos ápices, produzindo menor resposta inflamatória do que o composto de sais associado ao hidróxido de cálcio. Observaram também, que mesmo nos casos de extravasamento para o ligamento periodontal o hidróxido de cálcio com água destilada provocava uma mínima resposta inflamatória. Holland et al. 44 (1973) realizaram um estudo em humanos para comprovar histologicamente as alterações que ocorrem na terapia de indução do fechamento de ápices de raízes incompletas preenchidas com hidróxido de cálcio. Foram tratados 16 canais de dentes de pacientes com idade entre oito e treze anos, onde após o preparo mecânico, os canais foram preenchidos com hidróxido de cálcio e iodofórmio. Dez dentes apresentavam lesão periapical crônica e foram acompanhados radiograficamente; seis dentes estavam intactos e indicados para extração com finalidade ortodôntica. Os dentes foram extraídos trinta dias após o tratamento. A análise radiográfica demonstrou que somente em um dente a lesão não desapareceu. Cinco dentes, com exceção de um, apresentava lesão, exibiram imagem de estrutura radiopaca na região do ápice radicular preenchendo todo o espaço não ocupado pela pasta de hidróxido de cálcio. Histologicamente, os autores observaram a deposição de tecido mineralizado no nível do forame apical, ou um pouco aquém dessa região e que quando a barreira de tecido mineralizado se localizava aquém do ápice, sua estrutura se assemelhava a do cemento e o forame apical permanecia aberto. Quando a morfologia da barreira de tecido mineralizado assemelhava-se a da dentina, o selamento apical se dava pela deposição de cemento. Com bases nestas observações, os autores

27 26 concluíram que o material estudado parecia contribuir favoravelmente à obtenção do reparo desejado. Holland et al. 45 (1980) comprovaram histologicamente a deposição de tecido mineralizado no ápice radicular de dentes de macacos após o preenchimento dos canais com hidróxido de cálcio. Neste estudo, foram utilizados quarenta dentes, onde vinte raízes foram instrumentadas até 1mm do forame apical e vinte raízes instrumentadas 1mm além do forame apical, sendo todos canais preenchidos com hidróxido de cálcio e as aberturas coronárias fechadas com amálgama. Os animais foram sacrificados após noventa dias e os espécimes desmineralizados em ácido fórmico, incluídos em parafina, seccionados com 6µm de espessura e corados com hematoxilina/eosina para permitir a avaliação histológica. Nos dentes nos quais os canais preenchidos com hidróxido de cálcio foram instrumentados 1mm aquém do forame apical, 16 das vinte raízes demonstraram fechamento completo do ápice pela deposição de tecido mineralizado morfologicamente similar ao cemento, sendo que em todas estas raízes, o ligamento periodontal apresentava-se com espessura normal e livre de células inflamatórias sem áreas de reabsorção óssea ou do cemento. Nos canais instrumentados 1mm além do ápice, a maioria dos espécimes (n=12) não apresentou fechamento biológico do ápice, sendo que em oito espécimes ocorreu a invaginação de tecido conjuntivo. O ligamento periodontal dos espécimes que não tiveram seus ápices fechados apresentou moderado infiltrado inflamatório crônico, com algumas áreas de reabsorção óssea ou do cemento. Baseados nestes resultados, os autores comprovaram o fechamento biológico dos canais após o tratamento com Ca(OH) 2 e que o sucesso deste fechamento dependia da não sobre instrumentação dos canais, que poderia levar a presença de fragmentos e coágulo, e da ausência da infiltração marginal do fechamento coronário. Gutmann & Heaton 31 (1981) relataram, em estudo clínico, a capacidade de indução de fechamento do ápice de dentes não vitais

28 27 preenchidos com hidróxido de cálcio. Segundo os autores esta capacidade de promover a reparação é devido a concentração de íons hidroxilas, alto ph, ao estímulo da coagulação sangüínea pelo contato com o hidróxido de cálcio e ação enzimática nos processos de formação de colágeno. Nicholls 89 (1981) demonstrou em estudos clínicos a eficiência do hidróxido de cálcio em estimular o fechamento de ápice de raízes incompletas. O autor informa o cuidado na instrumentação dos canais, na descontaminação e remoção dos tecidos necróticos e evidencia o poder anti-séptico do hidróxido de cálcio. Também relata e eficiência do hidróxido de cálcio no tratamento de capeamento pulpar indireto, devido ao seu efeito anti-séptico, induzindo a formação de dentina mineralizada no local da exposição e sucesso no tratamento endodôntico. Tronstad et al. 117 (1981) estudaram as alterações do ph dos tecidos dentais após o preenchimento do canal com hidróxido de cálcio. Foram selecionados, em macacos, incisivos decíduos com ápices abertos, caninos em esfoliação, incisivos permanentes e caninos nos estágios iniciais de erupção. Foi provocada a necrose em alguns dentes com instrumentação e outros com extração e re-implatação, e após quatro semanas os dentes foram submetidos ao tratamento endodôntico, com exceção de oito incisivos, e executado preenchimento dos canais com hidróxido de cálcio nos dentes re-implatados ou não. Como controle permaneceram cinco dentes vitais. Após quatro semanas os animais foram sacrificados e os espécimes preparados para avaliação microscópica e indicadores de ph. Os autores concluíram que em dentes com necrose pulpar sem tratamento endodôntico o ph era de 6.0 a 7.4, na polpa, dentina, cemento e ligamento periodontal. Dentes re-implantados ou não com completa formação da raiz e tratados com hidróxido de cálcio apresentavam na dentina próxima a polpa o ph entre 8.0 a 11.0, e na dentina mais superficial o ph de 7.4 a 9.6. Em todos os dentes com raízes incompletas, a dentina apresentava ph de 8.0 a Também

29 28 observaram que o ph do cemento não era afetado pelo hidróxido de cálcio e que nas áreas de reabsorção com dentina exposta o ph apresentava-se alcalino. ElDeeb et al. 21 (1982) compararam alterações clínicas, radiográficas e histológicas de três materiais mais comumente usados para reparar perfurações de furcas. Foram utilizados 64 dentes premolares e molares de quatro cães adultos, onde foram realizadas as perfurações com uma broca esférica n o 4 após a remoção da polpa e o preparo dos canais. Os animais foram, então, submetidos aos seguintes tratamentos: em cada quadrante um dente foi preenchido com amálgama, outro com Cavit e um outro dente com hidróxido de cálcio, tendo um quarto dente usado como controle, ou seja, sem aplicação de nenhum material. Em todos os dentes foi utilizado o amálgama como material restaurador final. Durante um período de três meses os dentes foram avaliados clinica e radiograficamente, sendo que após este período, os animais foram sacrificados, e os dentes e as estruturas adjacentes removidas para serem processadas e avaliadas em microscopia óptica. Foram avaliadas histologicamente, a presença do infiltrado inflamatório e sua intensidade, a reabsorção óssea, a neoformação óssea, presença de epitélio e a reabsorção de cemento ou dentina. Os autores concluíram que as perfurações nas furcas possuem pobre prognóstico e que algum grau de inflamação e reabsorção óssea deva ser esperado por causa do trauma da perfuração e dos materiais usados para o selamento. Observaram também que o amálgama possuía a melhor capacidade de selamento das perfurações. Javelet et al. 58 (1985) avaliaram a capacidade do hidróxido de cálcio de promover a formação de barreira calcificada apical em dentes de macacos que foram submetidos ao tratamento endodôntico após a indução experimental de lesão periapical. Foram utilizados incisivos superiores e inferiores com ápice aberto, nos quais foi induzida a lesão periapical por meio da inoculação repetitiva de S. aureus. Após a

30 29 comprovação radiográfica das lesões os dentes foram submetidos ao tratamento endodôntico e preenchidos com hidróxido de cálcio (grupoteste 1), ou cloreto de cálcio (grupo-teste 2) ou mantidos sem preenchimento (grupo-controle). Após três e seis meses os animais foram sacrificados e foi realizada a análise histológica para verificar a formação de barreira no ápice. Os resultados demonstraram que somente os dentes preenchidos com hidróxido de cálcio por um período de três meses tiveram os ápices fechados. Os autores concluíram que a alcalinidade do hidróxido de cálcio é um fator significante na indução de formação de tecido mineralizado. Himel et al. 43 (1985) para o fechamento de perfurações na furca utilizaram materiais como, hidróxido de cálcio, Cavit, fosfato tricálcio e plugs de politetrafluoretileno. De acordo com os resultados obtidos mediante avaliações clínicas, radiográficas e histológicas, nenhum destes materiais demonstrou bom prognóstico quanto ao preenchimento das perfurações de furcas. Neste estudo os autores verificaram melhores resultados com a utilização de plugs de politetrafluoretileno. Bramante & Berbet 11 (1987) realizaram um estudo experimental comparando a resposta inflamatória e a reabsorção óssea após o fechamento de perfurações na furca de dentes de cães com pasta de hidróxido de cálcio, pasta de óxido de zinco e eugenol, tendo como grupocontrole perfurações de furcas mantidas sem o fechamento com material. Foram utilizados 15 dentes premolares de quatro cães adultos que após os procedimentos de anestesia, receberam tratamento endodôntico com isolamento absoluto dos dentes e tiveram suas furcas perfuradas com brocas de 0,7mm de diâmetro e 2,0mm de extensão. Após o controle da hemorragia local com irrigação com solução salina e secagem, os animais foram divididos da seguinte forma, a) grupo 1 aplicação de pasta de hidróxido de cálcio mais iodofórmio na proporção de 2:1; b) grupo 2 aplicação de cimento de óxido de zinco e eugenol; c) grupo 3 furcas mantidas abertas. Em cada animal foram utilizados dois dentes para os

31 30 grupos-teste e dois dentes para o grupo-controle. Os animais foram sacrificados após noventa dias, e os espécimes contendo os dentes e ossos adjacentes foram removidos e processados para análise histopatológica. Para permitir a comparação das respostas aos materiais foram observadas as presenças de células inflamatórias, reabsorção óssea e do cemento, sendo classificada em não significante, média, moderada ou severa, ou a aposição de osso e cemento selando a perfuração. Os autores concluíram que o hidróxido de cálcio foi considerado o melhor material para o fechamento das perfurações, sendo reabsorvido rapidamente quando extravasado no ligamento periodontal, e que gerava uma necrose local com diferentes níveis de hiperplasia do cemento. Já o cimento de óxido de zinco e eugenol causou uma severa resposta inflamatória com formação de abscesso e reabsorção da crista alveolar. Ghose et al. 28 (1987) avaliaram radiograficamente o efeito do tratamento com hidróxido de cálcio e do diâmetro apical na formação de tecido mineralizado. Verificaram ainda o tipo de tecido mineralizado formado. Foram tratados 51 dentes permanentes imaturos despolpados com abertura de ápice em torno de 2mm a 3,5mm de diâmetro. Os dentes foram instrumentados e preenchidos com hidróxido de cálcio e os pacientes foram acompanhados mensalmente. Foi possível observar no período de três a dez meses que em 96% dos dentes houve o desenvolvimento de uma barreira de tecido mineralizado, sendo que nestes dentes 78% desenvolveram a barreira apical no período de cinco a seis meses. Os autores concluíram que o hidróxido de cálcio favorece a deposição de tecido mineralizado em ápices abertos e que o diâmetro desta abertura não influencia no tipo de barreira formada, mas que a infecção pode atrasar o processo de fechamento do ápice necessitando de aplicações adicionais de hidróxido de cálcio. Mackie et al. 75 (1998) demonstraram, em estudo clínico, a alta taxa de sucesso no tratamento com hidróxido de cálcio em induzir o

32 31 fechamento do ápice de incisivos não vitais. Neste trabalho os autores obtiveram uma taxa de sucesso de 96%. O insucesso de três dos quatro dentes que obtiveram insucesso foram associados à re-implantação destes dentes após terem sofrido avulsão. O tratamento realizado em todos os casos consistia na instrumentação 1mm aquém do forame apical e preenchimento dos canais com hidróxido de cálcio. Os autores evidenciaram ainda a influência do fator idade no fechamento de ápices abertos; segundo eles, este fechamento foi mais rápido nos dentes de pacientes jovens com idade de 11 a 15 anos do que nos pacientes com idades mais inferiores. Imura et al. 56 (1998) avaliaram a capacidade de selamento de vários materiais em perfurações de furca de dentes molares. Foram utilizados noventa dentes extraídos, que foram incluídos em gesso paris, tendo suas raízes envolvidas por silicone simulando o ligamento periodontal. Em todos os dentes foi realizada a abertura coronária e, após a localização dos canais radiculares, foi executada a perfuração no assoalho da câmara pulpar. As perfurações foram preenchidas com amálgama, resina composta, sulfato de cálcio sob resina composta e hidróxido de cálcio sob resina composta. Para avaliar a infiltração nestes espécimes, os dentes foram recobertos com duas camadas de esmalte para unhas deixando a área do acesso da perfuração descoberto para, então, serem imersos em tinta por quatro dias a 37 o C. Os dentes foram seccionados longitudinalmente e a mensuração da infiltração foi realizada do nível coronário do material de reparação até o término apical da perfuração. Os autores puderam concluir, com este estudo, que todos os grupos experimentais apresentaram infiltração em variados graus, sem diferenças estatisticamente significantes entre eles. Também observaram que tanto o hidróxido de cálcio quanto o sulfato de cálcio evitavam extravasamento da resina composta para a região do ligamento periodontal.

33 32 Bryan et al. 12 (1999) num trabalho de revisão da literatura relataram que o melhor prognóstico para o tratamento não-cirúrgico das perfurações de furca ocorre quando a intervenção ocorre o mais precoce possível, evitando a contaminação bacteriana e que o material utilizado para o fechamento da perfuração é o mais biocompatível e que possui boas propriedades de selamento. Segundo os autores, o amálgama, o cavit, hidróxido de cálcio, cimento de ionômero de vidro, fosfato tri-cálcio e o osso desmineralizado congelado desidratado, não oferecem resultados consistentes como materiais seladores das perfurações, e que o mineral trióxido agregado surge como um material promissor para esta finalidade. 2.2 Mineral trióxido agregado Lee et al. 68 (1993) desenvolveram um composto de mineral trióxido agregado (MTA). Segundo os autores este material toma presa na presença de umidade, possui radiopacidade, é biocompatível e devido ao seu alto ph (10,2 a 12,5) possui alta capacidade de provocar a formação de tecido duro de reparação sendo indicado como material obturador em cirurgias parendodônticas e em trepanações. Alhadainy & Himel 2 (1994) utilizaram no fechamento de trepanações do assoalho pulpar de sessenta dentes, o amálgama e o ionômero de vidro. O gesso paris foi usado como base dos materiais restauradores, devido as suas propriedades de provocar a reparação óssea. Foi avaliada a capacidade de selamento destes materiais ao teste de infiltração com imersão dos espécimes em eritrozina B a 2% por duas semanas em temperatura ambiente. As avaliações dos cortes histológicos foram feitas em estéreomicroscópio com aumentos de quarenta vezes utilizando uma escala graduada de décimos de

34 33 milímetros. Os autores concluíram que o ionômero de vidro apresentou maior capacidade de selamento que o amálgama, devido a sua capacidade de fluir e selar a parte mais apical da perfuração e a sua adesividade a dentina. Também observaram que o gesso paris atuava como uma eficiente barreira ao extravasamento dos materiais na região da furca, mas não melhorava a capacidade de selamento dos materiais. Ford et al. 25 (1995) avaliaram a resposta histológica do tratamento de perfurações intencionais em furcas de 28 premolares inferiores de cães. Neste trabalho, metade dos dentes perfurados foi tratada com amálgama ou MTA e o restante dos dentes foi deixado aberto permitindo a contaminação salivar antes de serem reparados. O tempo de reparação antes do sacrifício dos animais foi de quatro meses, para então submeter os espécimes a avaliação histológica. Os autores observaram que todos espécimes do grupo tratado com amálgama imediatamente após a perfuração apresentavam resposta inflamatória no sítio da perfuração, enquanto que somente um dos seis espécimes do grupo que utilizou MTA imediatamente após a perfuração apresentava resposta inflamatória. Além disso, estes cinco espécimes apresentavam deposição de cemento sobre o material reparador. Nos grupos que foi permitido a contaminação salivar, todos os espécimes tratados com amálgama apresentavam resposta inflamatória e o grupo tratado com MTA, de sete espécimes, quatro apresentavam resposta inflamatória. Os autores concluíram que o MTA é mais apropriado como material reparador do que o amálgama principalmente se for utilizado logo após a perfuração. Arens & Torabinejad 6 (1996) relataram, num estudo clínico, a utilização do MTA como material obturador de perfurações em furcas de dentes multirradiculares, devido às suas propriedades físicas e biológicas, tornando-o um material apropriado para obliteração de perfurações. Também relataram que as perfurações são acidentes que podem ocorrer durante o tratamento endodôntico e que o pobre prognóstico desses

35 34 acidentes é devido a infiltração bacteriana e ausência da biocompatibilidade dos materiais obliteradores. Bates et al. 9 (1996) avaliaram em períodos de 24h, 72h, duas semanas, quatro semanas, oito semanas e doze semanas, a habilidade de selamento do MTA como material retrobturador. Neste estudo foram utilizados 76 dentes unirradiculares humanos extraídos, que após serem limpos e instrumentados, tiveram seus ápices seccionados, preparados com ultra-som e preenchidos com amálgama, Super-EBA ou MTA, para então os grupos serem submetidos aos teste de infiltração pelo sistema de mensuração com fluído de infiltração. Os autores observaram que nos períodos de 24h, 72h e duas semanas os grupos tratados com MTA e Super-EBA apresentavam microinfiltração menor do que o grupo tratado com amálgama. Também concluíram que o MTA foi superior ao amálgama e comparável com o Super-EBA em prevenir a microinfiltração como material retrobturador. Ford et al. 26 (1996) compararam a resposta do tecido pulpar de macacos, utilizando como material para capeamento direto o MTA e uma preparação de hidróxido de cálcio. Foram utilizados 12 incisivos inferiores, os quais tiveram suas polpas expostas intencionalmente com brocas esféricas número um para então serem tratados com MTA ou hidróxido de cálcio. Após cinco meses os autores observaram que em cinco das seis amostras que utilizaram como material de capeamento direto o MTA, não houve resposta inflamatória, e que as seis polpas capeadas com este material apresentaram formação de ponte dentinária. No grupo tratado com o hidróxido de cálcio todos os espécimes apresentavam inflamação pulpar e somente dois apresentavam formação de ponte dentinária. Concluíram que a alta biocompatibilidade do MTA permitia seu uso como material de capeamento direto. Koh et al. 65 (1997) estudaram a capacidade do MTA em estimular a produção de citocinas por osteoblastos humanos e a aderência destas células a este material obliterador. Foram utilizadas culturas de

36 35 osteoblastos (MG-63) com a presença de MTA avaliando o comportamento destas células quanto à produção de citocinas e osteocalcina e atividade da fosfatase alcalina. Para determinar a presença de interleucinas e osteocalcina foi empregado o teste ELISA. Os autores observaram que as amostras com MTA apresentavam aderência celular, crescimento mais intenso, maior produção de citocinas como, as interleucinas IL-1α, IL-1β e IL-6, e também maior produção de osteocalcina. Também observaram que as células em contato com o MTA apresentavam altos níveis de fosfatase alcalina. Torabinejad et al. 115 (1997) examinaram, em macacos, a resposta tecidual perirradicular ao MTA e amálgama como materiais retrobturadores. Após a remoção da polpa de todos incisivos superiores de três macacos, instrumentação e obturação dos dentes, um retalho mucoperiosteal foi elevado e os ápices das raízes seccionadas e preparadas para receberem os materiais retrobturadores. Após 5 meses as respostas teciduais foram avaliadas histologicamente e os autores observaram que 5 de 6 raízes tratados com MTA não apresentavam inflamação perirradicular e que em todas as amostras havia a deposição de uma completa camada de cemento sobre o material retro-obturador, sendo que o mesmo não fora observado no grupo tratado com amálgama. Os autores evidenciam ainda que o MTA é um material indicado para uso em humanos. Fischer et al. 24 (1998) compararam a microinfiltração bacteriana do MTA, amálgama sem zinco, IRM e Super-EBA como materiais retrobturadores. Utilizaram 56 dentes humanos extraídos, os quais foram preparados com instrumentos rotatórios e tiveram seus ápices seccionados, sendo que em 48 dentes as cavidades apicais foram preparadas com ultra-som numa profundidade de 3mm, para então serem esterilizados. Os materiais foram então aplicados num ambiente asséptico criado por uma câmara de fluxo laminar, sendo que quatro raízes foram obturadas somente com guta-percha plastificada servindo como grupo

37 36 controle positivo e outras quatro raízes apenas cobertas com cera servindo como controle negativo. Em cada raiz foi aplicado 10µl de Serratia marcescens para verificar a microinfiltração bacteriana e seu crescimento em meio de cultura de fenol vermelho. Os autores puderam concluir, após 49 dias, que o MTA não apresentava microinfiltração e como material retrobturador foi o mais efetivo contra a microinfiltração bacteriana. Koh et al. 66 (1998) investigaram comparativamente em cultura de osteoblastos (MG-63) a resposta celular ao MTA e ao IRM. Através do teste Elisa os autores observaram que a cultura com a presença de MTA apresentava altos níveis de interleucinas produzidas pelos osteoblastos. Concluíram que o MTA oferece um substrato biologicamente ativo para os osteoblastos e estimula a produção de interleucinas. Nakata et al. 86 (1998) estudaram a habilidade do MTA e do amálgama como materiais seladores em molares humanos extraídos utilizando um modelo de infiltração bacteriana anaeróbica. Foram realizadas perfurações nas furcas de 39 dentes com brocas em altarotação, obtendo-se dois grupos de estudos (n=18) e três dentes foram utilizados como controle positivo. No grupo-teste 1 foi utilizado o MTA enquanto que no grupo-teste 2 foi utilizado o amálgama. Três dentes adicionais foram utilizados como controle negativo. Uma câmara dupla para o modelo de infiltração de bactérias anaeróbicas foi desenvolvida. Um meio de cultura foi utilizado para permitir o desenvolvimento de Fusobacterium nucleatum. Das 18 amostras tratadas com o amálgama oito apresentaram infiltrações bacterianas, enquanto que no grupo tratado com MTA não foram observadas infiltrações. Os autores concluíram que o MTA foi significantemente melhor do que o amálgama para prevenir a infiltração de Fusobacterium nucleatum em perfurações de furcas. Sluyk et al. 112 (1998) avaliaram a propriedades físicas e as características de retenção do MTA como material reparador de perfurações em furcas. Foram utilizados 32 molares humanos extraídos

38 37 que tiveram suas furcas perfuradas seguindo o longo eixo do dente e a colocação, abaixo das perfurações, de uma matriz de Gelfoam para simular as condições clínicas. Os dentes foram divididos em quatro grupos e as perfurações foram preenchidas com MTA e então acomodadas com cotonetes secos ou úmidos por 24h a 72h. Para avaliar a força necessária para deslocar o material da perfuração, uma máquina de testes Instron foi utilizada, demonstrando que a resistência de deslocamento do MTA era maior no período de 72 horas do que no período de 24 horas. Também foi observado que quando um leve deslocamento ocorria no período de 24 horas, o material demonstrava a habilidade de restabelecer a resistência ao deslocamento das paredes de dentina. A presença de umidade pareceu não interferir na resistência ao deslocamento do MTA. Holland et al. 46 (1999) conduziram um estudo para observar a reação do tecido conjuntivo subcutâneo de ratos à implantação de tubos contendo MTA ou hidróxido de cálcio. Foram utilizados quarenta ratos, onde para cada grupo de vinte animais foram implantados tubos de dentina humanas preparados, autoclavados e preenchidos com MTA e hidróxido de cálcio, utilizando como grupo-controle doze ratos com implantação dos tubos dentinários sem preenchimento de nenhum material. Os animais foram sacrificados sete e trinta dias após a implantação dos tubos e os espécimes foram preparados para análise histológica com luz polarizada e técnica de Von Kossa. No grupo-controle, após sete dias da implantação foi observado ao redor dos tubos uma camada de exsudato de neutrófilos, com a presença de uma população de fibroblastos jovens e células inflamatórias crônicas. Após trinta dias, as amostras apresentaram crescimento de tecido conjuntivo contendo algumas células inflamatórias, em alguns casos preenchendo todos os tubos. Por outro lado, algumas amostras exibiram os tubos rodeados por uma fina cápsula fibrosa caracterizando uma moderada reação inflamatória crônica. No grupo tratado com hidróxido de cálcio, nas

39 38 amostras não descalcificadas foram observadas, a luz polarizada, numerosas granulações birrefringentes e positivas à técnica de Von Kossa e estavam localizadas próximas as aberturas e no interior dos tubos. As amostras descalcificadas também apresentaram área irregular basofílica altamente positiva à técnica de Von Kossa. Circundando esta área havia um tecido conjuntivo com moderado infiltrado inflamatório e células gigantes. No período de trinta dias, foram observadas, as mesmas alterações que no período de sete dias. No grupo tratado com MTA as alterações observadas foram similares ao grupo tratado com hidróxido de cálcio. Os autores observaram que as respostas teciduais eram similares para os dois materiais estudados, sugerindo que o mecanismo de ação dos dois materiais é semelhante, e que apesar de suas constituições serem diferentes, os óxidos de cálcio presente no MTA reage com os tecidos formando um subproduto que é o hidróxido de cálcio. Holland et al. 47 (1999) avaliaram a resposta dos tecidos apicais de cães após o preenchimento com guta-percha e MTA ou ionômero de vidro. Os canais dos dentes dos animais foram instrumentados e obturados com os materiais propostos no estudo. Os animais foram sacrificados seis meses após, e os espécimes foram processados para permitir a análise histológica. O resultado observado foi que nenhum dente do grupo que utilizou o MTA apresentou reação inflamatória nos tecidos apicais, em contraste, o grupo que foi tratado com o ionômero de vidro apresentou dois casos de fechamento parcial e diferentes graus de reação inflamatória crônica. Mitchell et al. 82 (1999) estudaram a biocompatibilidade de variações de MTA com células Humanas de osteosarcoma. Após analisar, pelo teste Elisa, o crescimento celular e as expressões de interleucinas, os autores observaram que o MTA apresentava bom crescimento celular e evidente expressão de IL-6 e IL-8, tornando-o o MTA um material biocompatível e adequado para o uso clínico.

40 39 Salman et al. 102 (1999) estudaram a influência da utilização de membranas absorvíveis na trepanação da câmara pulpar em dentes de cães como base para o cimento de ionômero de vidro modificado por resina. Neste estudo foram realizadas perfurações com 1mm de diâmetro no assoalho da câmara pulpar dos segundos, terceiros e quartos premolares. As perfurações foram tratadas com cimento de ionômero de vidro modificado com resina e com o mesmo cimento sobre uma barreira absorvível. Os animais foram sacrificados após três meses e os espécimes foram processados para avaliação em microscopia óptica e histomorfometria. Avaliando os parâmetros, extensão do processo inflamatório, reabsorção do cemento, reabsorção da dentina, presença de epitélio e altura óssea, os autores concluíram que a utilização de barreira absorvível não obteve resultados melhores do que as perfurações tratadas somente com o cimento de ionômero de vidro. Shabahang et al. 109 (1999) realizaram um estudo comparativo sobre a indução de apicificação de dentes de cães, utilizando a proteína osteogênica-1, o MTA e o hidróxido de cálcio. Foram utilizadas 64 raízes de premolares, as quais após a indução de lesão perirradicular tiveram seus canais debridados e preenchidos com hidróxido de cálcio por uma semana. Após este procedimento, o hidróxido de cálcio foi removido e os canais preenchidos com os materiais propostos. Os animais foram sacrificados após 12 semanas para permitir a análise histomorfológica quanto ao grau de tecido duro formado e a quantidade de inflamação presente. Os autores puderam observar que o grupo tratado com o MTA apresentou formação apical de tecido duro com maior consistência em comparação aos outros grupos. Schwartz et al. 104 (1999) afirmaram que o MTA é um material significantemente melhor do que outros materiais para procedimentos em osso, pois permite o sobre crescimento de cemento e pode facilitar a regeneração do ligamento periodontal. Também relatam a utilização do MTA em diferentes aplicações clínicas para resolução de problemas

41 40 como: fratura vertical da raiz, apicificação, reparação de perfuração e de defeito de reabsorção, onde obtiveram a eliminação dos sintomas clínicos e cicatrização óssea. Evidenciaram que outros materiais como a resina e o óxido de zinco eugenol, usados no passado levavam a formação de tecido conjuntivo fibroso adjacente ao osso. Torabinejad & Chivian 116 (1999) relataram após os estudos iniciais com o MTA, um protocolo de aplicação clínica deste material no capeamento pulpar de dentes com pulpites reversíveis, apicificações, reparação cirúrgica ou não cirúrgica, perfurações de raízes e como material de preenchimento de ápices radiculares. Neste trabalho, os autores recomendam que para as perfurações radiculares o tratamento deve seguir uma seqüência de tratamento que será: anestesia; isolamento absoluto; localização da perfuração e irrigação com hipoclorito de sódio diluído; se o dente apresentar contaminações ou perfuração por longo período, o agente irrigador é deixado por alguns minutos; instrumentação completa e obturação com cones de guta-percha. O selamento da perfuração é executado misturando-se o MTA com água estéril e colocado por meio de um porta-amálgama na perfuração e condensado com um cotonete úmido para então proceder a obturação do acesso cavitário com material temporário por 3 a 4 horas e um material permanente. Estrela et al. 22 (2000) investigaram a ação antimicrobiana e química do MTA e cimento de Portland, pasta de hidróxido de cálcio, Sealapex e Dycal. Para analisar a atividade antibacteriana foram utilizadas amostras dos seguintes microorganismos: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans e uma mistura de todos microrganismos. Trinta placas de Petri com 20mL de ágar BHI foram inoculadas com 0,1mL das suspensões de microrganismos, sendo que em cada placa foram realizadas três cavidades que foram preenchidas com os materiais testes. As placas foram então incubadas a 37 0 C por 48 horas para permitir a avaliação da inibição microbiana por halo. Para analisar a composição

42 41 química do MTA e do cimento de Portland foi utilizado um raio-x de espectrometria fluorescente. Os autores concluíram que a pasta de hidróxido de cálcio apresentava maior inibição microbiana e que o cimento de Portland possuía a mesma constituição que o MTA. Keiser et al. 63 (2000) propuseram estudar a citotoxidade do MTA a outros materiais retrobturadores como o amálgama e o Super-EBA. Para permitir esta comparação foi utilizado um meio celular viável para atividade de-hidrogenase mitocondrial em fibroblastos do ligamento periodontal de humanos. Os autores puderam concluir, após um período de exposição de 24 horas, que o MTA pode ser empregado como material retrobturador. Moretton et al. 84 (2000) avaliaram a biocompatibilidade da implantação subcutânea e intra-óssea em ratos do MTA e do cimento de ácido etóxibenzóico. As reações teciduais foram estudadas nos períodos de 15, trinta e sessenta dias após a implantação. O MTA causou inicialmente severas reações como necrose de coagulação e calcificação distrófica, mas que diminuíram com o tempo. Os autores concluíram que as duas substâncias causavam menor resposta à implantação óssea do que a subcutânea, evidenciando assim, as características osteocondutivas destes materiais. Zhu et al. 125 (2000) observaram mediante microscopia eletrônica de varredura, a adesão de osteoblastos humanos ao MTA, IRM, resina composta e amálgama. Após a obtenção de espécimes dos materiais com 1mm de espessura e manutenção destes discos por um dia na cultura celular, os autores observaram osteoblastos aderidos e espalhados nos espécimes de MTA e resina formando uma mono camada. Já no grupo teste que utilizou o amálgama havia adesão celular, mas em menor quantidade, em contraste com o grupo do IRM que não apresentava adesão celular. Faraco Junior & Holland 23 (2001) estudaram a resposta pulpar em cães, após o capeamento pulpar direto com o MTA e o hidróxido de

43 42 cálcio. Após a exposição pulpar intencional de trinta dentes, foi realizado o capeamento pulpar com os dois materiais testes. A análise histológica foi feita dois meses após o tratamento. Nas exposições pulpares capeadas com MTA não havia presença de inflamação e todas as amostras apresentavam completa formação de ponte de dentina. No grupo tratado com hidróxido de cálcio apesar da formação da ponte de dentina, algumas amostras apresentavam inflamação pulpar. Os autores concluíram que o MTA apresentava resultados melhores do que o hidróxido de cálcio em capeamento pulpar de cães. Holland et al. 48 (2001) compararam o efeito do cimento de Portland e do MTA no processo de cicatrização da polpa dental de cães após a pulpotomia e capeamento pulpar direto. Foram utilizadas 26 raízes de cães que após a pulpotomia, tiveram as entradas da polpa radicular protegida com os dois cimentos citados. Sessenta dias após o tratamento os animais foram sacrificados e as amostras obtidas para a análise histomorfológica. Os autores puderam concluir que tanto o MTA quanto o cimento de Portland apresentavam resultados similares quando utilizados como material de proteção direta após a pulpotomia. Holland et al. 49 (2001) realizaram um estudo para observar o processo de cicatrização na reparação de perfuração intencional lateral de raízes com a aplicação do MTA. Os autores induziram a perfuração lateral de raízes de 48 dentes de cães beagle, para então repará-las com o MTA ou cimento Seaplex (grupo controle). Após trinta e 180 dias os espécimes obtidos foram submetidos à análise histológica e foi observado que o MTA apresentou melhores resultados quanto à cicatrização em relação ao grupo tratado com Sealapex. Holland et al. 50 (2001) realizaram um estudo comparativo para avaliar a reação do tecido conjuntivo subcutâneo de ratos à implantação de tubos dentinários preenchidos com MTA, cimento de Portland (PC) e hidróxido de cálcio (CH). Tubos dentinários de humanos foram preparados a partir de canais radiculares dilatados acima da lima número

44 43 35 com a sobre instrumentação do forame apical em 2mm, os túbulos obtidos apresentavam comprimento de 7mm e espessura de paredes de 0,5mm. Os tubos eram então, irrigados por completo, com hipoclorito de sódio e EDTA e posteriormente lavados em água destilada antes de serem autoclavados. Após a esterilização os tubos foram preenchidos, na presença de água destilada, com MTA, com cimento de Portland e com hidróxido de cálcio, para serem imediatamente inseridos em subcutâneo do dorso de trinta ratos. Como grupo-controle foram implantados tubos de dentina sem material no dorso de dez ratos. Os animais foram sacrificados após sete e trinta dias do pós-operatório. Foi realizado coloração de Von Kossa, sendo que, algumas secções não receberam coloração para poderem ser examinadas em microscópio de luz polarizada, para localizar a presença de material birrefringente. Também foi realizado, em algumas amostras, coloração de hematoxilina e eosina. Os autores observaram resultados semelhantes e que na abertura dos túbulos dentinários foram observadas granulações de Von Kossa positivas e birrefringentes à luz polarizada. Também observaram que próximo dessas granulações havia a presença de um tecido irregular na forma de uma ponte, também positiva a coloração de Von Kossa, e as paredes e no interior dos tubos apresentavam uma estrutura altamente birrefringente. A partir desses dados observados, os autores puderam concluir que os mecanismos dos materiais estudados são similares. Assim, o MTA e o cimento de Portland estimulam a deposição de tecido duro similarmente à ação do hidróxido de cálcio. Schmitt et al. 103 (2001), num artigo de revisão, concluíram que o MTA possui biocompatibilidade e capacidade de selamento superior, e menor citotoxidade que os outros materiais usados na terapia pulpar. Também relatam que o MTA é aceito pela FDA e que pode ser empregado no capeamento pulpar direto, apicificação e casos de falha com o uso do hidróxido de cálcio.

45 44 Daoudi & Saunders 19 (2002) avaliaram in vitro as vantagens do uso do microscópio operatório no selamento de perfurações de furcas usando o Vitrebond ou o MTA. Quarenta e seis molares humanos foram montados num jig simulando uma mandíbula, e divididos aleatoriamente em quatro grupos (n=10), sendo que seis dentes serviram como grupo controle. As perfurações das furcas foram executadas utilizando brocas diamantadas esféricas ISO 012 em baixa rotação. Cada material foi empregado nos grupos utilizando ou não o microscópio operatório. Todos os grupos foram armazenados num ambiente de 100% de umidade por 72h em temperatura ambiente, antes da determinação da qualidade da inserção sob uma magnificação de 26 vezes. Para avaliar a infiltração foi utilizado tinta da Índia, para então submeter os dentes a desmineralização, desidratação em álcool e inclusão. Os autores concluíram que a utilização do microscópio não interferiu na qualidade do selamento dos materiais, mas o emprego do MTA resultou em menor infiltração do que os grupos reparados com o Vitrebond. Regan et al. 97 (2002) avaliaram o potencial do MTA e do Diaket em promover a regeneração de tecidos perirradiculares. Foram utilizados dentes premolares inferiores de sete cães que, após a anestesia, realizouse o tratamento endodôntico, o acesso cirúrgico e os ápices foram seccionados e preparados com ultra-som permitindo assim a colocação dos materiais a serem avaliados. Sessenta dias após a cirurgia os animais foram sacrificados e amostras dos terceiros e quartos premolares foram imersas em formalina neutra a 10% para confecção dos blocos seriados. Após a obtenção dos espécimes pela coloração de hematoxilina/eosina e tricômico de Gomori as lâminas foram avaliadas por dois examinadores calibrados em microscópio de luz polarizada. Para análise estatística dos resultados foi utilizado o teste ANOVA. Os autores concluíram que os dois materiais estimularam quase a completa regeneração do periodonto perirradicular na ausência de infecção.

46 45 Weldon Junior et al. 120 (2002) num estudo longitudinal avaliaram a capacidade de selamento do MTA e Super-EBA em perfurações de furcas. Neste estudo foram utilizados 51 dentes humanos extraídos, os quais tiveram suas raízes seccionadas 3mm abaixo da região da furca, sendo então perfurados no centro da furca com brocas esféricas nº2 em alta-rotação. Após a perfuração, os dentes foram obturados e as extremidades radiculares seladas com C&B Metabond. Do total de 51 dentes, 15 dentes foram restaurados com MTA, 15 com Super-EBA, 15 combinação dos dois produtos e seis serviram como grupo controle, sendo três sem nenhum tratamento e três selados com o cimento C&B Metabond. Para avaliar a integridade do selamento, os dentes foram submetidos a um dispositivo com fluído de infiltração com pressão de 20cm H 2 O por 30 minutos, 4 horas, 24 horas, uma semana e um mês. Após a coleta de dados e análise estatística dos resultados os autores observaram que todos os materiais utilizados nos grupos testes apresentaram uma boa capacidade de selamento, com infiltração máxima de menos de 0.007µl min -1 cm H 2 O não ocorrendo diferença estatisticamente significante entre eles ao longo do período observado. Al-Nazhan & Al-Judai 3 (2003) investigaram o efeito antifúngico in vitro do MTA através do teste de diluição em tubos. Para a análise, o MTA foi avaliado em dois períodos: logo após sua mistura (fresco) e 24 horas após sua presa. O MTA foi colocado em contato com C. albicans por uma hora, 24 horas e três dias para permitir a observação de turbidez nos tubos. Os autores observaram que o MTA fresco foi mais efetivo contra os fungos após o primeiro dia de contato, enquanto que o MTA que tinha esperado sua presa por 24 horas foi mais efetivo após três dias de incubação. Concluíram então que o MTA foi efetivo contra C. albicans, independente da fase que era empregado. Duarte et al. 20 (2003) avaliaram o ph e a liberação de íons cálcio de dois materiais retro-obturadores, o Pro-Root (Dentsply) e o MTA- Angelus (Ângelus). Para esta análise os materiais foram colocados em

47 46 tubos plásticos e imersos e frascos de vidro contendo água deionizada. Após 3h, 24h, 72h e 168h a água de cada recipiente em que estavam as amostras foi retirada e analisada para determinar se apresentava alterações de ph e liberação de cálcio. Os autores puderam observar que a água que estava nos recipientes das amostras do MTA-Angelus possuía um ph e liberação de cálcio levemente maior que a do outro grupo. Apesar disto, concluíram que os dois materiais liberavam cálcio e promoviam um ph alcalino. Haglund et al. 33 (2003) investigaram os efeitos de quatro materiais retrobturadores sobre o crescimento celular, morfologia celular e produção de citocinas em macrófagos e fibroblastos de ratos. Os materiais retrobturadores utilizados foram MTA, IRM, amálgama e Retroplast. Foram aplicadas nas placas de culturas de células de fibroblastos e macrófagos amostras de Millipore com os materiais permanecendo incubados por três dias. Como controle foram utilizadas amostras de Millipore sem nenhum material. A morfologia celular foi avaliada e o número total de células foi contado e analisado pelo teste de uma variância. Para a determinação das citocinas, macrófagos dos ratos foram incubados em 24 placas com discos dos materiais teste. Neste caso culturas celulares sem os discos serviram como controle negativo e culturas de células com lipopolissacarídeos serviram como controle positivo; estas amostras foram então incubadas por 24 horas e analisadas pelo ensaio enzimático de imunoabsorção. Os autores observaram que morfologicamente o grupo do MTA estava caracterizado por desnaturação média de proteínas e presença de células mortas adjacentes ao material. Também concluíram que nenhum grupo apresentou produção de citocina e que todos os grupos inibiram o crescimento celular. Hembrough et al. 42 (2003) relataram que, clinicamente, o MTA parece ser o melhor material para ser utilizado em procedimentos que envolvem reparação radicular, cicatrização óssea e regeneração dos tecidos periodontais perirradiculares. Também evidenciaram o sucesso

48 47 clínico do MTA sem intervenção cirúrgica no tratamento de perfurações iatrogênicas. Hsien et al. 53 (2003) observaram o sucesso do tratamento de reabsorção interna de um incisivo central, que apresentava extensa lesão e exsudação. Após o acesso cirúrgico, o terço apical foi obturado com guta-percha e a perfuração fechada com MTA. Os autores afirmam que após um ano de acompanhamento, os sintomas e sinais desapareceram e o resultado foi considerado satisfatório. Pistorius et al. 94 (2003) realizaram um estudo para determinar a influência de materiais retrobturadores nas respostas celulares específicas de fibroblastos gengivais. Como materiais testes foram utilizados o MTA, o amálgama e liga de titânio inerte sendo então avaliada a reação celular a estes materiais pela produção de prostaglandina E-2, liberada com ou sem a estimulação do ácido araquidônico, síntese protéica e de lactato e proliferação tecidual. Como grupo-controle foram utilizadas culturas celulares sem a presença dos materiais testes. No grupo em que utilizou-se o amálgama como material teste, houve uma grande diminuição da síntese protéica (61,8 +/- 13,6%) pelos fibroblastos; ao contrário dos grupos do MTA (91,2+/- 5,9%) e do titânio (92,4+/- 4,7%) que apresentaram menores efeitos. A velocidade de proliferação celular foi levemente influenciada nos grupos do MTA (98,0+/- 1,6%) e titânio (97,9+/- 7,4%) e apresentou valores semelhantes ao grupo controle após 96 horas de incubação. No grupo do amálgama ocorreu uma significante e contínua redução na velocidade de proliferação celular (61,0+/- 2,5%). Nenhum aumento na produção de lactato foi observado nos três grupostestes. Quanto à produção de prostaglandina E-2 houve uma significante diminuição no grupo do amálgama (85,2+/- 3,5%). Já em relação ao grupo controle os grupos do MTA (147,3+/- 18.9%) e titânio (131,6+/- 19,1%), apresentaram um elevado nível de prostaglandina E-2. As culturas celulares estimuladas com ácido araquidônico não apresentaram nenhuma diferença para os três materiais testados. Os autores

49 48 concluíram então, que o amálgama desenvolve maior irritação tecidual do que o MTA e o titânio e que estes dois materiais apresentam comportamento de resposta celular similares. Saidon et al. 101 (2003) avaliaram o efeito citotóxico in vitro e a reação tecidual na implantação óssea dos cimentos de Portland e do MTA em porcos da Índia. Neste estudo foram utilizadas culturas de células L 929 que já se apresentavam aderidas a placas de culturas aonde foram inseridas amostras de Millipore com os materiais a serem testados. Após um período de incubação de três dias a morfologia celular e a contagem foram realizadas. Para execução do estudo da reação tecidual, os animais foram anestesiados e por meio de uma incisão submandibular a sínfise foi exposta e nela foram produzidas duas cavidades ósseas bilaterais para receber os materiais. Os animais foram sacrificados após duas e 12 semanas e os tecidos processados para permitir a avaliação por meio de microscopia óptica. Os autores observaram que não havia diferenças nas reações celulares in vitro, e que os dois materiais apresentavam uma resposta inflamatória mínima e biocompatibilidade comprovada pela formação óssea. Balto 8 (2004) estudou por meio de microscopia eletrônica de varredura a capacidade de adesão e a morfologia de fibroblastos do ligamento periodontal humano em contato com o MTA. O material foi colocado na cavidade apical de trinta dentes unirradiculares de humanos formando dois grupos de estudo, 15 raízes para aplicação do MTA fresco e 15 raízes para aplicação do MTA após sua presa. Cada grupo foi avaliado em três períodos, 4h, 8h e 24h. Como grupo-controle duas partes de cada espécime foram utilizadas em cada período. Para o controle positivo 0,5 ml de metilmetacrilato a 2% foram adicionados a suspensão das células antes de serem dispensadas no meio. Os experimentos foram realizados num meio de cultura tecidual e 1mL de suspensão de células de fibroblastos do ligamento periodontal de humanos foi colocado sobre o MTA e o grupo-controle. Os resultados mostraram uma morfologia celular

50 49 normal nos controles negativos. No controle positivo puderam observar poucas células com superfícies irregulares sem qualquer adesão ao substrato. Este fato também pode ser observado no grupo do MTA fresco. Já no grupo do MTA endurecido, os autores observaram células redondas e edemaciadas com superfície lisa e fortemente aderidas ao MTA. Concluíram que a qualidade e quantidade da adesão celular ao material retrobturador podem ser indicativa da toxidade do material. Hayashi et al. 36 (2004) demonstraram clinicamente o sucesso do emprego do MTA na cicatrização periapical do retratamento endodôntico de canais com ápices abertos. Os autores relataram que a aplicação do MTA como material obturador do canal, estimulou a formação de plugs apicais artificiais conferindo ao dente ausência de sintomatologia e aparente reparação radiográfica dos tecidos perirradiculares por dois anos após a obturação. Enfatizam ainda que o MTA pode ser considerado um material muito efetivo em promover a regeneração dos tecidos apicais, mesmo em casos de ápices muito abertos. Lee et al. 69 (2004) avaliaram a influência de vários meios fisiológicos que afetam a hidratação e propriedades físicas do MTA. Como métodos de avaliação foram utilizados a microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-x e testes de microdureza. Sabendo que a estrutura do MTA hidratado apresentava-se na forma de cristais agulhados cúbicos, o MTA foi hidratado em água destilada, solução salina, ph 7 e ph 5. Os autores observaram que a estrutura agulhada não se apresentava mais nas amostras com ph 5 e havia a presença de erosão da superfície dos cristais. A difração de raios-x demonstrou que o grupo com o ph 5 apresentava um pico de difração reduzido e o teste de microdureza evidenciou uma piora no grupo que possuía ph 5. Os autores concluíram que o ph do meio interfere na formação do MTA e que um meio ácido afeta prejudicialmente a propriedades físicas e o comportamento de hidratação do MTA.

51 50 Main et al. 74 (2004) avaliaram a porcentagem de sucesso em reparação de raízes perfuradas. Uma listagem de todas perfurações tratadas com MTA de um programa de residência em Endodontia foi obtida, totalizando 16 casos. Radiografias pré e pós-tratamento e após um ano de acompanhamento foram avaliadas por examinadores sem conhecer a identificação das radiografias para determinar a presença ou ausência de patologia adjacente ao sítio da perfuração. Os resultados demonstraram que todos 16 casos nas visitas de retorno apresentavam arquitetura normal na área adjacente à perfuração. Os dentes que apresentavam lesões demonstraram a resolução do processo patológico e os dentes que no pré-operatório não apresentavam lesões permaneceram neste estado nas visitas de controle. Baseados nestes resultados os autores concluíram que o MTA providencia um efetivo selamento das perfurações radiculares e melhora o prognóstico de dentes com perfurações que antes eram condenados. Yaltirik et al. 121 (2004) estudaram as reações do tecido conjuntivo subcutâneo de ratos ao Pro-Root (MTA, Dentsply) e ao Oralloy (amálgama, Coltene). Os materiais contidos em tubos de polietileno foram colocados no dorso dos animais e permaneceram no tecido subcutâneo por períodos de sete, 15, trinta, sessenta e noventa dias. Foram registradas a presença de inflamação, tipo celular predominante, calcificação e espessura do tecido conjuntivo fibroso. Para registrar as alterações foram criados os seguintes escores: 0- nenhuma ou poucas células inflamatórias e nenhuma reação; 1- menos que 25 células e reação média; 2- de 25 a 125 células e reação moderada; e 3- mais do que 125 células e severa reação. A cápsula fibrosa era classificada como fina quando sua espessura era menor que 150µm ou espessa quando era maior que 150µm. Também foram registradas as presenças de necrose e formação de calcificação. Os autores observaram que os dois materiais foram bem tolerados pelos tecidos durante os noventa dias de observação e que o tecido conjuntivo adjacente ao MTA apresentava a presença de

52 51 calcificação distrófica, sugerindo a hipótese de estimulação de formação de tecido duro pelo MTA. 2.3 Proteína derivada do órgão do esmalte - EMDOGAIN (EMD) A verdadeira regeneração dos tecidos periodontais após tratamento periodontal significa um novo ganho das estruturas de suporte perdidas incluindo novo cemento acelular aderido à dentina radicular, novo ligamento periodontal com fibras colágenas orientadas funcionalmente e inseridas no novo cemento e novo osso alveolar. Os primeiros estudos de Regeneração Tecidual Dirigida (R.T.D.) baseavam-se na utilização de uma barreira física que tinha por finalidade isolar a área da ferida cirúrgica permitindo que somente as células do ligamento periodontal repovoassem a área para promover a regeneração, isolando assim células epiteliais e conjuntivas (Gottlow et al. 29, 1986; Karring et al. 60, 1993). Gestrelius et al. 27 (1997) num estudo in vitro determinaram a habilidade dos derivados da matriz do esmalte em influenciar as propriedades específicas das células do ligamento periodontal. Foram avaliadas as propriedades das células como migração, inserção, proliferação, atividade biosintética e formação mineral de nódulos. Concluíram que as proteínas derivadas do órgão do esmalte (EMD) formavam um agregado de proteínas que funcionava como um meio único de interação célula-matriz durante o processo regenerativo, explicando que a real regeneração era produzida pelas células remanescentes interagidas com essa matriz e não pela ação direta das EMD. Também observaram que as EMD intensificavam a proliferação das células do ligamento periodontal, mas não das células epiteliais, aumentavam a

53 52 produção total de proteínas pelas células do ligamento periodontal, promoviam a formação de nódulos minerais e que não tinham efeito significante na migração ou inserção e agregação de células. Hammarström 34 (1997) estudou a influência da aplicação de proteínas derivadas da matriz do esmalte de suínos em cavidades experimentais em raízes de incisivos de macacos e observou que ocorreu a formação de cemento acelular e que este estava bem aderido à dentina. Evidenciou como a mais importante proteína, a amelogenina, com baixo peso molecular, hidrofóbica, e que o cemento acelular era formado na superfície da matriz do esmalte quando este era exposto às células mesenquimais do folículo justificando a formação de novo cemento acelular nos defeitos experimentais. Hammarström et al. 35 (1997) comprovaram que a aplicação de matriz de esmalte homogeneizada e um extrato ácido da matriz contendo amelogenina resultavam na quase completa regeneração do cemento acelular aderido à dentina, nova inserção de fibras colágenas e novo osso alveolar. Também observaram que o melhor veículo para servir como carregador para as preparações de matriz de esmalte era o alginato de propilenoglicol (PGA). Heijl 39 (1997) com o objetivo de comprovar a ação das proteínas derivadas do esmalte na regeneração dos tecidos periodontais, avaliou histologicamente seu efeito em defeito experimental em humanos. Após quatro meses da aplicação das EMD, foi comprovado por meio de microscopia a formação de novo cemento acelular que estava firmemente aderido a dentina subjacente, nova inserção de fibras do ligamento orientadas funcionalmente em associação ao osso alveolar. Observou também um ganho ósseo de 65% em relação à altura óssea pré-cirúrgica e um recobrimento de 73% do novo cemento em relação ao defeito original. Estes resultados serviram para comprovar que as EMD possuem potencial para promover a real regeneração periodontal.

54 53 Heijl et al. 40 (1997) compararam o efeito à longo prazo do EMDOGAIN R usado conjuntamente com retalho de Widman modificado no tratamento de defeitos ósseos periodontais, com o tratamento cirúrgico sem aplicação do EMDOGAIN R. Foram avaliados 34 sítios pareados em sítios testes e controles, sendo que eles possuíam profundidades de sondagem de bolsa 6mm associadas a defeitos infra-ósseos com profundidade 4mm e largura 2mm. Somente defeitos de uma ou duas paredes foram incluídos neste estudo. Os parâmetros utilizados para comparar a regeneração foram o ganho de inserção clínica e ganho ósseo radiográfico que foram determinados antes do início do teste, após oito, 16 e 36 meses. Em todos os períodos do estudo o tratamento com EMDOGAIN R mostrou-se estatisticamente superior ao grupo-controle com relação aos parâmetros avaliados. O ganho ósseo radiográfico após 36 meses no grupo-teste de 2.6mm correspondeu a 36% de ganho do osso inicialmente perdido ou 66% de preenchimento ósseo. Assim, comprovaram que o EMDOGAIN R, aplicado em conjunção com cirurgia de retalho de Widmam modificado, promoveu ganho ósseo radiográfico e ganho de inserção clínica e que não houve evidencia de qualquer reação clínica adversa devido à aplicação do EMDOGAIN R. Zetterström et al. 124 (1997) testaram a segurança clínica na aplicação de uma fórmula comercial das proteínas derivadas do órgão do esmalte conhecida por EMDOGAIN R (EMD) no tratamento de defeitos periodontais. Neste estudo, 107 pacientes foram tratados com o EMDOGAIN R em conjunção com cirurgias periodontais e amostras do soro foram obtidas dos pacientes do grupo-teste para analisar os níveis totais e específicos de anticorpos. Após as análises sorológicas evidenciaram que o EMDOGAIN R possuía um potencial imunogênico extremamente baixo, mesmo em casos de pacientes que apresentavam predisposição alérgica, comprovando assim a segurança na utilização deste produto. Observaram que mesmo após três anos os sítios tratados

55 54 com EMDOGAIN R apresentavam ganho do nível de inserção clínica significantemente superior aos grupos-controles. Araújo & Lindhe 5 (1998) avaliaram o efeito do EMDOGAIN R no tratamento de defeitos de furca grau III criados experimentalmente em cães. Os defeitos foram criados cirurgicamente e submetidos a tratamento reconstrutivo. No grupo-teste foi aplicado EMDOGAIN R após o condicionamento ácido por 15 segundos com ácido fosfórico para remoção do smear layer e colocação de membrana absorvível, enquanto no grupo-controle foi colocada somente a membrana. Após quatro meses os animais foram sacrificados e procedeu-se a análise histológica dos sítios tratados. Ambos os grupos apresentavam os defeitos clinicamente fechados e com a presença de osso e ligamento periodontal em continuidade com o novo cemento formado. Entretanto, somente no grupo-teste houve a formação de cemento acelular localizado na porção apical do defeito, enquanto que na porção coronária e no grupo-controle houve somente a formação de cemento celular. Hirooka 51 (1998) numa revisão dos resultados clínicos e experimentais do EMDOGAIN R, concluiu que este produto foi capaz de induzir a real regeneração periodontal. Também descreve o procedimento para aplicação do EMDOGAIN R em defeitos infra-ósseos periodontais. O EMDOGAIN R consiste em proteínas derivadas do esmalte desidratadas e congeladas que devem ser armazenadas a uma temperatura de 2ºC a 8ºC e misturado ao alginato de propilenoglicol ± 15 minutos antes da aplicação, sendo que a superfície radicular deve estar previamente condicionada por ácido fosfórico para remoção do smear layer. O autor relatou que após oito meses da aplicação do EMDOGAIN R a profundidade de sondagem de bolsa diminui de 7mm para menos que 3mm e que o defeito de furca grau II havia fechado. Heden et al. 38 (1999) estudaram a previsibilidade no tratamento de defeitos ósseos angulares profundos após a aplicação de EMDOGAIM R quanto ao ganho de inserção clínica e redução de profundidade de bolsa.

56 55 Foram utilizados 108 pacientes com periodontite, sendo que cada paciente apresentava pelo menos um defeito interproximal infra-ósseo profundo e possuíam os seguintes critérios para inclusão: profundidade de sondagem de bolsa 5mm, perda de inserção 6mm, evidência radiográfica de defeito infra-ósseo 3mm, totalizando assim 145 defeitos. Os pacientes foram inicialmente submetidos a terapia convencional e após 6 meses foram registrados os parâmetros clínicos para então executar as cirurgias a retalho e aplicação no grupo-teste de EMDOGAIN R. Após 12 meses os pacientes foram novamente examinados e puderam concluir uma média de ganho de inserção de 4.6mm e redução de sondagem de bolsa de 5.2mm. Redução no tamanho do defeito correspondia a um preenchimento ósseo de 69% do defeito original e em 43% desses defeitos o preenchimento ósseo era 80%. Estes resultados foram similares aos resultados de várias técnicas de regeneração tecidual guiada. Mellonig 81 (1999) descreveu a técnica passo a passo para a aplicação do EMDOGAIN R em cirurgia periodontal reconstrutiva. Avaliou clinicamente e histologicamente os efeitos da aplicação do EMDOGAIN R, após o condicionamento ácido da raiz com ácido cítrico ph 1 ou EDTA a 24% em ph 6.7 em defeito periodontal com 8mm de profundidade de sondagem, devidamente raspado e aplainado após exposição cirúrgica mediante o uso de retalho. Concluiu que houve a formação de novo osso, cemento e ligamento periodontal. Observou, após seis meses da aplicação que houve redução da profundidade de sondagem de bolsa de 5mm e ganho de inserção clínica de 4mm. Histologicamente, verificou-se a presença de uma fina camada de cemento acelular recobrindo a superfície radicular e fibras periodontais paralelas à superfície radicular. Esta orientação das fibras foi devido ao fato da necessidade de um tempo maior para que as fibras se orientem apropriadamente. Pontoriero et al. 95 (1999) em um estudo clínico controlado, avaliaram o efeito dos procedimentos regenerativos utilizando-se

57 56 EMDOGAIN R e /ou membranas (Guidor R, Resolut R e e-ptfe). Foram avaliados 40 pacientes que apresentavam destruição avançada dos tecidos periodontais, presença de dois defeitos ósseos angulares similares e lados opostos, profundidade de sondagem de bolsa 6mm, sondagem de nível de inserção 7mm e profundidade do defeito infraósseo 3mm. Todos pacientes antes do início do estudo receberam tratamento periodontal não-cirúrgico e possuíam boa higiene oral. Após 6 meses da terapia inicial, os pacientes foram avaliados quanto à sondagem do nível de inserção, profundidade de bolsa, recessão, índice de placa e gengivite. Os pacientes foram divididos em quatro grupos e tratados com cirurgias na mesma sessão sendo que um grupo foi submetido à aplicação de EMDOGAIN R e os outros três grupos à colocação de membranas. Concluíram que as quatro modalidades testadas pareciam ser igualmente eficazes na redução de sondagem de profundidade de bolsa e ganho de sondagem de inserção e superiores ao tratamento cirúrgico convencional a retalho. Sculean et al. 105 (1999) avaliaram histologicamente o tratamento de defeitos infra-ósseos avançados após o tratamento com EMDOGAIN R e com regeneração tecidual guiada através de membranas absorvíveis Resolut R. Após seis meses do tratamento, ambos os tipos de tratamento demonstraram a formação de novo cemento com características de cemento celular e nova inserção conjuntiva, sendo que no grupo que utilizou a aplicação de EMD, nem sempre a formação de nova inserção conjuntiva era seguida de formação de novo osso. Sculean et al. 106 (1999) avaliaram a aplicabilidade clínica e terapêutica do EMDOGAIN R no tratamento de defeitos periodontais infraósseos. Neste estudo foram avaliados 28 pacientes, com defeitos infraósseos de duas e três paredes, quanto à profundidade de sondagem de bolsa, recessão gengival e nível de inserção clínica. Após oito meses da aplicação do EMDOGAIN R, observaram uma redução em média da profundidade de sondagem de bolsa de 8.7mm ± 1.5mm para 4.3mm ±

58 57 1.6mm, aumento da recessão gengival de 1.8mm ± 1.2mm para 3.3mm ± 0.9mm e uma alteração de nível de inserção clínica de 10.6mm ± 1.9mm para 7.6mm ±1.8mm. Também observaram que de 32 defeitos 26 apresentavam radiograficamente formação de novo tecido ósseo. Concluíram que a utilização do EMDOGAIN R no tratamento de defeitos infra-ósseos pode levar a melhora significante de todos estes parâmetros clínicos avaliados. Greenstein 30 (2000) num artigo de revisão relata que o uso do EMD melhora a regeneração do periodonto, pois induz a cementogênese comprovada por achados histológicos em humanos e animais. Afirma também que o EMD pode ser utilizado como coadjuvante de terapias cirúrgicas e de regenerações teciduais dirigidas com o uso de membranas absorvíveis, apresentando resultados melhores, do que quando não empregados. Haase & Bartold 32 (2001) investigaram o efeito in vitro do EMD sobre a síntese de matriz em cultura de fibroblastos periodontais. Para avaliar a síntese de matriz foram determinadas às expressões de síntese de proteoglicanas totais, perfil de glicosaminasglicanas e a síntese de hialuronina pelos precursores radioidentificadores. Também foi utilizado o teste de Northern blot para determinar as respostas individuais de proteoglicanas e outras substâncias. Os resultados obtidos indicaram que o EMD possui um potencial de modular significantemente a síntese de matriz numa maneira consistente com os eventos iniciais dos processos reparativos. Iqbal & Bamaas 55 (2001) determinaram num estudo histológico o efeito da matriz derivada do esmalte (EMDOGAIN R ) no reparo periodontal de dentes reimplantados de cães. Foram utilizados nove cães da raça beagle, que tiveram seus incisivos despolpados reimplantados após 15, 30 e 60 minutos de armazenamento sem umidade, com aplicação de EMDOGAIN R (grupo-teste) nos dentes extraídos de um lado, e sem aplicação de EMDOGAIN R, nos dentes extraídos do outro lado (grupo-

59 58 controle). Os dentes foram então divididos em três grupos, nos grupos 1 e 2, os dentes foram ferulizados e os cães sacrificados após oito e doze semanas, respectivamente. No grupo 3 os dentes não foram ferulizados e os cães sacrificados após 12 semanas. Na análise histológica foram estudados os seguintes parâmetros: ligamento periodontal cicatrizado, superfície e reabsorção substitutiva e inflamatória. Os resultados foram examinados por análise de multivariáveis e de uma variável. Os autores observaram que a quantidade de ligamento periodontal reparado era inversamente proporcional ao tempo de permanência extra-alveolar, e que a ferulização não interferia nos resultados dos grupos estudados. Também observaram que o grupo tratado com EMDOGAIN R mostrava uma alta incidência de reparo do ligamento periodontal principalmente após 12 semanas, enquanto que no grupo-controle foi observada uma alta incidência de anquilose. Nakamura et al. 85 (2001) exploraram os efeitos do EMD na cicatrização de injúria pulpar de mini porcos. Neste trabalho as polpas de dentes dos animais foram expostas por meio de cavidades classe V e capeadas com EMD, sendo que o lado contra lateral foi capeado com hidróxido de cálcio servindo como grupo-controle. Todas as cavidades foram restauradas com ionômero de vidro e após duas e quatro semanas os dentes foram avaliados histologicamente. No grupo tratado com EMD, observaram-se grandes quantidades de novos tecidos formados semelhantes à dentina com células formadoras associativas separando a área da cavidade do tecido pulpar remanescente. Também ocorreu a presença de células inflamatórias no tecido remanescente, mas não no tecido duro neoformado. A análise morfométrica demonstrou uma quantidade de tecido duro neoformado no grupo EMD duas vezes maior do que o grupo-controle, sugerindo que o EMD é capaz de promover o processo reparativo na cicatrização pulpar de forma mais intensa que o hidróxido de cálcio. Watanabe et al. 118 (2001) estudaram a eficácia da proteína da

60 59 matriz do esmalte (EMP) na regeneração periodontal após apicetomia em dentes de cães com lesão periapical. As raízes dos caninos superiores e raízes mesiais dos premolares superiores de cães beagle foram expostas, apicectomizadas e receberam a aplicação do EMP sobre a dentina exposta. Após 12 semanas os animais foram sacrificados e os dentes com os tecidos circunvizinhos foram coletados e submetidos para análise de microscopia óptica. No grupo tratado com EMP o defeito remanescente era menor que o defeito do grupo-controle, também se observou que a quantidade de cemento neoformado era maior no grupoteste. Além disso, somente no grupo-teste foi observada a presença de novas fibras colágenas que ligavam o novo cemento ao novo osso formado, evidenciando o efeito regenerativo nos tecidos periapicais periodontais dos cães. Os resultados sugeriram que o EMP pode efetivamente induzir a regeneração de estruturas periodontais em cães apicectomizados. Oringer 92 (2002) num artigo de revisão relata que nos últimos 25 anos, significantes avanços têm ocorrido na área da regeneração periodontal e óssea e que novas terapias regenerativas têm se baseado no aumento do entendimento do desenvolvimento embrionário e cicatrização celular e molecular. Segundo o autor, atualmente duas substâncias têm demonstrado um significante potencial regenerativo, o EMD e os fatores de crescimento e diferenciação. O autor também afirma que as pesquisas atuais comprovam a efetividade e a segurança do uso do EMD em animais e humanos e que as utilizações dessas substâncias com materiais de suporte estimulam os processos necessários para a regeneração periodontal, substituindo as terapias convencionais no tratamento periodontal regenerativo. Cattaneo et al. 13 (2003) verificaram o efeito in vitro do EMD na proliferação, diferenciação e colonização de fibroblastos do ligamento periodontal de humanos em contato com raízes dentais extraídas. Para avaliar o efeito do EMD, fibroblastos foram semeados em placas de Petri,

61 60 contendo raízes dentais extraídas, na presença ou não do EMD e foram realizadas a contagens do crescimento celular após um, três e oito dias de cultura. Após três e oito dias, foi detectada uma significante influência do EMD sobre a proliferação celular, e quando as células do ligamento periodontal permaneceram na presença do EMD unidas à superfície radicular por 12 dias, verificou-se alteração na morfologia celular. A análise por microscopia eletrônica de varredura revelou que as células que cresceram nas superfícies radiculares tratadas com EMD apresentavam uma superfície achatada fortemente aderida ao substrato e uma superfície externa lisa. Também foi observado que da superfície achatada havia processos celulares alongados e finos conectando com o substrato. Como conclusão, os autores afirmaram que o EMD aumenta a proliferação de fibroblastos do ligamento periodontal de humanos, e que as células na presença do EMD adquirem uma morfologia mais similar a cementoblastos do que de fibroblastos, indicando que o processo de diferenciação celular é essencial no processo de reparação periodontal. Cochran et al. 17 (2003) avaliaram a regeneração de defeitos infraósseos em babuínos de vários tamanhos tratados com proteína da matriz do esmalte. Foram criados defeitos periodontais bilaterais com 1 a 6mm de profundidade ao redor de três dentes. Foi permitido, durante dois meses, o acúmulo de placa ao redor de ligaduras colocadas no interior dos defeitos. Após dois meses as ligaduras foram removidas, os dentes raspados e aplainados e realizada uma marca na base do defeito. No grupo teste, de um lado da mandíbula, foi aplicada sobre as raízes uma solução de ácido de etilenodiamino tetracético neutro e proteínas da matriz do esmalte. No lado controle, foi realizado somente a raspagem e o aplainamento e a aplicação da solução ácida. Após cinco meses os animais foram sacrificados e os dentes e os tecidos circunvizinhos foram removidos e processados para análise histológica. A regeneração periodontal ocorreu em todos os defeitos periodontais. Foram observadas qualitativamente, novo cemento, novo ligamento com fibras de Sharpey e

62 61 novo osso. No geral, o tratamento com a proteína da matriz do esmalte induziu a uma formação de tecido maior do que a observada nos grupos controles. Em muitas ocasiões, ocorreu uma dramática formação de tecido da base à parte coronária do defeito. Além disso, o preenchimento ósseo horizontal ocorreu nos defeitos que tinham inicialmente de 4 a 6mm de extensão. O ligamento periodontal resultante era semelhante em todos os defeitos sem considerar a largura do defeito original. A altura do novo cemento formado era 45% maior no grupo-teste do que no grupo-controle no tratamento de defeitos estreitos, 1 a 2mm; a altura de novo osso formado era 31% maior no grupo-teste do que no grupo-controle. Já nos defeitos combinados amplos, a altura de novo tecido era similar nos dois grupos. Os autores justificam este resultado, devido ao acúmulo de placa que limita o potencial de regeneração. Os autores concluíram que o tratamento de defeitos de vários tamanhos com a proteína da matriz do esmalte estimulam substancialmente a regeneração periodontal, havendo uma grande quantidade de formação de novo tecido ósseo, ligamento periodontal com fibras de Sharpey e cemento coronariamente a marca realizada nas raízes, sem a necessidade do uso de membranas ou enxertos ósseos. Igarashi et al. 54 (2003) avaliaram os efeitos biológicos do EMD na formação de dentina reparativa e pontes dentinárias após a amputação pulpar de molares de ratos. Neste trabalho foi realizado o capeamento pulpar direto com o EMD no grupo-teste e como grupo-controle foi utilizado apenas o capeamento direto com o veículo carregador do EMD, um alginato de propileno glicol (PGA). Sobre o capeamento foram realizadas restaurações das cavidades com cimento de ionômero de vidro. Os animais foram sacrificados nos períodos de quatro a trinta dias para permitir a análise histológica em microscópios óptico e eletrônico. As polpas capeadas com o PGA apresentaram no dia sete a formação de dentina reparativa sobre as paredes de dentina abaixo da cavidade preparada e sua espessura estendeu-se até o dia trinta. No dia trinta,

63 62 formação de dentina reparativa e calcificação difusa tinham ocorrido abaixo da ferida, e a formação da ponte de dentina foi observada em 18,2% das polpas amputadas. No grupo tratado com o EMD, já após quatro dias da amputação pulpar verificava-se a formação de dentina reparativa por células semelhantes aos osteoblastos e a espessura desta dentina permaneceu até o dia trinta. Quanto aos níveis de cálcio e fósforo, não houve alterações dos grupos testados com os valores iniciais da matriz dentinária pré-existente. Após trinta dias da amputação pulpar, as formações de pontes dentinárias puderam ser observadas em 27,3% das polpas tratadas com EMD. Os autores concluíram que o EMD intensifica a formação de dentina reparativa e de pontes dentinárias durante a cicatrização de polpas amputadas de ratos. Ishizaki et al. 57 (2003) examinaram a resposta histopatológica do tecido pulpar ao capeamento direto com EMD. Trinta e dois dentes de cães foram divididos em quatro grupos (n=8), sendo um grupo controle e três grupos experimentais que receberam preparos cavitários classe V profundos para permitir o capeamento pulpar direto. Os dentes foram extraídos após uma, quatro e oito semanas, e preparados para a análise histopatológica por microscopia óptica. Todos os dentes preparados após quatro e oito semanas da aplicação do EMD demonstraram um aumento da dentina terciária, sugerindo que o EMD exerce um efeito considerável sobre as células odontoblásticas e endoteliais dos capilares do tecido pulpar. Os autores confirmam que o EMD desempenha um papel importante na calcificação do tecido pulpar, quando utilizado como material de capeamento direto. Okubo et al. 91 (2003) realizaram um estudo para determinar os efeitos do EMD no crescimento celular, diferenciação osteoblástica e produção de fatores de crescimento semelhante a insulina (IGF-I) e fatores de crescimento de transformação beta 1 (TGF-β 1) nas células do ligamento periodontal de humanos (HPLC). Neste estudo também foi avaliada a participação do IGF-I e TGF-β 1 endógenos com a estimulação

64 63 do crescimento celular pelo EMD. Células do ligamento periodontal humano foram tratadas somente com o EMD, ou em combinação com anticorpo anti-humano IGF-I (anti-higf-i) ou anti-htgf-β 1, proteína óssea morfogenética 2 humana recombinante (rhbmp-2), 1,25- dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3), rhtgf-β 1 ou rhigf-i. Após cada tratamento, o crescimento celular, a produção de IGF-I e TGF-β 1, e a expressão dos fenótipos osteoblásticos foram determinados. Os autores observaram que: a estimulação do crescimento celular era dosedependente e que o EMD estimulou em níveis protéicos e mrna a expressão de IGF-I e TGF-β 1. Verificaram que o estímulo de crescimento celular pelo EMD foi parcialmente suprimido com o tratamento de antihigf-i ou anti-htgf-β 1, mas o crescimento também foi estimulado pelo tratamento com rhtgf-β 1 ou rhigf-i. A rhbmp-2 estimulou a atividade da fosfatase alcalina e a sua expressão de mrna. Já a 1,25(OH)2D3 estimulou a atividade da fosfatase alcalina e a expressão mrna da osteocalcina. Contrariamente, o EMD não demonstrou efeito na expressão dos fenótipos osteoblásticos. Segundo os autores, o EMD não desempenhou um papel na diferenciação osteoblástica, mas, no entanto, estimulou o crescimento celular, a produção de IGF-I e TGF-beta1 nas células do ligamento periodontal de humanos. Rincon et al. 98 (2003) avaliaram a influência do EMD na cultura de fibroblastos gengivais, fibroblastos periodontais e fibroblastos dérmicos de humanos. Neste estudo as culturas celulares foram estimuladas com diferentes concentrações de EMD (10, 50, 100 e 150 µg/ml) por 24 horas, sendo que os grupos-controles negativo e positivo eram de culturas de células contendo em média 0,2% e 10% de soro fetal de bezerro (FCS). Para mensurar a síntese de DNA foi realizado um levantamento celular com timedina (3H). Para avaliar a cicatrização in vitro, as células foram cultivadas e estimuladas com 0,2% FCS, 10% FCS e aplicação de EMD a 20 µm/ml, e a porcentagem de preenchimento da ferida avaliada após 1, 4, 6, 12 e 16 dias. A proliferação celular também pode ser calculada pela

65 64 extensão de incorporação de violeta cristal. Os resultados demonstraram in vitro que as células preenchem os espaços vazios por uma combinação de proliferação e migração. O fechamento mais rápido da ferida ocorreu onde a proliferação e a migração se assemelhavam com a cicatrização das culturas mantidas a 10% FCS ou nas culturas com aplicação de EMD a 20 µm/ml. Concluíram que o EMD exerce influência nas células compatível com uma melhor cicatrização. Sculean et al. 107 (2003) comprovaram por meio de avaliação imunohistoquímica a influência do EMD na regeneração de tecidos periodontais de humanos. Os autores analisaram a expressão de moléculas matrizes associadas com os tecidos periodontais neoformados após o tratamento cirúrgico com EMD de oito pacientes com defeitos infra-ósseos, sendo que após seis meses do tratamento, os dentes com os tecidos circundantes foram removidos para análise imunohistoquímica. Os tecidos após a remoção foram fixados em formalina diluída, descalcificados em EDTA e incluídos em parafina, para permitir a confecção de cortes seriados com 6µm de espessura no sentido mésiodistal. A análise imunohistoquímica foi realizada por meio de anticorpos policlonais contra a osteopontina, colágeno tipo I e colágeno tipo III. Como grupo-controle foram utilizadas as regiões do periodonto não tratadas. Os autores observaram que houve a formação de variadas extensões de cemento, ligamento periodontal e osso alveolar para todos os espécimes do grupo-teste. Também observaram, no grupo que utilizou o EMD, uma forte expressão das moléculas matrizes investigadas. A expressão de osteopontina era mais intensa na borda do novo cemento e osso formado. A presença de colágeno tipo I e III foi comprovada por todo ligamento periodontal regenerado, sendo que a coloração da análise imunohistoquímica evidenciou mais o colágeno tipo III. A partir destes dados, os autores concluíram que o tratamento de defeitos periodontais com EMD cria um ambiente favorável para a regeneração periodontal.

66 65 Yoneda et al. 122 (2003) confirmaram o efeito do EMD sobre as células osteoblásticas e a regeneração óssea. Para esta confirmação os autores utilizaram como cultura células osteoblásticas de camundongos (ST2 e KUSA/A1), que foram tratadas com EMD e avaliadas quanto ao seu crescimento com mensurações de DNA e teste de incorporação de 5- bromo-2 -deoxiuridina (BrdU). Também foram realizados testes de atividade de fosfatase alcalina (ALP), de formação de nódulos mineralizados (MN) e análise de Nothern blotting e enzimografia. Além disso, foram criados defeitos nos crânios dos camundongos e aplicado EMD, para permitir a análise radiográfica e histológica após duas semanas. Os autores observaram que o EMD não interferiu no crescimento celular de ST2, mas intensificou a proliferação celular de KUSA/A1, e embora o EMD tenha estimulado a atividade de ALP, esta era mais evidente nas células KUSA/A1, as quais apresentavam também maior formação de MN. Também observaram que o EMD estimulava a expressão do fenótipo osteoblástico nas células KUSA/A1 tais como, colágeno tipo I, osteopontina, fator de transformação de crescimento I α (TGF-Iβ), osteocalcina e a produção de matriz de metaloproteinase. Quanto aos defeitos ósseos criados nos crânios, o EMD acelerou a neoformação óssea. Concluíram que o EMD estimula os osteoblastos e possuem grande potencial como material para cicatrização óssea. Craig et al. 18 (2004) avaliaram a capacidade do EMD em induzir in vivo a formação de tecido conjuntivo na interface entre materiais obturadores e ligamento periodontal. Para este estudo foram utilizados mini porcos Yucatan que tiveram suas mandíbulas expostas, e execução de osteotomias bilaterais nas regiões dos quatro premolares. Cada defeito foi preenchido com hidróxido de cálcio, guta-percha, MTA e sem nenhum material. No lado oposto antes do fechamento do retalho foi aplicado sobre os defeitos o EMD. Sobre os defeitos de ambos os lados também foi colocada uma membrana bioabsorvível para impedir o colapso do tecido mole após seu reposicionamento e sutura. Os animais foram

67 66 sacrificados após dez semanas da intervenção cirúrgica, blocos de cortes seriados foram obtidos e preparados para análise em microscópio óptico. Os resultados demonstraram que houve a completa regeneração do osso alveolar e do ligamento periodontal nos quatro dentes do lado que foi aplicado o EMD, o que foi comprovado pela presença de fibras do ligamento periodontal inserindo-se numa matriz mineralizada consistente com o cemento. Pelo contrário, uma extensa reabsorção sem a regeneração do osso alveolar foi encontrada em todos os dentes que não receberam a aplicação do gel de EMD. Os autores concluíram que a aplicação do gel de EMD sobre as superfícies de materiais, que normalmente não suportam a inserção do tecido conjuntivo do ligamento periodontal, pode alterar o tipo de interface de união do tecido conjuntivo do ligamento com estes materiais. He et al. 37 (2004) investigaram os efeitos do EMD no crescimento e diferenciação de células osteoblásticas (MC3T3-E1) e na expressão de osteoprotegerina (OPG). Para o teste as células (MC3T3-E1) foram tratadas com 100 µm/ml de EMD num meio livre de soro por um, dois, três, cinco, e sete dias, ou por três semanas num meio de soro fetal bovino (FBS). Como grupo-controle negativo as células foram incubadas sem a adição de EMD. Ao final de cada período de incubação, o número de células era contado e era procedido a extração de mrna celular total. Para analisar os níveis do mrna foi utilizado o teste de Nothern blot e RT-PCR, determinando os níveis de fator de união nuclear α (Cbfa1), colágeno α1 (1), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), fator de crescimento semelhante a insulina I (IGF-I) e a OPG. Também foi determinada nos grupos controle e teste a atividade da fosfatase alcalina (ALP). Como resultados houve um evidente aumento no número de células nos grupos tratados com EMD nos períodos do dia dois ao dia sete. A expressão de colágeno α 1, BSP, OC, OPG e IGF-I estavam altamente controladas no grupo tratado com o EMD. Sob diferentes condições, a atividade da fosfatase alcalina estava aumentada

68 67 significantemente pela aplicação do EMD após três semanas no meio de cultura. Os níveis de fator de união nuclear α não sofreram alterações nos períodos do dia 1 a dia 5 no grupo que recebeu o EMD, mas apresentavam-se elevados após três semanas de cultura. Os autores concluíram que o EMD promove a diferenciação e a proliferação de células osteoblástica (MC3T3-E1) e inibe a osteoclastogêneses e a função osteoclástica devido à estimulação da expressão da osteoprotegerina. Keila et al. 62 (2004) avaliaram os efeitos in vitro do EMD nas células óssea medulares suporte (BMSC) e fibroblastos gengivais (GF). Os autores observaram que a aplicação do EMD, 25 µm/ml, aumentou a capacidade osteogênica do osso medular, proveniente do aumento em até três vezes do número de células BMSC e de até duas vezes da atividade de fosfatase alcalina e formação de nódulos mineralizados. Para que este efeito ocorresse a presença do EMD no meio de cultura nas primeiras 48 horas foi essencial. Ao contrário, o EMD não induziu a diferenciação osteoblástica dos fibroblastos gengivais, evidenciada pela ausência de mineralização ou atividade de fosfatase alcalina, mas, aumentou em até duas vezes o número e a quantidade de matriz formada. Estes dados levaram a acreditar que o EMD desempenha um efeito de promoção na formação óssea e regeneração do tecido conjuntivo.

69 Plasma rico em plaquetas Lynch et al. 73 (1991) testaram os possíveis efeitos da aplicação em curto tempo de uma mistura de fatores derivados de plaquetas e semelhante à insulina na cicatrização do ligamento periodontal, intensificando a regeneração dos tecidos moles e duros do periodonto. Para comprovar esta hipótese foram realizadas cirurgias periodontais nos quatro quadrantes de 13 cães beagle com história de doença periodontal. Após a abertura do retalho, debridamento da superfície radicular, foram utilizadas marcas nas raízes ou a extensão apical da raspagem como marcadores histológicos para facilitar a avaliação. Em dois quadrantes de cada animal foi aplicado na superfície radicular dos premolares e na crista óssea alveolar uma mistura com 3µg de PDGF- β recombinante purificada e 3µg de IGF-I com 80µl de gel de metilcelulose a 4% (grupo-teste). Nos dentes contralaterias, grupo-controle, foi aplicado somente o gel. Foram feitas avaliações da altura da nova crista óssea, área da crista do novo osso, comprimento coronário do novo cemento, proporção de anquilose e porcentagem do preenchimento do defeito. Os autores observaram que a quantidade de novo osso e cemento formado era de cinco a dez no grupoteste em relação ao grupo-controle, e que a altura e a área total de novo osso continuava a aumentar no grupo-teste. Observaram também, que o novo osso formado seguia um processo normal de reparação e que havia a presença de um espaço do ligamento periodontal fisiológico entre esse novo osso e cemento, sem levar ao aparecimento de anquilose. Com isso puderam concluir que a aplicação por um curto período de tempo de uma mistura de PDGF-β e IGF-I podem aumentar significantemente a formação do aparato de inserção do ligamento durante as fases iniciais da cicatrização periodontal após cirurgia.

70 69 Matsuda et al. 78 (1992) estudaram as respostas mitogênica, quimiotática e de síntese das células do ligamento periodontal de ratos obtidas do coágulo e alvéolos em cicatrização, aos fatores de crescimento epidermal, de transformação de crescimento beta (TGF-β), derivados de plaquetas recombinantes e semelhante a insulina (IGF-I). Neste estudo, os autores determinaram o efeito mitogênico dos fatores de crescimento pela mensuração de timidina H incorporada durante a proliferação das células fibroblásticas do ligamento. Os autores concluíram que o IGF-I e o PDGF-β recombinante apresentavam grande potencial mitogênico e quimiotático nas células do ligamento periodontal, e que o PDGF recombinante intensifica a síntese de colágeno pelas células do ligamento desempenhando um importante papel na promoção da cicatrização destas células. Os autores ainda sugerem que a utilização clínica destes fatores de crescimento favorece a regeneração periodontal. Oates et al. 90 (1993) estudaram os possíveis efeitos dos fatores de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), de transformação de crescimento beta (TGF-β) e interleucina 1 (IL-1) na mitogênese de células do ligamento periodontal, e a influência reguladora do TGF-β na resposta ao PDGF e IL-1. Neste estudo células do ligamento periodontal humano foram cultivadas e tratadas com os fatores de crescimento e a atividade mitogênica foi determinada pela quantificação da incorporação de timidina H durante a síntese de DNA, determinada por um contador LKB Mini Beta. Os autores concluíram que o PDGF-α e o PDGF-β são os principais mitógenos para as células do ligamento periodontal humano e que o TGFβ atua como um regulador na resposta mitogênica das células do ligamento periodontal ao PDGF. Cho et al. 15 (1995) obtiveram, com a utilização de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-β), a regeneração periodontal de furcas grau III em cães Beagle sem a presença significante de anquilose ou reabsorção radicular. O PDGF-β atuou como um potente quimiotático e com efeitos mitogênicos para os fibroblastos do ligamento

71 70 periodontal facilitando a migração destas células na raiz do dente levando a uma completa regeneração dos tecidos periodontais e a utilização conjunta com membrana favoreceu o preenchimento do defeito com 80% de novo osso formado e 20% de ligamento periodontal. Howell et al. 52 (1997) utilizaram o fator de crescimento derivado de plaquetas β (PDGF-β) recombinante e o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I) em defeitos ósseos periodontais em humanos. Neste estudo foram avaliados 38 indivíduos com lesões de furca tipo II bilaterais que foram submetidos à cirurgia a retalho para acesso e aplicação dos materiais. Os resultados demonstraram que ambos os materiais possuíam segurança quanto à sua utilização e aumentavam significantemente a regeneração óssea do defeito. Marx et al. 76 (1998) demonstraram o modo de obtenção de PRP durante a cirurgia de enxerto ósseo em reconstruções maxilares de pacientes submetidos a cirurgias de remoção de tumores malígnos. A utilização do plasma rico em plaquetas demonstraram um aumento na formação óssea do enxerto e intensificação da densidade óssea. Zaman et al. 123 (1999) observaram que a utilização de fator de crescimento derivado de plaquetas β e proteína óssea morfogenética 2 induziram a um aumento da proliferação e diferenciação celular das células do ligamento. Kim et al. 64 (2001) investigaram o efeito da adição de fatores derivados de plaquetas β e fator de crescimento semelhante à insulina I com o hidróxido de cálcio na reparação de perfurações apicais em raízes de cães da raça beagle. Neste estudo foram utilizados 51 dentes premolares, submetidos ao desenvolvimento de lesões periapicais e perfurações artificiais dos ápices. Para avaliação foram criados três grupos: grupo 1, sem selamento apical; grupo 2, selamento com hidróxido de cálcio e grupo 3, hidróxido de cálcio mais os fatores de crescimento. Após o sacrifício dos animais na 12ª semana, os dentes foram removidos, corados com coloração de Hematoxilina/eosina e para imunoensaio para

72 71 serem submetidos a análise histológica e obtenção dos resultados. Os autores observaram que no grupo 1 não houve cicatrização apical; no grupo 2 ocorreu moderada cicatrização do ápice, enquanto que o grupo 3 apresentou uma melhor cicatrização das perfurações. Petrungaro 93 (2001) relatou numa série de casos clínicos em que o PRP era efetivo na prevenção de complicações pós-operatórias de procedimentos cirúrgicos com finalidades estéticas, como, o aumento de zona de tecido gengival queratinizado e recobrimento radicular. Este efeito era causado devido à aceleração dos processos de cicatrização nos estágios iniciais do reparo da ferida. Kawase et al. 61 (2003) investigaram a ação do PRP na produção de matriz extracelular no ligamento periodontal e em cultura de células osteoblásticas (MG 63). Para o estudo, o PRP foi preparado do plasma obtido de vinte voluntários e armazenado a C até o momento da aplicação. As células tratadas com o PRP (0,5% a 2%) foram coradas imunohistoquimicamente para colágeno do tipo I e fibrina, e a viscosidade média da cultura foi avaliada visualmente. O fibrinogênio do PRP e a trombina endógena também foram detectados para os ensaios laboratoriais. Os resultados evidenciaram que houve a formação de um gel celular nas culturas de ligamento periodontal e células MG 63 após a adição de PRP. O PRP alterou a forma celular e sobre-regulou o colágeno tipo I em 24 horas. Também foi observado que a ação do PRP na síntese de colágeno poderia ser minimizada pela presença de fibrinogênio purificado ou pelo inibidor de trombina. Os autores concluíram que o gel de material formado nas culturas de células consiste num coágulo de fibrina que é capaz de sobre-regular a síntese de colágeno da matriz extracelular. Também sugerem que o fibrinogênio convertido em fibrina em combinação com os fatores de crescimento presentes no PRP, promoverem efetivamente a cicatrização de feridas em sítios com injúria dos tecidos periodontais.

73 72 Kovacs et al. 67 (2003) procuraram determinar a ação do PRP na reabsorção de fosfato tricálcio β (beta-tcp) e a formação de novo osso em cães da raça beagle após a exodontia. Neste estudo 12 cães tiveram cada um, dois dentes extraídos de cada lado da mandíbula e os defeitos foram então, preenchidos com o beta-tcp puro ou PRP mais o beta-tcp. A qualidade do novo osso formado, e os efeitos do PRP foram estudados por análises histológicas e histomorfométricas. Após 6 semanas, a formação óssea do grupo com PRP era mais efetiva e na 12 a semana o crescimento ósseo era significantemente maior. Concluíram assim que o uso do PRP acelera os processos de remodelação óssea criados pelo beta-tcp. Lucarelli et al. 72 (2003) estudaram o efeito do PRP na proliferação e diferenciação de células-tronco de humanos (SSC). O teste MTT para investigar os efeitos do PRP na proliferação confirmou a indução sobre as SSC. Observou-se também que o efeito era dose dependente e que 10% de PRP eram suficientes para induzir um evidente aumento na proliferação celular em crescimentos logarítmicos e poderia mineralizar a matriz extracelular das células. Cicha et al. 16 (2004) estudaram a liberação de fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) pelas plaquetas humanas ativas. Neste trabalho, plaquetas humanas foram separadas e estimuladas com trombina e ADP. Após a estimulação das plaquetas pode-se observar um aumento de CTGF que age na cicatrização de feridas, mas, desempenham um papel prejudicial em lesões de arteriosclerose avançada. Também relatam que em casos de doenças das artérias a administração de drogas como a aspirina pode evitar danos inibindo a ativação das plaquetas. Mazor et al. 80 (2004) em estudos clínicos avaliaram a utilização do PRP em cirurgias de levantamento de seio maxilar com colocação simultânea de enxerto ósseo autógeno e alógeno e dos implantes osseointegráveis. A técnica cirúrgica foi executada em 105 pacientes que

74 73 necessitaram da coleta individual de 50mL de sangue para obtenção de 10mL de PRP. As misturas enxertos ósseos e PRP foram ativadas pelo uso de trombina humana. Após seis meses da execução dos procedimentos operatórios, os implantes foram expostos e não havia indícios clínico e radiográfico de perda na crista óssea ao redor dos implantes. Todos implantes foram considerados osseointegrados e restaurados com as próteses sobre implantes. Os autores concluíram que a utilização do PRP no aumento de maxilas posteriores severamente atrofiadas, leva a claros benefícios clínicos como redução no tempo de cicatrização e da maturação óssea, possibilita melhor manuseio do enxerto e acelerar a cicatrização dos tecidos moles. Pontual et al. 96 (2004) descreveram o protocolo de obtenção de PRP adotado no centro de estudo e pesquisa em implantes dentários (CEPID), da Universidade Federal de Santa Catarina. Este protocolo adota duas centrifugações com a finalidade de concentrar as plaquetas do PRP. A obtenção se inicia pela coleta sanguínea de 30 a 60mL de sangue em tubos estéreis com pressão negativa para 5mL, com 0,5mL de citrato de sódio para evitar a coagulação. Logo após a coleta, os tubos são agitados para homogeneizar o conteúdo. Procede-se então a primeira centrifugação a rpm por 10 minutos, onde o sangue contido no tubo apresentará duas porções distintas, uma vermelha, que contém as hemácias e se deposita na parte inferior e uma amarela que consiste do plasma. Com o auxílio de micropipetas todo o plasma é removido até as proximidades das hemácias, e colocado em tubos de ensaio estéreis para permitir a segunda centrifugação também a rpm por 10 minutos. Assim, poderá se observar um líquido amarelo claro com um concentrado de plaquetas formando um botão no fundo do tubo. Com a segunda centrifugação, 50% do sobrenadante do conteúdo do tubo é removido, pois consiste no plasma pobre em plaquetas (PPP), que é rico em fibronectina e poderá ser usado como membrana sobre enxertos. O restante do conteúdo do tubo é agitado para fazer uma suspensão. Esta

75 74 suspensão é então colocada num recipiente metálico estéril em banhomaria a 37 0 C, sendo ativado para forma de gel com a adição de cloreto de cálcio estéril a 10%. A quantidade de cloreto a ser adicionada será na proporção de oito partes de PRP para uma de cloreto. Os autores relatam que não é estritamente necessária a adição de trombina bovina e que somente o cloreto consegue induzir a geleificação. Ao utilizar o PRP com enxerto incorporado, este deve ser misturado após a adição do cloreto ao PRP. Weibrich et al. 119 (2005) compararam a quantidade de fatores de crescimento presentes no plasma rico em plaquetas obtidos por dois diferentes métodos, método PCCS (platelet concentrate collection system) e método PRGF (Anitua Kit). Foi coletado sangue de 51 pacientes, sendo que todos doadores apresentavam contagem de plaquetas acima de µl. O método semi-fechado PCCS consiste na coleta do sangue do paciente com uma seringa especial do kit, que é transferido para uma bolsa de coleta conectada ao dispositivo de centrifugação pela válvula número 1 do sistema, sendo centrifugado por 3,75 minutos a r.p.m.. Para transferir o plasma para seção oposta da bolsa de coleta, abre-se a válvula e automaticamente o conteúdo passa através da válvula dois até transferir conjuntamente 1mm 3 de células vermelhas, isto garante que todas plaquetas sejam capturadas. É realizada a segunda centrifugação, concentrando as plaquetas. Injetando-se 35mm 3 de ar dentro da válvula 3 após a reabertura do grampo, o plasma pobre em plaquetas retorna para a seção 1. O plasma rico em plaquetas então é transferido para seringas de 10mL via a válvula 4, estando pronto para ser utilizado. O método PRGF consiste no método tradicional de coleta com tubos contendo citrato, centrifugação em centrífuga de laboratório, pipetagem para separar os constituintes do sangue e separar o plasma rico em plaquetas do plasma pobre. Os plasmas obtidos nos dois métodos foram submetidos ao teste de imunoabsorção pelo Quantikine Elisa Kit, para mensurar a quantidade de fatores de crescimento

76 75 presentes (TGF-β1, PDGF-AB, IGF-I). Com base nos resultados obtidos os autores observaram que o método de coleta e obtenção do PRP, pelo método PCCS é muito superior ao método PRGF em relação a quantidade de plaquetas e leucócitos coletados. Também concluíram que a quantidade de fatores de crescimento presentes no PRP obtido pelo método PCSS é maior que no método PRGF

77 76 3 PROPOSIÇÃO A proposta deste trabalho foi avaliar a capacidade da proteína derivada do órgão do esmalte (Emdogain ), do plasma rico em plaquetas e do hidróxido de cálcio em promover a reparação tecidual em trepanações de furca em dentes de cães.

78 77 4 MATERIAL E MÉTODO Para a execução deste trabalho foram utilizados 48 dentes, terceiros e quartos premolares de seis cães machos Cannis domesticus (raça Beagle) com idade média de 18 meses. Os cães foram provenientes do laboratório UNITOX (Laboratório Universitário de Análises Toxicológicas, da Universidade de Santo Amaro- S.P.) que faz parte da Universidade de Santo Amaro (registro no Kenel Club Paulista nº RC/SP01/ /06/ Associação Cinológica do Brasil). Todos procedimentos que foram executados seguiram as normas operacionais-padrão das Boas Práticas de Laboratório, exigidas pelo INMETRO, para obtenção do certificado de qualidade. Também foi autorizado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FOSJC- UNESP (Anexo A). * 4.1 Procedimentos pré-operatórios e operatórios Os procedimentos pré-operatórios e operatórios necessitaram de acompanhamento e orientação de um médico veterinário. Foram executados exames laboratoriais nos animais para comprovação da saúde, antes dos mesmos serem submetidos aos procedimentos cirúrgicos desta pesquisa. Os exames foram executados quatro dias antes da experimentação e compreenderam: hemograma completo, urina do tipo I e coproparasitológico. Nesta mesma data foi * Protocolo n 0 053/2002-PA/CEP Dr. Luís Henrique Cipolloti

79 78 realizado, pelo médico veterinário, um exame clínico, seguindo os procedimentos operatórios do canil. Os animais foram isolados, em baias individuais, e considerados em fase experimental e cada animal foi identificado eletronicamente por meio de um microchip. Para os procedimentos cirúrgicos, os animais foram anestesiados de acordo com o proposto por Massone 77, Para pré-anestesia foi utilizada a injeção endovenosa de atropina (sulfato de atropina - Laboratório Vitex do Brasil), que é um anticolinérgico, na dosagem de 0,044 mg/kg, associada a um tranqüilizante, o Amplictil (cloridrato de clorpromazina - Rhodia, Brasil), também via endovenosa na dosagem de 1 a 2mg/kg. Em seguida os animais foram anestesiados com injeção endovenosa de Ketamina 50 (cloridrato de ketamina Holliday- Scott S. A.- Beunos Aires, Argentina), na dosagem de 0,1mg/kg, associado ao Diazepan N. Q. (Novaquímica Laboratórios- São Bernardo do Campo- São Paulo, Brasil), na dosagem de 1 a 2mg/kg. Durante os procedimentos operatórios os animais foram mantidos através de administração endovenosa com solução Ringer/lactato de sódio (JP Indústria Farmacêutica S.A.- Ribeirão Preto- São Paulo, Brasil). Por meio de um posicionador para tomadas radiográficas para cães, desenvolvido por Cordeiro et al., em 1993, foram executadas tomadas radiográficas em várias fases do experimento: antes do início do tratamento, após execução do tratamento endodôntico, após a trepanação da furca, após o fechamento da trepanação e antes da eutanásia dos animais. A profilaxia dental foi realizada com taças de borrachas em baixa rotação com pedra-pomes e água para posteriormente se executar o isolamento absoluto com dique de borracha e selamento com cianocrilato (Loctite - 3M - Brasil) dos dentes envolvidos no experimento. LEONARDO, M.R. et al. (Faculdade de Odontologia de Arararquara- UNESP). Comunicação pessoal, 1993.

80 79 Após o isolamento, foi feita a assepsia do campo operatório com álcool iodado 0,3%. Para realização da abertura coronária, primeiramente procedeu-se o desgaste oclusal com pontas diamantadas cilíndricas 1092 ISO 012 (KG Sorensen- Barueri, São Paulo) em alta-rotação e sob refrigeração constante de spray de ar-água. Após, com pontas diamantadas esféricas 1013 (KG Sorensen- Barueri, São Paulo), realizouse o acesso à câmara pulpar nas regiões mesiais das faces oclusais, até que ocorressem as exposições pulpares (Figura 1). Estes procedimentos foram realizados com pressão intermitente para evitar concentração do calor no órgão pulpar. Com pontas diamantadas cônicas 3083 (KG Sorensen- Barueri, São Paulo), complementou-se a abertura, tracionando as pontas diamantadas para distal até expor toda a câmara pulpar, especialmente o assoalho. A polpa coronária da câmara foi então curetada com curetas novas e afiadas (Duflex nº14) e o controle do sangramento foi realizado com irrigações com soro fisiológico (JP Indústria Farmacêutica S.A. - Ribeirão Preto- Brasil), utilizando-se para isso, uma seringa tipo Luer de 20mL e uma cânula 30X7, seguido da compressão leve com bolinhas de algodão esterilizadas embebidas em soro. Após o controle do sangramento, foi executada a odontometria com uma lima tipo Kerr n o 30 (Maillefer, Dentsply, Suíça), até o limite do delta apical de cada um dos canais, mesial e distal, e os canais preparados até a lima tipo Kerr n o 60 (Maillefer, Dentsply, Suíça), intercalando com irrigação de 5mL de hipoclorito de sódio 0,5% (Iodontec, Brasil) a cada troca de instrumento. Os canais foram secos com cones de papéis estéreis (Tanari, Brasil), e foi realizado a seleção do cone de guta-percha principal, a partir do cone n o 60. Os canais foram obturados com cones de guta-percha e cimento Endofill (Dentsply, Brasil) pela técnica da condensação lateral (Figura 2), seguido de tomada radiográfica para constatação da qualidade das obturações. Executadas as obturações, as trepanações foram realizadas com pontas diamantadas cilíndricas 2137F ISO 806 (KG Sorensen- Barueri, São Paulo), acopladas a turbinas de alta-

81 80 rotação, sob irrigação constante com soro fisiológico estéril, para evitar superaquecimento e necrose dos tecidos periodontais adjacentes. As trepanações respeitaram um diâmetro crítico de 1mm (Figuras 3 e 4). FIGURA 1 - Início do acesso à câmara pulpar. FIGURA 2 - Obturação dos canais pela técnica de condensação lateral.

82 81 FIGURA 3 - Trepanação da furca executada com broca 2137 F (KG Sorensen- São Paulo). FIGURA 4 - Vista oclusal da trepanação realizada no assoalho da câmara pulpar.

83 82 Após as perfurações serem executadas, e realizado o controle do sangramento, os dentes foram divididos em grupos de acordo com os materiais a serem utilizados nas perfurações (Quadro 1): a) grupo EMD: Foi executado o preenchimento da trepanação com Emdogain (Biora Inc., Espanha) e fechamento com mineral trióxido agregado (MTA - Mineral Trioxide Agregatte, Ângelus, Brasil); b) grupo PRP: Foi executado o preenchimento da trepanação com PRP (plasma rico em plaquetas) e MTA; c) grupo Ca(OH) 2 : foi realizado o fechamento com hidróxido de cálcio P.A. (Iodontec, Brasil) e MTA; Para melhor padronização e evitar variações quanto a resposta orgânica de cada animal, realizou-se a divisão em grupos em sistema de rodízio. Desta forma, todos animais apresentaram os três grupos analisados. Os animais foram operados em dois períodos. A primeira intervenção foi realizada sessenta dias antes da data da eutanásia, e a segunda intervenção trinta dias antes. Este método foi adotado, pois permitiu a avaliação num mesmo animal de diferentes produtos em tempos diferentes, diminuindo os riscos de morte do animal.

84 83 QUADRO 1 Divisão dos grupos experimentais Grupo 1 (EMD)* Grupo 2 (PRP)** Grupo 3 (Ca(OH) 2 ) Tempo de avaliação A B A B A B 30 dias 60 dias 30 dias 60 dias 30 dias 60 dias Nº de dentes *EMD - EMDOGAIN; **PRP - plasma rico em plaquetas. A aplicação dos materiais nas perfurações foi realizada da seguinte forma: Grupo 1: o material matriz Emdogain (EMD), que entrou em contato com os tecidos na região da trepanação, foi aplicado através da seringa do gel de Emdogain até promover o extravasamento no assoalho da câmara pulpar; sobre este foi aplicado como selador o MTA. O gel de Emdogain foi utilizado segundo as normas de aplicação do fabricante BIORA R. Cada jogo do produto contendo uma seringa com o gel já preparado, foi posicionado na luz da perfuração, extravasando-o para o ligamento periodontal (Figuras 5, 6 e 7). Logo após a aplicação do gel, o excesso extravasado no interior da câmara pulpar foi removido com bolinhas de algodão estéreis e a perfuração obliterada com MTA. Os fechamentos das perfurações foram executados com MTA (Mineral Trioxide Agregatte), marca comercial Ângelus, Brasil. O MTA foi colocado sobre a perfuração tomando-se o cuidado para não levá-lo em contato com o ligamento periodontal, apenas selando a cavidade, fato que foi confirmado através de tomada radiográfica da região.

85 84 Posteriormente, as cavidades de acesso foram seladas com cimento de ionômero de vidro, Vitremer (3M Dental Products, Estados Unidos). FIGURA 5 - Kit Emdogain gel (Biora R -Espanha).

86 85 FIGURA 6 - Aplicação do EMDOGAIN. FIGURA 7 - Câmara pulpar preenchida com EMDOGAIN.

87 86 Grupo 2: como material matriz, em contato com os tecidos na região da perfuração, foi aplicado através de uma seringa o plasma rico em plaquetas (PRP), também até ser extravasado para o ligamento periodontal; sobre este, como material selador, foi aplicado o MTA. Para obtenção do plasma rico em plaquetas seguiu-se a metodologia proposta por Marx et al. 76 (1988) e Pontual et al. 96 (2004). Foi feita a coleta de 20mL de sangue do animal com o dispositivo de coleta com tubos a vácuo, contendo no interior citrato de sódio que é uma substância anticoagulante (Figuras 8 e 9). As amostras sangüíneas contidas nos tubos foram colocadas numa centrífuga (SIN - Sistema Nacional de Implantes, São Paulo, Brasil) a 1200 rpm por 10 minutos, para que se promovesse a separação dos constituintes do sangue em plasma rico em plaquetas (PRP), plasma pobre em plaquetas (PPP) e células vermelhas (Figuras 10 e 11). Como o plasma rico em plaquetas se localiza na camada intermediária, foi necessária a separação incremental das camadas do constituinte menos denso para o mais denso pelo separador de células. Para a realização da separação do PRP, do PPP e das células vermelhas, foi utilizada uma micropipeta automática de 100 microlitros (Biohit, Finlândia), realizando a pipetagem cuidadosa do plasma, que foi colocado em tubos de ensaio estéreis. Após, foi realizado a segunda centrifugação, 1200 rpm por 10 minutos para obter-se a concentração do PRP. Assim foi obtido no tubo de ensaio, traçando uma linha imaginária separando seu conteúdo em partes iguais, a parte superior correspondente ao PPP e a parte inferior correspondente ao PRP (Figura 12). Para aplicação do PRP, o mesmo foi removido do tubo de ensaio e adicionado a uma mistura de 8:1 de cloreto de cálcio 10% com uma solução de trombina bovina tópica (Soluplastin - Werner Labs) (Figura 13) e dois mililitros de água estéril, numa cubeta metálica esterilizada, promovendo o início do processo de coagulação, permitindo a aplicação do PRP na forma de gel (Figura 14). Foi reservada parte do

88 87 PRP na forma líquida, que foi utilizado para irrigar a perfuração antes da aplicação do gel. Antes da colocação do gel, o PRP líquido foi injetado no interior da perfuração, e em seguida colocado o gel de PRP introduzindo-o no interior da perfuração com a ajuda de uma sonda periodontal, extravasando-o para o interior do ligamento periodontal e recobrindo todo o assoalho da câmara pulpar (Figuras 15,16 e 17). Logo após a aplicação do gel, a perfuração foi fechada com MTA. Posteriormente, as cavidades de acesso foram seladas com cimento de ionômero de vidro, Vitremer (3M Dental Products, Estados Unidos). FIGURA 8 - Coleta de sangue do animal pelo médico veterinário.

89 88 FIGURA 9 - Sangue do animal em tubo com anticoagulante. FIGURA 10 Centrífuga utilizada para obtenção do PRP.

90 89 FIGURA 11 - Sangue após a primeira centrifugação. FIGURA 12 - Plasma após a segunda centrifugação.

91 90 FIGURA 13 - Tromboplastina e cloreto de cálcio. FIGURA 14 - Gel de PRP.

92 91 FIGURA 15 - Irrigação do plasma rico em plaquetas líquido (PRP). FIGURA 16 - Gel de PRP sendo aplicado na trepanação.

93 92 FIGURA 17 - Gel de PRP extravasado sobre o assoalho da câmara pulpar. Grupo III: Foi aplicado como matriz, diretamente sobre a trepanação, hidróxido de cálcio P.A., com o auxílio de um portaamálgama. Logo após a aplicação do hidróxido de cálcio P. A., a luz da perfuração foi selada com MTA. Posteriormente, os dentes foram selados com cimento de ionômero de vidro, Vitremer (3M - Dental Products, Estados Unidos). 4.2 Eutanásia dos animais Quatro dias antes da eutanásia dos animais, novos exames laboratoriais foram realizados: hemograma completo, urina tipo I e coproparasitológico. Estes exames foram executados pelo médico veterinário, de acordo com a técnica de Massone 77, Os animais receberam por via endovenosa Ketamina 50 (cloridrato de ketamina Holliday - Scott S. A. -

94 93 Beunos Aires - Argentina), na dosagem de 2mg/kg, seguida de uma injeção endovenosa rápida de Thionembutal (tiopental sódico - Abbott Laboratories Norths Chicagos- Illinois- USA), na dosagem de 0,5g. 4.3 Preparo dos espécimes Após a eutanásia dos animais, as mandíbulas e as maxilas foram separadas dos corpos dos mesmos no menor tempo possível através da utilização de uma serra elétrica (serra elétrica para cortar gesso - Darvas Indústruia de Aparelhos Eletro-Médicos LTDA). Foram confeccionados blocos com os dentes e o tecido ósseo subjacente, com o auxílio de uma serra manual, e então realizadas as respectivas radiografias dos espécimes (Figura 18). Os blocos obtidos foram imersos em solução de formalina 10%, tamponada em ph neutro, permanecendo por no mínimo 72 horas. Depois da fixação, os espécimes foram colocados em solução desmineralizadora de ácido Plank, trocando a solução a cada três dias, onde permaneceram até a completa desmineralização, para então, serem lavados em água corrente por um período de 24 horas. O período para realização da desmineralização foi de aproximadamente oito meses. Seguindo-se os procedimentos histotécnicos de rotina, as peças foram submetidas à desidratação por álcoois de concentrações crescentes, diafanização (xilol) e inclusão em parafina. Os cortes dos blocos de parafina foram realizados de forma semiseriada em micrótomo numa espessura de 4µm. Os cortes foram realizados no plano áxio-mésio-distal dos dentes, sendo um total de oito cortes para cada dente. Para possibilitar a análise dos espécimes em microscópio foram utilizadas técnicas de coloração de hematoxilinaeosina e tricrômico de Masson.

95 Análise dos espécimes Foram feitas avaliações microscópicas qualitativas das reações ocorridas no tecido ao redor das trepanações e do fechamento das mesmas, procurando observar as seguintes alterações: a) processo inflamatório b) formação de cemento c) formação de ligamento periodontal d) formação de osso alveolar e) reabsorção óssea f) reabsorção radicular 4.5 Análise estatística Para permitir a avaliação estatística não-paramétrica dos dados obtidos na avaliação qualitativa dos espécimes histológicos, utilizou-se escores quanto à reparação óssea, reabsorção radicular e intensidade do infiltrado inflamatório (Quadro 2). Estes dados foram submetidos ao teste Statistix (versão 8.0, ano de 2003, Analytical Software, Inc.). Os testes empregados para permitir a comparação entre grupos foram Kruskal- Wallis (One-Way) e Teste de Dunn (5%). Para analisar a comparação entre períodos de observação (trinta e sessenta dias) foi utilizado o teste de permutação (Wilcoxon Rank Sum Test).

96 95 QUADRO 2 Índices dos parâmetros avaliados Infiltrado Reparação Reabsorção Escores inflamatório óssea Radicular 0 Ausência do infiltrado Ausência de reparação Ausência de reabsorção 1 Discreto Minima reparação Minima reabsorção 2 Moderado Moderada Moderada 3 Intenso Evidente Intensa FIGURA 18 Radiografia após obtenção do espécime.

97 96 5 RESULTADOS 5.1 Análise descritiva Grupo Ca(OH) 2 / trinta dias. Neste grupo pode-se observar as seguintes características: no local onde a broca perfurou a furca, verificou-se a presença de uma perfuração na crista óssea. Esta perfuração apresentava-se como um espaço vazio, circundado por osso, sendo que na área acima deste defeito havia a presença de infiltrado inflamatório intenso que muitas vezes se estendeu para áreas vizinhas ao local da perfuração (Figura 19). No tecido conjuntivo da região do ligamento periodontal vizinho a região da perfuração observou-se grande congestão vascular, um infiltrado inflamatório com características mistas, predominando células polimorfonucleadas e, em menor número, mononucleadas. As células inflamatórias mais evidentes foram os neutrófilos e os macrófagos (Figuras 20a e 20b). Por vezes, em alguns espécimes observou-se no interior dos defeitos ósseos causados pela ação da trepanação, fragmentos ósseos com características necróticas e circundado por intenso infiltrado inflamatório com características predominantemente neutrofílico (Figura 21). Em nenhum dos espécimes observou-se qualquer processo que indicasse a neoformação óssea na região do defeito, ou no topo da crista do osso alveolar. A característica mais comum encontrada em todos os espécimes foi a presença do intenso infiltrado inflamatório com predominância de células neutrofílicas na região próxima a perfuração (Figura 22).

98 97 D I P FIGURA 19 Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Defeito ósseo provocado pela broca. (Tricômico de Masson - Aumento de 25x). (P= perfuração; D= defeito ósseo; I= infiltrado inflamatório intenso). I FIGURA 20a Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Infiltrado inflamatório intenso (I). (Tricômico de Masson - Aumento de 100x).

99 98 Figura 20b Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Detalhe do infiltrado inflamatório. (Tricômico de Masson - Aumento de 400x). ( = neutrófilos; = macrófagos espumosos). * FIGURA 21 Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Fragmentos ósseos no interior do defeito. (H.E. - Aumento de 100x). (*= necrose; = fragmentos ósseos; = infiltrado inflamatório).

100 99 FIGURA 22 Grupo Ca(OH) 2-30 dias: Infiltrado inflamatório com predominância neutrofílica. (Tricômico de Masson - Aumento de 200x). ( = infiltrado inflamatório com predominância de neutrófilos) Grupo Ca(OH) 2 / sessenta dias Neste grupo houve diferença entre alguns espécimes quanto a intensidade do processo inflamatório que variou de infiltrado inflamatório moderado a intenso (Figura 23a). Nos espécimes onde o processo inflamatório era moderado podese observar presença de tecido conjuntivo ocupando o espaço da perfuração, com inúmeros fibroblastos e células inflamatórias, mas com poucas fibras. Havia a presença de células gigantes multinucleadas próximas as espículas ósseas que estavam presentes no interior do defeito ósseo provocado pela perfuração da furca. Também se observou grande quantidade de vasos sangüíneos congestos no tecido conjuntivo do defeito, e em alguns espécimes certa quantidade de material matriz

101 100 apresentando uma coloração basofílica com características morfológicas irregulares e anguladas sugerindo a presença de cristais de hidroxiapatita (Figura 23b). Em alguns espécimes pode-se observar infiltrado inflamatório intenso e difuso, sendo que na área mais próxima da região da perfuração da furca este infiltrado encontrava-se bem mais intenso e com predominâncias de células neutrofílicas. No tecido conjuntivo presente no interior do defeito, havia a presença de espículas ósseas com características necróticas. Também se observou a presença de reabsorção radicular nas regiões mais próximas dos locais das perfurações. As características observadas nos espécimes foi a presença de tecido conjuntivo com infiltrado inflamatório moderado com características de células polimorfonucleadas. A extremidade da crista óssea da região da furca apresentou-se com característica aplainada sob um tecido conjuntivo fibroso. Nenhum dos espécimes apresentou indícios de possível neoformação óssea na região dos defeitos provocados.

102 101 FIGURA 23a Grupo Ca(OH) 2-60 dias: Infiltrado Inflamatório moderado a intenso. (Tricômico Masson -100x). ( = infiltrado inflamatório moderado). * FIGURA 23b Grupo Ca(OH) 2-60 dias: Detalhe da região do defeito ósseo. (Tricômico de Masson - 200x). (*= fibroblastos; = células gigantes mutinucleadas; = material matriz).

103 Grupo Emdogain/ trinta dias Neste grupo observou-se que na região do defeito ocorreu o preenchimento com tecido conjuntivo fibroso com presença de infiltrado inflamatório discreto e grande número de vasos sanguíneos dilatados e congestos. O tecido conjuntivo apresentava grande quantidade de fibroblastos jovens e volumosos. Também nestes espécimes observou-se a presença de fragmentos ósseos com características necróticas, cemento e dentina no interior do defeito ósseo provocados pela perfuração da furca. Havia a presença de células gigantes multinucleadas próximas a estes fragmentos (Figuras 24a e 24b). * FIGURA 24a Grupo Emdogain - 30 dias: Tecido conjuntivo com numerosos fibroblastos jovens. (Tricômico de Masson - 100x). (*= fragmentos ósseos com células multinucleadas gigantes; = fibroblastos jovens e volumosos; = infiltrado inflamatório discreto).

104 103 * FIGURA 24b Grupo Emdogain - 30 dias: Detalhe dos fibroblastos (*) e vasos sanguíneos congestos ( ). (Tricômico de Masson -200x). As características mais comuns observadas nos espécimes foram o preenchimento do defeito ósseo por tecido conjuntivo fibroso, acima e mais próximo da perfuração, a presença de um tecido de granulação bem vascularizado e a presença de muitos fibroblastos jovens e bem volumosos (Figura 25). Também se observou o início de formação de matriz óssea no interior do tecido conjuntivo que preenchia o defeito ósseo, com grande quantidade de osteoblastos volumosos e osteócitos também volumosos no interior da nova matriz óssea formada (Figuras 26, 27 e 28). Somente em um espécime observou-se a presença de infiltrado inflamatório moderado mais superficial e próximo à área da perfuração com predominância de células inflamatórias polimorfonucleadas (Figura 29).

105 104 * FIGURA 25 Grupo Emdogain - 30 dias: Defeito preenchido com tecido conjuntivo. (Tricômico de Masson -25x). (*= tecido conjuntivo; = tecido de granulação bem vascularizado).

106 105 FIGURA 26 Grupo Emdogain - 30 dias:indícios da formação de matriz óssea. (Tricômico de Masson - 100x). ( = osteoblastos jovens e volumosos; = osteócitos). FIGURA 27 Grupo Emdogain - 30 dias: Início do processo de reparo ósseo na margem do defeito. (Tricômico de Masson - 200x). ( = osteoblastos jovens e volumosos).

107 106 FIGURA 28 Grupo Emdogain - 30 dias: Detalhe dos osteoblastos e da matriz óssea em formação. (Tricômico de Masson - 200x). ( = osteoblastos jovens e volumosos; = matriz óssea). FIGURA 29 Grupo Emdogain - 30 dias: Infiltrado inflamatório moderado mais superficial. (H.E x). ( = neutrófilos).

108 Grupo Emdogain/ sessenta dias No grupo tratado com Emdogain aos sessenta dias observou-se a presença de tecido conjuntivo com fibras e grande número de fibroblastos jovens e volumosos; muitos vasos sangüíneos, infiltrado inflamatório discreto com predominância de células inflamatórias mononucleadas, próximas a área da perfuração e localizado acima da crista óssea que apresentava característica de reparação (Figuras 30, 31a e 31b). Em um espécime pode-se observar o extravasamento de MTA para a região do ligamento gerando uma reação de corpo estranho caracterizando um processo inflamatório moderado com muitas células gigantes multinucleadas (Figura 32). Neste mesmo espécime notou-se a presença de defeito ósseo residual sendo que o osso remanescente, no local do defeito causado pela perfuração, apresentava características de vitalidade e com sinais de remodelação, com presença das trabéculas ósseas circundadas por osteoblastos volumosos e osteoclastos no interior de espaços medulares (Figura 33). O processo de remodelação óssea ficou mais evidente através da presença de linhas reversas no tecido ósseo (Figura 34). As características mais observadas foram: a reparação do topo da crista óssea com a presença de trabéculas ósseas mais superficiais e reabsorção por células gigantes, osteoclastos e grande quantidade de osteoblastos circundando estas trabéculas (Figura 35). Uma observação importante foi a presença de tecido ósseo circundando o MTA que extravasou para a área do ligamento periodontal (Figura 36).

109 108 * FIGURA 30 Grupo Emdogain - 60 dias: Defeito ósseo preenchido com tecido conjuntivo. (Tricômico de Masson - 25x). (*= tecido conjuntivo; = defeito ósseo). * FIGURA 31a Grupo Emdogain - 60 dias: Tecido conjuntivo com grande número de fibroblastos jovens e volumosos, e discreto infiltrado inflamatório. (Tricômico de Masson - 100x). (*= discreto infiltrado inflamatório; = fibroblastos).

110 109 FIGURA 31b Grupo Emdogain - 60 dias: Osteoblastos na margem do defeito indicando neoformação óssea. (Tricômico de Masson - 100x). ( = osteoblasto). FIGURA 32 Grupo Emdogain - 60 dias: Presença de MTA fagocitado por células gigantes multinucleadas ( ). (H.E x).

111 110 FIGURA 33 Grupo Emdogain - 60 dias: Trabéculas ósseas circundadas por osteoblastos ( ). (Tricômico de Masson - 100x). FIGURA 34 Grupo Emdogain - 60 dias: Presença de linhas reversas no osso remanescente ( ). (H.E. -100x).

112 111 FIGURA 35 Grupo Emdogain - 60 dias: Indícios de reparação do topo da crista óssea ( ). (Tricômico de Masson - 100x). FIGURA 36 Grupo Emdogain - 60 dias: Tecido ósseo circundando fragmentos de MTA ( ). (H.E x).

113 Grupo PRP/ trinta dias Foi possível observar em um espécime, na abertura da perfuração da furca, a presença de um tecido conjuntivo frouxo com muitos vasos sanguíneos e a predominância de infiltrado inflamatório mononucleado, mas com algumas células polimorfonucleadas localizadas mais próximas da abertura. Acima da crista óssea, havia a presença de infiltrado inflamatório moderado para intenso, com a presença de macrófagos espumosos e bastante edema local (Figura 37). O osso residual da crista apresentava características de vitalidade com a presença de trabéculas ósseas delgadas circundadas por osteoblastos jovens e volumosos (Figura 38). * FIGURA 37 Grupo PRP - 30 dias: Região da perfuração (*) demonstrando o edema local ( ). (H.E. - 25X).

114 113 FIGURA 38 Grupo PRP - 30 dias: Osso remanescente circundado por osteoblastos ( ). (H.E x). Em um outro espécime observou-se, no tecido conjuntivo próximo a abertura da perfuração, grande quantidade de vasos sanguíneos dilatados e congestos com fibras conjuntivas, e infiltrado inflamatório misto, polimorfonucleado e mononucleado, mais concentrado no centro do tecido logo abaixo da perfuração. Havia grande quantidade de edema separando as fibras e as células do tecido conjuntivo (Figura 39), sendo que na região mais próxima ao osso da crista, que se apresentava reabsorvida, havia a presença de um tecido conjuntivo fibroso (Figura 40). Embora o osso da crista tenha sofrido reabsorção, este se apresentava com características de vitalidade, devido a presença do grande número de osteoblastos circundado as trabéculas ósseas. Em algumas regiões foi possível notar a presença de fragmentos de dentina circundados por células gigantes.

115 114 FIGURA 39 Grupo PRP - 30 dias: Edema separando as fibras do tecido conjuntivo ( ). (H.E x). FIGURA 40 Grupo PRP - 30 dias: Detalhe da reabsorção ( ) do topo da crista óssea. (Tricômico de Masson - 100x).

116 115 O osso remanescente da crista apresentava-se bem preservado, com osteoblastos volumosos circundando as trabéculas sendo indicativo da vitalidade óssea. O interior do defeito ósseo estava preenchido com um infiltrado inflamatório discreto com predominância de células mononucleadas (Figura 41). As paredes internas do defeito apresentavam reabsorções ósseas, havendo nesta área grande presença de osteoclastos (Figura 42). Nas extremidades do defeito ósseo foi possível observar áreas de neoformação óssea (Figura 43). Em um espécime observou-se pouco infiltrado inflamatório no tecido conjuntivo que no interior da perfuração (Figura 44a). Verificou-se a presença de focos de formação de tecido ósseo circundado por osteoblastos jovens e volumosos que também estavam presentes no topo da crista óssea. No geral podem-se observar características comuns nos espécimes como: tecido conjuntivo próximo à abertura da perfuração (Figura 44b); na região do defeito verificou-se a presença de tecido conjuntivo bem vascularizado com pouco infiltrado inflamatório; osso residual da crista bem vital caracterizado pela presença de osteoblastos na periferia; presença de ilhotas de formação óssea, sendo que nas regiões de formação óssea, nas paredes laterais internas dos defeitos ósseos, havia a presença de osteoblastos e osteócitos volumosos (Figura 45). Neste grupo pode-se evidenciar a presença da neoformação óssea na região próxima a perfuração.

117 116 FIGURA 41 Grupo PRP - 30 dias: Discreto infiltrado inflamatório. (H.E x). ( = células mononucleadas). FIGURA 42 Grupo PRP - 30 dias: Reabsorção das paredes internas do defeito. (H.E x). ( = osteoclastos).

118 117 FIGURA 43 Grupo PRP - 30 dias: Neoformação óssea nas extremidades do defeito. (Tricômico de Masson - 200x). ( = osteoblastos). FIGURA 44a Grupo PRP - 30 dias: Detalhe do infiltrado inflamatório na área da perfuração ( ). (H.E x).

119 118 FIGURA 44b Grupo PRP - 30 dias: Tecido conjuntivo próximo a perfuração ( ). (H.E x). * * FIGURA 45 Grupo PRP - 30 dias: Aspecto de vitalidade do osso remanescente. (Tricômico de Masson - 200x). ( = osteoblasto, *= osteócitos).

120 Grupo PRP/ sessenta dias Neste grupo observou-se presença de infiltrado inflamatório discreto com predominância de células mononucleadas contidas em um tecido conjuntivo fibroso. Nas margens do defeito ósseo havia grande quantidade de osteoblastos volumosos e jovens. A crista óssea apresentava-se com a forma aplainada (Figura 46) e com a presença de osteoclastos. Em outros locais observou-se grande quantidade de fibroblastos e osteoblastos bem volumosos nas margens do defeito ósseo residual, com a presença de tecido conjuntivo fibroso no interior do defeito. O osso interproximal apresentava amplos espaços medulares, e na porção mais superficial da crista notou-se a presença de trabéculas ósseas delgadas com características imaturas circundadas por osteoblastos volumosos. Também se observou a presença de osteoclastos e a grande quantidade de vasos nos espaços medulares (Figuras 47a e 47b). Em todos espécimes foi possível observar características comuns como, presença de neoformação de trabéculas ósseas delgadas circundadas por osteoblastos volumosos e também osteoclastos, evidenciando o novo osso neoformado. Também se notou a presença de osteócitos no interior das trabéculas ósseas, sendo estes bem volumosos sugerindo o processo de neoformação óssea e os espaços medulares estavam preenchidos por tecido conjuntivo fibroso (Figuras 48, 49 e 50).

121 120 FIGURA 46 Grupo PRP - 60 dias: Crista óssea com a presença de discreto infiltrado inflamatório. (Tricômico de Masson - 25x).

122 121 * FIGURA 47a Grupo PRP - 60 dias: Espaços medulares. (H.E x). ( = osteoblasto, *= vasos sanguíneos). FIGURA 47b Grupo PRP - 60 dias: Espaços medulares com osteoclastos ( ) e grande quantidade de vasos sanguíneos. (H.E x).

123 122 FIGURA 48 Grupo PRP - 60 dias: Região da perfuração. (H.E x). FIGURA 49 Grupo PRP - 60 dias: Osteoblastos ( ) circundando as trabéculas ósseas. (H.E x).

124 123 * FIGURA 50 Detalhe dos osteoblastos ( ) e osteócitos (*) das trabéculas ósseas. (Tricômico de Masson - 200x).