NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS - EXPRESSÃO DE MARCADORES MOLECULARES COMO FATORES PROGNÓSTICOS E PREDITIVOS RESUMO

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1 NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS - EXPRESSÃO DE MARCADORES MOLECULARES COMO FATORES PROGNÓSTICOS E PREDITIVOS (Canine mammary neoplasms - Expression of molecular markers as prognostic and predictive factors) ARAÚJO P.B.¹ *,EVÊNCIO NETO, J.² 1. Doutoranda em Ciência Veterinária. Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife/PE, Brasil. 2. Professor Adjunto. Departamento de Fisiologia e Morfologia Animal. Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife/PE, Brasil. RESUMO Os marcadores moleculares em oncologia têm sido utilizados de forma a contribuir no diagnóstico, e, sobretudo em estabelecer um prognóstico mais preciso, trazendo informações úteis inclusive para instituição da terapêutica mais adequada para cada caso. Nesse contexto, as neoplasias mamárias caninas servem ainda como modelo de estudos para as neoplasias mamárias humanas, uma vez que ambas apresentam semelhanças histopatológicas e moleculares. A demonstração de parâmetros clínicos e terapêuticos com significado prognóstico e terapêutico é um valioso campo de estudo na medicina veterinária, e assim, o estudo de marcadores moleculares com valor como fatores prognóstico e preditivo para neoplasias mamárias, vem ganhando espaço na medicina veterinária. Palavras-chave: oncologia, cadela, tumor de mama. ABSTRACT Molecular markers in oncology have been used in order to contribute to diagnosis, and to establish a more accurate prognosis, bringing useful information including institution of therapy most appropriate for each case. In this context, the canine mammary neoplasms also serve as a model for studies of human breast tumors, as they present histological and molecular similarities. The demonstration of clinical and therapeutic prognostic significance and therapeutic is a valuable field of study in veterinary medicine, and thus the study of molecular markers with value as prognostic and predictive factors for breast tumors, has been gaining ground in veterinary medicine. Keywords: oncology, dog, breast tumor. * Endereço paracorrespondência: Rua Coronel Antônio Souto, 149, apto 11, São José Garanhuns PB CEP: priscillaaraujo@live

2 INTRODUÇÃO As neoplasias são afecções frequentes na clínica médica veterinária, e, no que diz respeito aos caninos, os tumores de mama em fêmeas correspondem a aproximadamente 52%dos casos, dos quais metade é maligno (Dore, 2012; Cassali, 2011). A sobrevida de animais com câncer depende de diversos fatores,entre ele tipo e tamanho do tumor, graduação histológica,idade do paciente e comportamento biológico da neoplasia. Neste contexto, o estudo da expressão de marcadores moleculares tem se tornado degrandeimportância, uma vez que contribui para melhor elucidação do quadro clínico do pacienteajudando tanto na definição do diagnóstico e prognóstico de forma mais concreta, como na adequação da conduta terapêutica a ser adotada pelo oncologista. Somado a isto, os tumores mamários caninos apresentam semelhanças histológicas e de comportamento biológico com os tumores mamários humanos, servindo como modelo de estudo para estes últimos. Entende-se por fator de prognóstico as características clínicas, patológicas e biológicas específicas de cada indivíduo e seus respectivos tumores que permitem prever a evolução clínica da doença e o tempo de sobrevida do paciente sem que este tenha recebido algum tipo de tratamento após o diagnóstico inicial. Nessa categoria, o fator prognóstico torna-se mais interessante e assume um caráter preditivo da terapêutica a ser instituída (Abreu &Koifman, 2002). Em contraste com os fatores de prognóstico, os fatores preditivos permitem, com base nos dados clínicos, patológicos e biológicos, direcionar tratamentos específicos e individualizados (Gobbiet al., 2008). Poucos marcadores são considerados exclusivamente como sendo de prognóstico, enquanto a maioria deles é considerada tanto de prognóstico quanto preditivo (Zanettiet al., 2011). A maioria dos tumores de mama, assim como os tumores em geral, são resultantes de alterações genéticas e epigenéticas que se acumulam nas células e que podem mudar a morfologia e a função das mesmas (Daidone et al., 2004; Lopez- Garcia et al., 2010). Por isso, alterações neste microambiente podem ser tão significativas a ponto de possibilitar o desenvolvimento e a progressão de um tumor (Polyak&Kalluri, 2010). Assim, o estudo de receptores celulares e outras moléculas que estão relacionadas de alguma forma à progressão tumoral permite a melhor caracterização das neoplasias, constituindo fatores prognósticos e preditivos importantes, para definição do prognóstico e terapêutica mais adequada. NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS As neoplasias mamárias caninas constituem uma das afecções mais frequentes da rotina da clínica médica veterinária. É o tipo de tumor mais frequente em fêmeas, e cerca de 50% deles são malignos (Dore, 2012).Essas neoplasias são detectadas em animais de meia idade, entre 9 e 11 anos, com maior chance de desenvolvimento a partir dos 6 anos de idade (Perez-Alenzaet al., 2000; Sorenmoet al., 2011).Não existe uma predisposição racial evidente, embora as raças de caça sejam apontadas, por alguns autores, como tendo maior predisposição para esta patologia. Sabe-se apenas que cães das raças Boxer e Beagle são referidos como aqueles que apresentam menor risco de desenvolverem tumores de mama (Queiroga & Lopes, 2002). É comum que mais de uma glândula esteja envolvida no processo neoplásico, assim como também é possível encontrar mais de um tipo histológico numa mesma mama, o que permite considerar as neoplasias mamárias caninas como multicêntricas (Peteleiro, 1994). O desenvolvimento das neoplasias é mais frequente nas mamas inguinais, diminuindo gradativamente até as glândulas torácicas (Sorribas, 1995). 37

3 Aproximadamente 60% dos neoplasmasnestas primeiras, o que acontece provavelmente devido ao maior volume do parênquima, com consequente maior resposta proliferativa ao estrógeno (Moultonet al., 1970). Quanto à faixa etária, sabe-se que a idade é um fator influente nos tumores mamários. De acordo com Moulton e colaboradores (1970),as neoplasias de mama em cadelas são raras em cadelas com idade menor que dois anos, com aumento da incidência a partir dos 6, até os 10 anos, quando diminui. Queiroga e Lopes (2002) afirmam que a maioria das cadelas que apresentam a neoplasia tem idade entre oito e dez anos, com média variando entre 7,8 a 8,8 anos. Para os tumores mamários caninos, na ausência de afecção metastática, a cirurgia é o tratamento de escolha (Stone, 1998).A importância da ovariossalpingohisterectomia (OSH) como terapia adjuvante para o tumor de mama ainda não está esclarecida. Inicialmente se pensava que a castração das cadelas com tumores promoveria regressão dos mesmos, pela remoção da influência estrogênica. Porém estudos mais recentes têm demonstrado que a OSH realizada no momento da remoção do tumor não tem efeito protetor sobre o aparecimento de novos nódulos ou sobre a taxa de sobrevida (Fonseca &Daleck, 2000). Contudo, Sorenmo e colaboradores (2011) relatam maior sobrevida das cadelas submetidas à mastectomia associada à castração ou quando esta é realizada até 24 meses antes da exérese do nódulo primário. Outros métodos alternativos como a radioterapia e a hormonioterapia são pouco utilizados na Medicina Veterinária. A radioterapia é indicada quando a remoção cirúrgica não é possível, no controle da dor local, resultante da compressão tumoral ou ainda para promover a citoredução do tumor em regiões de difícil acesso cirúrgico (Matoset al., 2006). Entretanto a radioterapia, assim como os protocolos quimioterápicos antineoplásicos apresentam baixa atividade antitumoral para as neoplasias mamárias (Ruttemanet al., 2001). Todavia, a presença de receptores para hormonais em neoplasias mamárias caninas sugere a terapia hormonal como alternativa para o tratamento nessa espécie, semelhante ao que acontece na medicina humana (Sorenmo, 2003; Tavares et al., 2009). ONCOGÊNESE MAMÁRIA Uma neoplasia é um crescimento de células novas, originalmente derivadas dos tecidos normais que sofreram alterações genéticas, permitindo-lhes que não respondam aos controles de crescimento e se entendem para além dos limites normais (Cassali, 2000). No que diz respeito à influência genética no surgimento da neoplasia, há uma variedade de tipos de genes que estão envolvidos, tais como genes que exercem influência na ativação/detoxificação metabólica, reparo do DNA, estabilidade cromossômica, atividade dos oncogenes ou genes supressores de neoplasias, controle do ciclo celular, transdução de sinal, trajeto hormonal, caminho metabólico das vitaminas, função imune e na ação receptora ou neurotransmissora (Greenwaldet al., 2001).As células dos tumores malignos apresentam genes que se expressam de modo instável e diversificado, com consequente desregulação da diferenciação celular. Geralmente existe o envolvimento de três classes de genes, os proto-oncogenes, que promovem o crescimento dos tumores; os genes oncosupressores, responsáveis pela inibição do crescimento; e os genes que regulam a apoptose (Junqueira & Carneiro, 2000). Os tumores mamários caninos podem se originar a partir de células epiteliais (ductais ou alveolares) ou mesmo do tecido conjuntivo intersticial, e por este motivo, apresentam grande complexidade, com estrutura histológica heterogênea (Zuccariet al., 2001). Há evidências ainda do envolvimento de 38

4 fatores hormonais na etiologia das neoplasias mamárias. Estudos verificam que a incidência das neoplasias é maior em fêmeas não castradas, com diminuição da incidência quando a castração é realizada antes do terceiro cio (Ferri, 2003). Os hormônios ministrados como anticoncepcionais também assumem influência significativa no surgimento da neoplasia: de acordo com Zuccari (2001) a administração de progestágenos propicia a formação de nódulos mamários, que podem predispor o tecido a alterações malignas. Desse modo, verifica-se que as alterações moleculares que são observadas nas células de pacientes com câncer podem estar relacionadas a diversos mecanismos, entre eles, àqueles que regulam a divisão celular normal, a sobrevivência e a morte celular, caracterizando-se por ser um processo heterogêneo e bastante complexo, no qual o conhecimento dos diversos fatores que predispõem e caracterizam os tumores é de extrema importância para estabelecimento da conduta clínica e terapêutica, com oferecimento de melhor qualidade de vida ao paciente. Dentre os marcadores mais estudados, destacam-se os receptores hormonais, os marcadores relacionados à proliferação celular, supressão tumoral, os marcadores mioepiteliais, e mais recentemente a identificação de células-tronco cancerígenas ou células-iniciadoras de tumor (CITs) que possuem capacidade de divisão assimétrica, resistência à apoptose e propriedades para exclusão de corantes e quimioterápicos. MARCADORES DE ANGIOGÊNESE As células neoplásicas possuem a capacidade de induzir neovascularização, e para isso, são capazes de expressar alguns fatores, tais como o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), CD31, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), prostaglandina E 2, entre outros (Horta et al., 2012). A inibição desses mecanismos indutores da angiogênese é capaz de proporcionar um maior período livre da doença com aumento do índice de sobrevivência, consistindo assim, numa forma de direcionamento do tratamento (Sorenmo et al., 2003). EXPRESSÃO DE MARCADORES MOLECULARES EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS Atualmente existe uma série de marcadores moleculares que vem sendo estudados em tumores mamários caninos, na intenção de avaliar sua importância no prognóstico e na terapêutica, bem como na melhor caracterização deste tipo de patologia. Tais marcadores podem trazer informações relevantes no que diz respeito à origem do processo, presença de receptores hormonais (e consequentemente resposta a este tipo de terapia), presença de proteínas indutoras ou inibidoras da apoptose, de oncogenes, entre outros, e, a interpretação de tais resultados pelo oncologista possibilita uma melhor avaliação do paciente. RECEPTORES HORMONAIS O papel desempenhado por fatores hormonais no surgimento da neoplasia foram confirmados em diversos estudos. Receptores para estrógeno, progesterona, andrógenos, prolactina já foram demonstrados nos tumores mamários de cadelas, havendo também a existência de mais de um deles em uma mesma neoplasia (Cassali et al., 2011). Os hormônios esteroidais possuem um papel muito importante no desenvolvimento da glândula mamária e na tumorigênese, agindo através de receptores nucleares localizados nas células alvo (Clarket al., 2005). O estrógeno é um hormônio esteroidal importante no organismo feminino tanto para processos de proliferação, quanto para a sobrevivência celular (Zanattiet al., 2011). 39

5 A positividade para estes receptores é considerada um fator prognóstico (Midsorpet al, 1999) estando relacionada com o melhor prognóstico (Silva et al., 2004),uma vez que se trata de neoplasias melhor diferenciadas Os receptores de estrógenos (RE) e os receptores de progesterona (RP) são atualmente os fatores preditivos mais utilizados para escolha do tratamento hormonal em humanos (Depes et al., 2003). Zuccari e colaboradores (2008) verificaram que cerca de 60% dos pacientes com lesões positivas para receptores hormonais respondem a esta forma terapêutica, enquanto menos de 10% de pacientes com lesões negativas para receptores hormonais respondem ao tratamento. Os tumores malignos apresentam maior frequência da RE negativo e RP positivo (Martin de las Mulaset al., 2005). Assim como ocorre na espécie humana (Perouet al., 2000), a expressão de receptores de estrógeno e progesterona é claramente relacionada ao melhor prognóstico dos pacientes caninos com carcinomas mamários e à responsividade à terapia hormonal (Sorenmo, 2003). MARCADORES DE APOPTOSE CELULAR A apoptose é um mecanismo celular responsável pela regulação da produção de novas células e da capacidade destas se autodestruírem, quando se tornam desnecessárias ou descoordenadas.tal processo tem comprovada importância na determinação do processo tumoral, bem como na sua agressividade (Alberts et. al., 1999). A apoptose é controlada por uma série de sinais intra e extracelulares, que são responsáveis pela indução da morte celular (Miller, 1997). Tais sinais podem ser estudados através de algumas técnicas, como a imunoistoquímica, e a presença ou ausência deles relacionada com o prognóstico do processo patológico. Dentre eles, podemos destacar a capase-3, a proteína p53, a cicloxigenase-2, entre outros. Caspases são proteases ativadas pela clivagem proteolítica em resposta a sinais que induzem a apoptose (Terzianet al, 2007). O processo de clivagem provoca uma morte celular rápida e ordenada, acompanhada por um grupo de alterações morfológicas, bioquímicas e celulares (Miller, 1997). A caspase-3 mais especificamente, vem sendo estudada devidoà ativação que sofre em resposta a vários estímulos, como por exemplo, à quimioterapia, onde a redução da expressão pode indicar um importante mecanismo de sobrevivência celular (De Jong et al., 1997). Tais informações foram confirmadas em estudo realizado porterzian e colaboradores em 2007, que verificaram grande expressão desse marcador em neoplasias malignas. A proteína P53 também é considerada um importante marcador relacionado à apoptose, e está diretamente relacionada ao bloqueio do ciclo celular, possuindo vários mecanismos para efetuar o reparo ou induzir a apoptose. O p53 pode ainda regular o estresse oxidativo, a sobrevida celular, a invasão, a senescência celular, a angiogênese e a diferenciação celular (dentre outros inúmeros fatores) (Vousden& Lane, 2007)Em células normais, a proteína P53 é expressa em níveis muito baixos, porque é extremamente instável e rapidamente degradada e a sua superexpressão está associada a um menor tempo de sobrevida em cadelas com neoplasias (Kandioler-Eckersbergeret al., 2000). A cicloxigenase está relacionada à formação de mediadores inflamatórios, e, a cicloxigenase-2 (COX-2) mais especificamente, bem como seus produtos, inibem a apoptose, diminuem a adesão celular, induzem a proliferação celular e a angiogênese (Cassali et al., 2011). A expressão de COX-2 está relacionada a um mau prognóstico, e é representa um indicador preditivo potencial para a terapêutica com 40

6 inibidores seletivos de COX-2 (Cassali et al, 2001; Horta et al., 2012). MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR Dentre os marcadores de proliferação celular, destaca-se o estudo de Ki-67 e o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Esta classe de marcadores tem sido útil para determinação do comportamento biológico e do potencial de malignidade dos tumores (Sarliet al., 2002). Aqueles que apresentam altas taxas de proliferação celular, na grande maioria das vezes, são de alto grau de malignidade e (Eisenberg&Koifman, 2001) e apresentam curso mais agressivo com aumento do risco de metástases (Hortaet al., 2012). O Ki-67 é uma proteína expressada nas fases ativas do ciclo celular (Terzianet al., 2007), e diversos estudos vem relacionando o número de células positivas para esse marcador com o bom ou mau prognóstico em câncer de mama (Fitzgibbons et al, 2000). Também é auxiliar no diagnóstico de carcinomas mamários em cadelas (Zuccari, 2001; Terzian et al., 2007). PCNA é uma proteína nuclear associada com reparo e replicação do DNA (Queiroz, 2005). E, embora PCNA e Ki-67 terem sido associadas ao prognóstico tumoral, Zuccariet al. (2008), não verificou associação entre estes marcadores e morte por neoplasias, intervalo livre da doença, ou tempo de sobrevida. Como são marcadores de células em multiplicação, marcadores classificados nesta categoria tem valor preditivo, à medida que a positividade para os mesmos indica a possível eficácia de drogas que atuam sobre células nesta fase do ciclo celular. MARCADORES MIOEPITELIAIS A ausência de células mioepiteliais ou perda na integridade da camada basal mioepitelial é considerada um dos pré-requisitos para invasão tumoral e metástase. Apesar do mecanismo pelo qual o mioepitélio atua ainda não estar bem esclarecido, existem uma série de marcadores desta categoria que vem sendo estudados em neoplasias mamárias (Bertagnolli, 2006). Dentre os marcadores mioepiteliais, destacase a expressão dos fatores de crescimento epidermalegrf e HER-2, que, em cadelas, parecem estar relacionados ao desenvolvimento o progressão tumoral (Rutteman et al., 1994). Pode-se citar ainda a marcação para α-actina, p63, e serinmaspin, E-caderina, que podem ser auxiliares para determinação da integridade da camada mioepitelial, cuja perda indica um mau prognóstico (Gamaet al., 2003). A perda do mioepitélio também á associada ao risco de invasões por células neoplásicas, contribuindo consequentemente com a determinação do comportamento biológico da neoplasia, bem como com sua classificação histológica (beningno ou maligno) (Bertagnolli, 2006). Barbareschiet al (2001) e Reis Filho et al. (2003) observaram a perda ou diminuição da expressão de p63 em lesões malignas. Bertagnolli(2006) verificou ainda a presença de p63 ainda em lesões malignas, indicando a presença de uma isoforma desta proteína como fator ativador da oncogênese. A expressão de E-caderina em lesões mamárias caninas comprova o seu papel no auxílio diagnóstico e prognóstico do processo de progressão tumoral. Observa-se uma perda de expressão dessa proteína ao comparar proliferações invasivas e não invasivas e um menor tempo de sobrevida em cães portadores de tumores com baixa expressão para essa proteína (Rodo, Malicka, 2008; Gama et al., 2008). A utilização desses marcadores no estudo comparativo de lesões proliferativas pré-neoplásicas pode fornecer informações importantes sobre o caráter evolutivo das hiperplasias mamárias. CÉLULAS TRONCO TUMORAIS Todos os tecidos do organismo são constituídos a partir de células tronco, com 41

7 capacidade se auto-renovarem e se diferenciarem em tipos celulares do tecido do qual fazem parte (Zanetti et al., 2011). A teoria mais aceita sobre a etiopatogênese do câncer é que ele se origina de uma única célula que adquire a capacidade de se proliferar indefinidamente. Essas células compartilham algumas características com as células tronco do tecido adulto normal, por isso muitas vezes são denominadas células tronco tumorais (Cariati&Purushotham, 2008). Estas células são estudadas através da expressão de CD44 (imunofenótipo CD44+CD24-), MUC1, CD10 e ESA, entre outros (Stingl, 2009; Zanetti et al., 2011). Entretanto a relação entre a presença ou ausência destes marcadores com o prognóstico ou tipo tumoral ainda não está bem esclarecidas, e, na literatura médica veterinária não foram encontrados trabalhos que façam referência a este tipo de estudo em animais. CONSIDERAÇÕES FINAIS O estudo citológico, histoquímico e molecular dos tecidos neoplásicos, e, mais especificamente, dos tecidos neoplásicos mamários representam um vasto campo de estudo, não somente na medicina veterinária, mas na oncologia como um todo. Há uma série de moléculas cuja presença pode ser investigada nos tecidos neoplásicos, e este ramo vem ganhando atenção crescente, uma vez que traz informações relevantes que podem contribuir na definição da conduta clínica e terapêutica, e assim, elucidar melhor o comportamento biológico dos tumores, trazendo uma melhor qualidade e expectativa de vida para o paciente oncológico. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU, A.; KOIFMAN, S. Fatores prognósticos no câncer da mama feminina. RevistaBrasileira de Cancerologia, v.48, n.1, p , BAN, H. S.; UNO, M.; NAKAMURA, H. Suppression of hypoxia-induced HIF-1alpha accumulation by VEGFR inhibitors: Different profiles of AAL993 versus SU5416 and KRN633. Cancerletters, v. 296, n. 1, p , BERTAGNOLLI, A.C. Expressão de p63 e p53 em tumores mamários mistos de cadelas. Dissertação. Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria, CARIATI, M.; PURUSHOTHAM, A D. Stemcellsandbreastcancer. Histopathology, v. 52, n. 1, p , CARRUIDO, A. C. C.; SALAS Y.; ORLANDO, E.; MENDEZ, D. Incidencia de las neoplasias de glándula mamaria en caninos diagnosticadas por histopatología CASSALI, G.D. Estudo morfológico, imunohistoquímico e citométrico de tumores mamários da cadela: aspectos comparativos com neoplasias da mama humana [tese]. Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, CHUN, R., THAMM, D.H. Targeting angiogenesis and tumor vasculature. In: WITHROW, S.J.; MACEWEN, E.G. Withrow and MacEwen s small animal clinical oncology. 4.ed. Philadelfia: Saunders, Cap.14, section E, p DAIDONE, M. G.; PARADISO, A.; GION, M.; et al. Biomolecular features of clinical relevance in breast cancer.european journal of nuclear medicine and molecular imaging, v. 31 Suppl 1, n. June, p. S3-14, DEPES, D. B.; SOUZA, M.A.; RIBALTA, J.C.L.; ALVES, M.T.S.; KEMP, C.; LIMA, G.R. Alterações na expressão do antígeno nuclear de proliferação celular e dos receptores de estrogênio e de progesterona provocadas pela quimioterapia primária no 42

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