GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

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1 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PPG Biotecnologia Industrial Tese de Doutorado Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Priscila Brasil de Souza Cruz Lorena SP Brasil 2005

2 FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Industrial. Banca Examinadora: Dr. André Luis Ferraz DEBIQ/FAENQUIL Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres DEBIQ/FAENQUIL Dra. Maria Eleonora Andrade de Carvalho DEBIQ/FAENQUIL Dra. Elisa Esposito - UMC Dra. Manuela da Silva FIOCRUZ-RJ Estudante: Priscila Brasil de Souza Cruz Lorena - SP - Brasil 2005

3 FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Este exemplar corresponde à versão final da tese de doutorado aprovada pela banca examinadora. Dr. André Ferraz Orientador e Presidente da Banca Examinadora Lorena - SP - Brasil 2005

4 Ficha Catalográfica Elaborada pela Biblioteca Universitária da FAENQUIL Souza-Cruz, Priscila Brasil S89m Morfo-Fisiologia da Biodegradação de Madeiras por Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) / Priscila Brasil de Souza-Cruz.-- Lorena, f.: il. Tese (doutorado) - Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Biotecnologia. Orientador: André Ferraz. Co-Orientador: Clarice Loguercio- Leite 1. Biotecnologia 2. Biodegradação de madeira 3. Biopolpação 4. Phlebia tremellosa 5. Ceriporiopsis subvermispora 6. Pinus taeda 7. Eucalyptus grandis I. Ferraz, André, orientador. II. Título. CDU : 574.6

5 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeiras moles proposta por Adler 11 Figura 2 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeira dura proposta por K. Nimz 11 Figura 3 Vias de colonização da madeira 13 Figura 4 Ciclo catalítico simplificado de lignina peroxidase (LiP). S representa um substrato aromático não fenólico 17 Figura 5 Ciclo catalítico simplificado de peroxidase dependente de Manganês (MnP). PhOH representa um substrato fenólico 17 Figura 6 Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequeometria do ciclo envolve 4 Cu 2+ ( normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O 2 Figura 7 - Microscopia ótica mostrando o ataque progressivo (erosão) da parede celular de Picea abies por Heterobasidium annosum Note que a célula ao centro apresenta erosões irregulares na parede celular. A escala no canto 18 superior esquerdo da foto indica a magnitude do aumento Figura 8 - Microscopia eletrônica de transmissão mostrando o ataque não erosivo da parede celular de madeira. Notophagus dombeyi degradado por Ganoderma australe. Corte fixado com KMnO4 para contraste da lignina. (A) células intactas, (B) e (C) as setas indicam o avanço do ataque onde as áreas 19 de menor contraste estão livres de lignina. (D) células completamente livres de lamela média. Figura 9 Hifa com clamidosporos (a) intercalar e (b) apical de Ceriporiopsis subvermispora SS3. 28 Figura 10 Classificação visual da quantidade de clamidósporos em (a) muito (++++), (b) médio (+++), (c) pouco (++) e (d) pouquíssimo (+). 46 Figura 11 Perdas de massa de E. grandis após 15 dias de biodegradação por C. subvermispora SS Figura 12 Crescimento fúngico estimado a partir do teor de ergosterol detectado nas amostras de madeira biodegradada (P. taeda e E. grandis) por 50 C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 13 Produção de MnP por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do 52 período de incubação. Figura 14 Produção de lacase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do 55 período de incubação. Figura 15 Produção de endoglucanase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis 58 ao longo do período de incubação. Figura 16 Produção de xilanase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis 59 ao longo do período de incubação. Figura 17 ph do meio fermentado por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ATCC 48745, na biodegradação de P. taeda 61 e E. grandis ao longo do período de incubação. Figura 18 Perda de massa seca da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. 63 tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 19 Perda de glucana da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P

6 tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 20 Perda de polioses da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 21 Perda de lignina da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 22 Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após polpação kraft de alto rendimento. A polpação foi realizada em amostras de madeira P. taeda após biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa por 28 dias. Figura 23 Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após rampa de aquecimento de 30 minutos e determinados tempos de cozimento a temperatura máxima. A polpação foi realizada em amostras de madeira E.grandis após biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa por 28 dias. Figura 24 Rendimento de polpa não classificada em função do número kappa em polpas Kraft obtidas a partir da madeira de P. taeda biotratada durante 28 dias por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa. Figura 25 Hifas de C. subvermispora SS3 em células de (a) P. taeda - traqueídeos e (b) E. grandis elementos de vaso. Figura 26 Curva de crescimento de C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em meio líquido CB (Batata dextrose) tamponado com acetato de sódio 10 mm. Figura 27 Curva de crescimento de C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em meio líquido MS (Milhocina - sacarose). Figura 28 Microscopia óptica de fragmentos de hifas com clamidósporos, após o micélio cultivado para inóculo ser batido por 10 ciclos de 15 segundos

7 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição química das madeiras moles e duras 9 Tabela 2 - Atividade celulolítica total encontrada nos extratos obtidos a partir da biodegradação de P. taeda e E. grandis por C. subvermispora SS3, C. 57 subvermispora CS1 e P. tremellosa, ao longo do período de incubação. Tabela 3 - Taxa de crescimento dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa em meio de cultura ágar-batata- dextrose com diferentes valores 75 de ph inicial. Tabela 4 - Taxa de crescimento dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa em meio de cultura ágar-milhocina com diferentes valores de ph 75 inicial. Tabela 5 Quantidade de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C. subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo do crescimento em 79 meio de cultura líquido BD tamponado (ph 4) Tabela 6 Atividade enzimática de manganês peroxidase (MnP) encontrada nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo de C. subvermispora SS3 sobre P. 82 taeda e E. grandis, com os inóculos convencional e induzido para a produção de clamidósporos. 3

8 ABSTRACT Morpho-physiology of wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Sch rad.:fr.) Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomycetes). Priscila Brasil de Souza Cruz. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. André Luis Ferraz (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP116, , Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dra Clarice Loguercio- Leite (Departamento de botânica, UFSC, CP 476, CEP ). This work involves the study of enzymatic and morphological aspects related to the wood biodegradation by white rot fungi. Wood samples of Pinus taeda L. and Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden were inoculated with Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. (strains SS3 and CS1) and Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (strain ATCC 48745) in solid-state fermentation bioreactors for periods from 7 to 28 days. Enzymes of hydrolytic nature, such as total cellulases, endocelulases and xylanases, along with those of oxidative nature, such as lacase, peroxidase and cellobiose dehydrogenase, were studied in extracts recovered from the cultures. From the colonized wood chips, morphological aspects of the wood colonization were observed under optical microscopy. Biodegraded wood samples analysed for chemical composition and weight and component losses were determined. High-yield kraft pulping of biotreated wood samples was performed to evaluate the effect of different fungal preteatments on bio-kraft pulping. The growth ability of the fungi in low-cost culture media was evaluated aiming to increase growth rates. The capacity of these cultures to produce chlamydospores was also evaluated since these spores are suitable for storage and inoculation on a large scale. The two fungal species used in this study displayed extracellular metabolic activity. In the group of hydrolytic enzymes, xylanases were detected throughout the cultivation period, the maximum being observed after 14 days of biodegradation. In contrast, cellulase levels where very low. Most significant oxidative enzyme was MnP, which showed enzymatic activity in both fungal species, the maximal production being detected after 14 days in all culture conditions. LiP and CDH activities were not detected in any of the cultures evaluated, whilst lacase activity was detected only on initial stages of wood decay and in low quantities. Lignin losses were higher in E. grandis cultures than in P. taeda. The 3 fungal strains tested grew well in simple and low-cost media such as corn steep liquor-sucrose medium and produced chlamydospores without any induction, however osmotic shock was efficient to increase the contents of these spores. 4

9 RESUMO Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Sch rad.:fr.) Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomyce tes). Priscila Brasil de Souza Cruz. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. André Luis Ferraz (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP116, , Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dra Clarice Loguercio- Leite (Departamento de botânica, UFSC, CP 476, CEP ). Este trabalho se propôs a estudar aspectos enzimáticos e morfológicos envolvidos no processo de biodegradação de madeira por fungos causadores de podridão branca. As madeiras de Pinus taeda L. e Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden foram inoculadas com Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. (cepas SS3 e CS1) e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (cepa ATCC 48745) em biorreatores de fermentação sólida durante períodos que variaram de 7 a 28 dias. A partir dos extratos obtidos das culturas foram investigadas as enzimas de natureza hidrolítica como celulases, endocelulases e xilanases, bem como as de natureza oxidativa, como lacases, peroxidases e celobiose desidrogenase. A partir dos cavacos colonizados foram analisados aspectos morfológicos da colonização da madeira por microscopia óptica. As madeiras biodegradadas também foram analisadas quanto à perda de massa e de componentes. Observaram-se as modificações que essas cepas provocaram na madeira e quais as conseqüências destas sobre a biopolpação. A comparação do crescimento dessas cepas em meios de cultura de baixo custo foi realizada com o intuito de aumentar a velocidade de crescimento e baratear o custo de produção do micélio, tal comportamento foi avaliado através de curvas de crescimento. Paralelamente também foi avaliada a capacidade dessas culturas produzirem clamidósporos, como possibilidade de serem utilizados para a estocagem e inoculação em escala ampliada. As duas espécies utilizadas neste trabalho apresentaram atividade metabólica extracelular. Dentro do grupo das enzimas hidrolíticas a atividade enzimática de xilanase foi detectada em todos os períodos de cultivo, sendo que o máximo de atividade encontrava-se aos 14 dias de cultivo, ao contrário de celulase da qual não foi detectada atividade significativa. No complexo oxidativo a enzima de destaque foi a MnP, que apresentou atividade enzimática em ambas espécies sendo que o máximo foi detectado aos 14 dias em todas as condições de cultivo. As atividades enzimáticas de LiP e CDH não foram detectadas em nenhum dos cultivos testados, já a atividade de lacase foi baixa em todos as condições avaliadas. Quanto à perda de lignina observou-se que, de forma geral, nos cultivos no qual o substrato era E. grandis a perda foi mais extensa do que nos cultivos em P. taeda. Os fungos testados crescem bem em meio simples como milhocina-sacarose que tem um custo baixo e as duas espécies de fungos utilizadas neste trabalho são capazes de produzir clamidósporos sem qualquer indução, mas pode-se aumentar a quantidade de clamidósporos produzidos através de indução por choque osmótico. 5

10 1. INTRODUÇÃO O estudo da biodegradação de madeira apresenta grande importância acadêmica e tecnológica. Do ponto de vista acadêmico, estudar a processo biodegradativo significa contribuir com o entendimento do ciclo natural do carbono que tem início na biossíntese dos componentes da madeira a partir de CO 2 atmosférico e termina com a liberação do mesmo gás, após a mineralização desses componentes em decorrência da decomposição induzida por fungos degradadores de madeira. Do ponto de vista tecnológico, a biodegradação de madeira pode ser utilizada no processo de biopolpação. Este processo consiste em tratar a madeira sob condições controladas com fungos previamente selecionados e posteriormente submeter a madeira biotratada a processos convencionais de polpação destinados a produção de celulose e papel. A combinação de um pré-tratamento fúngico com a polpação mecânica permite reduzir em até 40% o consumo de energia elétrica durante o desfibramento/refinamento mecânico. Além disso, as biopolpas apresentam maior resistência mecânica do que as polpas convencionais. Este processo já vem sendo testado em escala ampliada (degradação de 50 toneladas de cavacos planta piloto na empresa Melhoramentos Ltda., Caieras - SP) e sua implementação industrial depende de otimizações oriundas dos estudos em escala piloto e do licenciamento da tecnologia (AKHTAR et al., 1998). No caso do prétratamento fúngico combinado com a polpação química, os resultados mais promissores indicam reduções expressivas na demanda de álcali ativo em processos de polpação kraft destinados à produção de polpas de alto rendimento, usualmente utilizadas na fabricação de papéis de recobrimento de caixas ou em papéis de embalagem (MENDONÇA et al., 2002). Apesar do processo de biopolpação já se encontrar em vias de 6

11 implementação industrial, pouco se sabe sobre os mecanismos químicos e bioquímicos que poderiam explicar os benefícios observados para o pré-tratamento da madeira com os fungos ligninolíticos. Os fungos estudados atualmente foram selecionados com base na habilidade de crescerem rapidamente, degradarem lignina seletivamente, reduzirem o consumo de energia durante a polpação mecânica e melhorarem a resistência das polpas produzidas a partir da madeira biotratada. Várias espécies têm sido selecionadas por diferentes pesquisadores de forma empírica, no entanto não se sabe exatamente o que difere as espécies avaliadas em termos de metabólitos extracelulares responsáveis pelas transformações que causam os benefícios da biopolpação. Não há, até o momento, estudos sistematizados que verifiquem os tipos de transformações, quais diferentes espécies e cepas de fungos as causam e quais as conseqüências dessas transformações sobre a eficiência da biopolpação. O presente trabalho contribuiu nesse sentido, ao abordar o modo de ação de três cepas de duas espécies de basidiomicetes agindo sobre a madeira de duas espécies arbóreas (Pinus taeda e Eucalyptus grandis). 7

12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA COMENTADA A biodegradação da madeira é um processo natural de reciclagem da matéria orgânica e ocorre em todos os ambientes naturais (terrestres e aquáticos) quando as condições ambientais são favoráveis. A madeira pode ser colonizada rapidamente por vários organismos, os quais através do processo de biodegradação solubilizam os componentes estruturais da madeira (polissacarídeos e lignina) inicialmente a moléculas simples e finalmente a CO 2 e água (DANIEL, 2003). Dentre os vários organismos que podem degradar a madeira, os basidiomicetes causadores de podridão branca despertam grande interesse uma vez que podem ser aplicados a processos biotecnológicos como no caso da biopolpação. Entender melhor os mecanismos biológicos responsáveis pela degradação da madeira e especialmente da lignina é um importante pré-requisito para o desenvolvimento e otimização dos processos de biopolpação (MESSNER, et al., 2003) Composição química e ultraestrutura da madeira A madeira é constituída por celulose, polioses, lignina, pequenas quantidades de extrativos e sais minerais, e apresenta-se como um material complexo que deve ser estudado considerando suas propriedades químicas e morfológicas. Em geral, as madeiras podem ser classificadas em duras "hardwood" ou moles "softwood". As madeiras duras são provenientes de árvores produtoras de folhas e frutos (angiospermas), como, por exemplo, eucalipto, ipê e peroba, já as madeiras moles são extraídas de árvores não produtoras de flores e frutos (gimnospermas), tais como, pinheiro e cipreste (FENGEL E WEGENER, 1989). As características anatômicas e microestruturais da madeira variam entre as diferentes espécies, sendo que as madeiras 8

13 moles tendem a ter uma estrutura mais simples quando comparadas às madeiras duras (DANIEL, 2003). As madeiras duras e moles diferem quanto à proporção de seus componentes, a estrutura química da lignina e das polioses, ao arranjo e tipos de células e quanto à susceptibilidade à biodegradação. Em termos ultraestruturais, as madeiras moles se caracterizam por apresentar de 90 a 95% de traqueídeos, 5 a 10% de células de raio e 0,5 a 1,0% de canais de resina. Outra característica importante das madeiras moles, quando se considera a produção do papel e celulose, é que elas possuem fibras mais longas que as madeiras duras. Essa característica confere boa qualidade aos papéis originados de madeiras moles, mesmo aqueles produzidos com processos mecânicos ou termomecânicos. Já as madeiras duras têm uma estrutura mais complexa que incluem, 36 a 70% de fibras, 20 a 55% de elementos de vaso, 6 a 20% de células de raios e 2% de células parenquimáticas (BIERMANN, 1996; DANIEL, 2003). A composição química das madeiras moles difere das madeiras duras quando comparadas às proporções dos seus diferentes componentes como demonstrado na tabela 1. Tabela 1 - Composição química das madeiras moles e duras (BIERMANN, 1996). Componentes Madeira dura (%) Madeira mole (%) Celulose Galactoglucomanana Xilana Lignina Extrativos A celulose é o principal polímero tanto em madeiras duras quanto em madeiras moles. Trata-se de um polímero linear de anidro-glicose ligado por ligações β-(1-4)-glicosídicas (FENGEL E WEGENER, 1989). 9

14 As polioses são uma classe de polímeros de açúcar incluindo as hexoses (glicose, manose, galactose e ácido metilglucurônico) e as pentoses (xilose e arabinose). As polioses apresentam-se na forma de polímeros ramificados de menor massa molar que a celulose e podem ser homopolímeros (exemplo: xilana, formada por xilose) que tipicamente ocorrem em madeiras duras ou heteropolímeros (exemplo: glucomanana, formada por glicose e manose), que predominam nas madeiras moles. As polioses de madeira mole são compostas por galactoglucomanana, glucomanana, arabinoglucuronoxilana e arabinogalactana e as de madeira dura por glucuronoxilana e glucomanana (HON e SHIRAISHI, 2001). A lignina é uma macromolécula complexa com estrutura tridimensional amorfa composta por unidades de fenilpropano (guaiacil, siringil e ρ-hidroxifenil). Os diferentes tipos de acoplamento entre os precursores dão origem a vários tipos de ligações entre as unidades fenilpropano como β-o-4 e α-o-4 (50-65%), β-1 (9-15%), β-5 (6-15%), 5-5 (2-9%) e β-β (2-5%). A estrutura da lignina é diferente entre os dois tipos de madeira, a lignina de madeiras moles é composta de 90% de unidades guaiacil e a lignina de madeiras duras é composta de quantidades aproximadamente iguais de siringil e guaiacil. A lignina tem um papel significante na proteção natural da madeira, pois grandes quantidades de lignina e a presença de lignina guaiacil promovem uma maior proteção natural do que baixos níveis de lignina e lignina siringil (DANIEL, 2003). Estruturas modelo para lignina de madeiras moles e duras são mostradas nas figuras 1 e 2 (FENGEL E WEGENER, 1989, BIERMANN, 1996). 10

15 H 3 C O C H 2OH H C = O H C H 3 C O H C 1 O β - O - 4 H 3 C O H 2 C O H C H H C O H 2 4 O H 3 C O H 2 C O H C H H C O H 5 6 γ H 2 C O H _ H C _ O β H C O H α H 2 C O H 16 H C O O C H H C O H 2 C H 15 H C O H H 3 C O H 2 C O H H C H C O H H 2 C O H O C H H 3 C O H C O H O C H 2 β H C O C H 3 H C O 13 O H O H O C 14 O O C H 3 O C H 3 H O 9 7 H O C H 2 H 3 C O H C O C = O O C H 3 H C O 3 H O C H 2 H C O 3 H C H C O H H C O 3 H 2 C O H β - 1 C H H C O H 8 O H 2 C O H H C O H C O H O H C C H 2 β - β H C C H H C O C H 2 O O H O - H - H O H 2 C C C = O 10 O C H 3 O C H 3 Figura 1 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeiras moles proposta por Adler (FENGEL e WEGENER, 1989). H 2 COH CH H H COH 2 COH 2 CH CH H C H 2 COH O CO CO HC CH CHO 2 OCH 3 HC CH CH H 2 COH H 2 COH O HC CH H C CH H 3 CO 0.4 OCH 3 H CO O 2 COH HC O H 3 CO OCH 3 HC OCH OCH H 2 COH H CO OCH 3 H 2 COH HC O OH H C O H H 3 CO 3 CO C O CH H 2 COH O CH H 2 COH H 2 COH O CH OCH 3 H C O CH O CH OCH H 3 2C COH OCH 3 COH HC O H OCH 3 CO OCH 3 H O 3 H 3 CO OCH 3 CHO O H 3 CO OCH 3 H 2 COH H 2 COH H 3 OC OCH 3 OCH 3 H 2 C CH OH H 2 COH O CH HC O O HC CH HC O CH CO HOCH 2 CH CO HC CH 2 O C H OCH 3 H 2 COH O CH 2 H 3 CO H 2 COH C O CH H 3 CO OCH 3 H 3 CO OCH O O CH CH HC O 3 OCH HOCH CH CHO 3 OH 2 CO H 2 COH OCH 3 H 3 CO H 2H COH H 2 COH O H C H C CH 3 CO HC O O CH 2H 2 HOCH HC C CH O CH 2 CH CHO HC CH 2 CH 2 H OCH H 3 CO OCH OCH 3 CO H OCH O OH 3 CO 3 OCH OH 3 nach Nimz, H O O 0.5 Angew. Chem. internat. Edit., 13, Figura 2 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeira dura proposta por K. Nimz (FENGEL e WEGENER, 1989). 11

16 Existe ainda uma fração menor da madeira, formada basicamente por compostos fenólicos e resinas, que comumente são chamados de extrativos (solúveis em solventes orgânicos e água) e compreendem cerca de 2 a 4% (HIGUCHI, 1985; FENGEL E WEGENER, 1989). É interessante ressaltar que todos os constituintes da madeira estão intimamente associados e/ou ligados quimicamente. A lignina forma um complexo com as polioses encapsulando a celulose, reduzindo a disponibilidade destes dois componentes na parede celular (READING et al., 2003). Na parede celular, a lignina está associada às polioses através de interações físicas e ligações covalentes. O fato de a lignina envolver as células funcionando como uma cola dificulta a biodegradação, protege a árvore contra o ataque de microrganismos e confere coesão à estrutura interna além de resistência ao esforço mecânico (FENGEL E WEGENER, 1989; HOFRICHTER, 2002; READING, et al., 2003) Biodegradação da madeira Embora a madeira possa ser atacada por vários organismos, no ecossistema terrestre os fungos são os principais decompositores. As enzimas extracelulares produzidas pelos fungos degradadores de madeira e o subseqüente processo de decomposição difere entre os vários grupos de fungos, resultando em diferentes tipos de degradação (AKHTAR, et al., 1997). Os fungos degradadores de madeira são agrupados em três categorias. Os fungos de podridão branda ou softrot (Ascomycetes e Deuteromycetes) causam a degradação da lignina e carboidratos, porém em velocidades muito baixas. Já os causadores de podridão castanha ou "brown-rot" (Basidiomycetes) degradam principalmente polissacarídeos. No caso dos de podridão branca ou "white-rot" (Ascomycetes Xylariales e Basidiomycetes) todos os componentes da madeira são degradados (HIGUCHI, 1985; FENGEL E 12

17 WEGENER, 1989; DEACON, 1997). Os fungos causadores de podridão branca são os mais eficientes degradadores de lignina, podendo degradá-la seletivamente ou simultaneamente. Os fungos que pertencem a este grupo são de grande interesse para a indústria de papel e celulose por sua capacidade de degradar lignina, embora muitos destes fungos também possam degradar celulose e polioses (BLANCHETTE, 1991; BLANCHETTE et al., 1992; KIRK E CULLEN, 1998; AKHTAR et al., 1998). Os fungos que degradam a lignina seletivamente podem ter diferentes aplicações biotecnológicas, tais como a deslignificação de materiais ligninocelulósicos (madeira, palha e outros resíduos agrícolas) para processos de biopolpação, o biobranqueamento de polpas, a biorremediação de poluentes aromáticos e a produção de ração animal (BLANCHETTE, 1994; AKHTAR et al., 1998; MESSNER et al., 2003). As primeiras vias de colonização da madeira por todos os tipos de fungos são usualmente as células dos raios que são vias anatômicas de mais fácil acesso e menor resistência (fig. 3). Através das células do raio as hifas têm acesso aos nutrientes de reserva não estruturais de fácil assimilação contidos nas células parenquimáticas (não lignificadas). A partir das células parenquimáticas do raio as hifas se espalham pelo lúmem das fibras e vasos e avançam através das pontoações ( pits ). hifas Figura 3 Vias de colonização da madeira pelas hifas. 13

18 Por meio da ação do complexo enzimático produzido por essas hifas dá-se o processo de decomposição da madeira (KIRK E CULLEN, 1998; MESSNER, et al., 2003; DANIEL, 2003). No entanto, a acessibilidade das enzimas na madeira, e nas fibras é limitado, devido a fatores como adsorção à superfície, baixa porosidade da fibra e pequeno tamanho dos poros das fibras. Além do que, a organização molecular e a associação dos diferentes componentes da parede celular da fibra (celulose, polioses e lignina) formam uma matriz impenetrável que também limita o acesso dos microorganismos e suas enzimas (KUHAD et al., 1997; DANIEL, 2003). Dessa forma, assume-se que o processo de biodegradação de um substrato lignocelulósico, como a madeira, ocorre pela ação combinada de uma variedade de sistemas enzimáticos e alguns agentes não enzimáticos de baixa massa molar como o ácido oxálico, álcool veratrílico, ácido antranílico, ácidos graxos insaturados e agentes redutores de ferro, que são produzidos extracelularmente pelos fungos. Através destes sistemas lignocelulolíticos, os fungos degradam os componentes insolúveis da madeira, transformando-os em componentes menores e solúveis, os quais podem ser incorporados ao seu metabolismo (FENGEL E WEGENER, 1989; TUOR, et al., 1995; SETHURAMAN et al., 1998; MESSNER et al., 2003). A biodegradação da celulose é um tópico bem elucidado do ponto de vista bioquímico. A degradação do polímero é feita pela ação das celulases (endo-1,4-β-glicanases, exo-1,4-β-glicanases e 1,4-βglicosidases). As enzimas atuam de forma cooperativa, causando a hidrólise completa da celulose até glicose (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990; EVANS et al., 1994). A biodegradação das polioses requer um conjunto de enzimas extracelulares mais complexo devido a sua estrutura de heteropolissacarídeo ramificado. As enzimas envolvidas na biodegradação das polioses são hidrolases específicas que clivam determinados tipos de ligações existentes no polímero. Assim, as xilanases rompem ligações 14

19 glicosídicas entre unidades de xilose; as mananases atuam sobre ligações glicosídicas entre moléculas de manose e as glucuronidases sobre ligações de ácidos urônicos com moléculas de açúcares. As hemicelulases são divididas em endo-hemicelulases, exo-hemicelulases e xilosidases e, como as celulases, atuam de forma cooperativa provocando a hidrólise completa das hemiceluloses até seus monomêros (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990). A biodegradação da lignina ainda não foi completamente elucidada devido a sua maior complexidade estrutural, mas supõe-se que um grupo amplo de enzimas esteja relacionado à sua biodegradação. No entanto, existem ainda hoje, controvérsias sobre a real participação de cada grupo de enzimas e a função que cada um deles exerce no processo global de oxidação que leva a lignina até dióxido de carbono e água. Essas enzimas podem ser agrupadas em pelo menos duas classes distintas, as fenoloxidases e as enzimas que produzem peróxido de hidrogênio (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990; BLANCHETTE, 1991; RUEL et al., 1994). As fenoloxidases podem ser divididas em dois subgrupos. Um contém as peroxidases, enzimas dependentes de peróxido, que estão envolvidas na biodegradação da lignina como: lignina peroxidase (LiP, EC ) e manganês peroxidase (MnP, EC ). O outro subgrupo contém as lacases (EC , benzenediol:oxigênio oxidoredutase) que são enzimas que não dependem de peróxido para atuarem (HAKALA, et al., 2005). Essas enzimas oxidativas são comumente produzidas por fungos de decomposição branca em diferentes combinações. Existem espécies fúngicas que são eficientes degradadoras de lignina e produzem somente um ou outro tipo de enzima. Cerca de 60% dos fungos causadores de podridão branca estudados até agora secretam MnP e lacase, como combinação mais comum (LI, 2003; HAKALA, et al., 2005). As enzimas que produzem peróxido de hidrogênio são acessórias às peroxidases, gerando peróxido de hidrogênio in situ e possibilitam que as peroxidases atuem (KIRK E CULLEN, 1998). 15

20 A ação dessas enzimas sobre a lignina leva a reações de oxidação que progressivamente decompõem a macromolécula até compostos de baixa massa molar que podem ser susceptíveis ao metabolismo intracelular do fungo. No caso da ação da LiP (fig. 4), a degradação de lignina ocorre através da formação inicial de um radical catiônico nos núcleos aromáticos. A formação do radical catiônico induz à ruptura de ligações, principalmente entre os carbonos α e β e a conseqüente degradação química (pela ação do oxigênio e da água) dos intermediários formados (HIGUCHI, 1985, 1990; FERRAZ E DURÁN, 1995; RODRIGUEZ et al., 1997, KIRK e CULLEN, 1998). Já nos casos da MnP e da lacase (fig. 5 e 6 respectivamente), sabe-se que as enzimas possuem baixo potencial de oxidação e podem abstrair elétrons somente de estruturas fenólicas, não atuando diretamente sobre anéis aromáticos cujos oxigênios da posição 4 estão eterificados (estruturas não fenólicas). Isso limitaria a ação dessas enzimas a uma pequena fração da lignina, já que a macromolécula apresenta somente cerca de 10% dos oxigênios da posição 4 na forma de estruturas fenólicas livres. Alguns resultados recentes (apresentados no item 2.4) mostram que, ao menos a MnP, pode atuar sobre estruturas não fenólicas mediada pela peroxidação de lipídeos insaturados. H 2 O C 0 H 2 O 2 C I S S S + S + C II Figura 4 Ciclo catalítico simplificado de lignina peroxidase (LiP). S representa um substrato aromático não fenólico (FERRAZ, 2004). 16

21 H 2 O C 0 H 2 O 2 C I Mn 3+ Mn 2+ ou Mn 3+ Mn 2+ PhOH PhO. C II Figura 5 Ciclo catalítico simplificado de peroxidase dependente de Manganês (MnP). PhOH representa um substrato fenólico (FERRAZ, 2004). O 2 Lacase (Cu 2+ ) PhO H 2 O Lacase red. (Cu 1+ ) PhOH Figura 6 Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequeometria do ciclo envolve 4 Cu 2+ (normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O 2 (FERRAZ, 2004). A celobiose desidrogenase (CDH) é uma enzima que faz parte do sistema enzimático extracelular dos fungos celulolíticos e degradadores de madeira, sistema no qual a CDH pode estar envolvida tanto na degradação de celulose como de lignina, apesar de ser uma enzima que oxida a celobiose e a manobiose que são respectivamente produtos da degradação de celulose e manana (HENRIKSSON, et al., 2000b; BAMINGER, et al., 1999). O exato papel biológico da CDH não está completamente entendido. Foi sugerido que esta enzima atua de diversas formas: (i) prevenindo a inibição por produto durante a degradação da celulose através da oxidação da celobiose; (ii) produzindo radicais hidroxila através da reação do tipo Fenton que pode ter um papel na degradação dos polissacarídeos e da lignina; (iii) inibindo a polimerização de radicais aromáticos produzidos pela LiP; e 17

22 (iv) disponibilizando manganês (MnII) para MnP através da redução de precipitados de óxido de manganês (MnO 2 ) (HILDÉN, et al., 2000). Esta enzima foi encontrada e purificada em vários basidiomicetes causadores de podridão branca como Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor (L.:Fr.) Pil., e em alguns outros fungos causadores de podridão mole e em bolores (HENRIKSSON, et al., 2000a). Outro aspecto importante a ser considerado na biodegradação de madeira é que apesar dos muitos estudos sobre as enzimas que estariam envolvidas na biodegradação, ainda não se consegue explicar muito bem como estas penetrariam na parede das células componentes da madeira. Desde o ponto de vista microscópico pode-se diferenciar dois modos principais de degradação da célula vegetal por fungos de decomposição branca. O primeiro envolve uma escamação progressiva da parede celular no sentido lúmen-lamela média, levando à diminuição progressiva da espessura da parede celular. Outro modo de degradação que tem sido observado em fungos seletivos para a degradação de lignina, envolve a remoção de lignina e polioses sem a simultânea erosão da parede celular vegetal. Nesses casos, a parede celular, apesar de degradada, mantém sua forma original (AGOSIN et al., 1990, BLANCHETTE et al., 1997, KIRK e CULLEN, 1998). Os mecanismos distintos de degradação envolvidos em cada caso têm sido objeto de muitos estudos e um aspecto a ser considerado é o modo de ação das enzimas extracelulares sobre o complexo lignocelulósico. Figura 7 - Microscopia ótica mostrando o ataque progressivo (erosão) da parede celular de Picea abies por Heterobasidium annosum Note que a célula ao centro apresenta erosões irregulares na parede celular. A escala no canto superior esquerdo da foto indica a magnitude do aumento (FERRAZ, 2004). 18

23 Figura 8 - Microscopia eletrônica de transmissão mostrando o ataque não erosivo da parede celular de madeira. Notophagus dombeyi degradado por Ganoderma australe. Corte fixado com KMnO 4 para contraste da lignina. (A) células intactas, (B) e (C) as setas indicam o avanço do ataque onde as áreas de menor contraste estão livres de lignina. (D) células completamente livres de lamela média (FERRAZ, 2004). Vários trabalhos têm demonstrado que enzimas lignocelulolíticas não penetram na parede celular intacta (GOODELL, et al., 1997; FLOUNOY et al., 1993; SREBOTNIK et al., 1988). Com isso, a degradação enzimática dos componentes da parede celular não poderia justificar o modelo de ataque não erosivo que descrevemos anteriormente. Ou seja, se as enzimas responsáveis pela decomposição dos componentes da madeira não podem penetrar na parede celular vegetal, somente um processo de escamação da parede celular pode ser efetivo na biodegradação. No entanto, para os fungos de decomposição branca que degradam lignina seletivamente, esse modelo não é adequado. Em trabalho bastante esclarecedor, BLANCHETTE et al. (1997) demonstraram que culturas de C. subvermispora (um dos fungos mais seletivos já descritos para a degradação de lignina) causam alterações estruturais significativas na lignina presente na parede celular e na lamela média, mesmo antes da parede celular vegetal ser permeável a proteínas do tamanho da insulina (5730 Da). Dessa forma, vários trabalhos têm proposto que alguns compostos de baixa massa molar poderiam atuar ao menos nos estágios iniciais de biodegradação da lignina (KAPICH et al, 2005). Estes compostos deveriam apresentar 19

24 atividade degradativa, mas teriam que ser suficientemente pequenos para penetrar no complexo celular vegetal, degradar os componentes aí existentes e com isso desestruturar a parede celular a ponto de permitir a penetração de enzimas oxidativas e hidrolíticas (EVANS et al, 1994) Basidiomicetes causadores de podridão branca com potencial para a biopolpação Na biopolpação, a madeira é pré-tratada pelo fungo e posteriormente submetida à polpação mecânica ou química. Os benefícios do pré-tratamento biológico incluem a redução de energia requerida para o desfibramento/refinamento da madeira (no caso de polpas mecânicas) e a redução da demanda por produtos químicos no caso das polpações químicas. Adicionalmente, as biopolpas usualmente possuem melhores qualidades mecânicas que os respectivos controles, o que permite a preparação de papéis de melhor qualidade (AKHTAR et al., 1998). Os fungos causadores de podridão branca que podem ser aplicados na biopolpação foram inicialmente selecionados com base na habilidade de crescerem rapidamente e degradarem lignina seletivamente. Esta seletividade é estimada com base em análises químicas do conteúdo de lignina e açúcares liberados pela hidrólise ácida da madeira biotratada (AKHTAR et al., 1997). Baseado neste tipo de seleção, várias espécies têm sido selecionadas por diferentes pesquisadores, entre elas estão Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv., Phanerochaete chrysosporium Burds., Phlebia brevispora (Nakas.), Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds., Phlebia subserialis (Bourd. & Galz.) Donk, Perenniporia medullapanis (Jacq.:Fr.) Donk, Dichomitus squalens (Karst.) Reid, Phellinus pini (Thore.:Fr.) A Ames, Phlebia radiata (Fr), Hyphodontia setulosa (Berkeley & M.A. Curtis) Maas Geesteranus, e Physisporinus rivulosus (Berk. & M.A. 20

25 Curtis) Ryvarden. Dentre as várias espécies de fungos estudadas C. subvermispora foi considerada como uma das mais apropriados para ser utilizada no processo de biopolpação, visto que degrada lignina seletivamente, reduz o consumo de energia durante o desfibramento e melhora a resistência do papel obtido a partir das biopolpas (AKHTAR et al., 1997 E 1998). Entretanto, essa seleção foi feita de forma empírica, uma vez que, não se sabe exatamente no que diferem as espécies indicadas, em termos de produção de metabólitos extracelulares responsáveis pelas transformações químicas que tornam industrialmente atrativo o processo de biopolpação. Tais basidiomicetes importantes para a indústria, considerando o número de espécies existentes na natureza, são estudados em número reduzidíssimo, apesar do óbvio potencial em aplicações biotecnológicas. Identificar e escolher as melhores espécies com tal finalidade, é um problema crítico, que demandará muito tempo e investimento em pesquisa. Através da taxonomia, que é a ciência que permite classificar os organismos, via filogenética, pode-se determinar graus de parentescos entre organismos, selecionando assim organismos parentes, que podem apresentar habilidades similares em produzir metabólitos úteis em processos biotecnológicos. Sabendo que uma espécie de um gênero apresenta características interessantes, como, por exemplo, produzir metabólitos secundários ou enzimas de interesse biotecnológico, poder-se-ia supor que outras espécies do gênero ou de gêneros próximos e relacionados também apresentariam as mesmas características. Desse modo, quando uma característica desejada é encontrada em uma espécie em particular, um procedimento recomendável para encontrar espécies com características similares é fazer uma seleção entre organismos de um mesmo gênero e/ou família (BURDSALL, 1998). Com base nesta hipótese foram selecionadas para o estudo aqui proposto duas cepas de Ceriporiopsis subvermispora (SS-3 e CS-1) e uma de Phlebia tremellosa que é considerada filogeneticamente próxima a Ceriporiopsis (BURDSALL, 1998). 21

26 Ceriporiopsis Dom. é um gênero poróide que pertence à família Coriolaceae ou Polyporaceae (BURDSALL, 1998). C. subvermispora é uma espécie rara, encontrada em regiões temperadas, distribui-se no sul do Canadá, no norte da América do Norte e na Europa Central (GILBERTSON E RYVARDEN, 1986). Na natureza, coloniza basicamente madeiras moles, i. e. gimnospermas (BLANCHETTE et al., 1992). Um consórcio formado por indústrias do setor de celulose e papel, a Universidade de Wisconsin e o USDA - Forest Products Laboratory em Madison, EUA desenvolveu vários estudos que culminaram na seleção de C. subvermispora (AKHTAR et al., 1998). Esta espécie se mostrou excelente para uso em biopolpação, principalmente por degradar a lignina seletivamente e por manter a celulose praticamente intacta, após curtos períodos de degradação (AKHTAR et al., 1998). Resultados, bastante animadores já foram reportados envolvendo a utilização de C. subvermispora no pré-tratamento de madeira anterior a processos mecânicos, termomecânicos (SETLIFF et al., 1992; AKHTAR et al., 1992, 1993; MESSNER E SREBOTNIK, 1994) e de polpação sulfito, organosolv, Kraft e sulfito/antraquinona (SCOTT et al., 1996, FERRAZ et al., 1998, MENDONÇA, et al., 2002, MENDONÇA et al., 2004). Por outro lado, Phlebia Fr. (emend Donk), um gênero da família Meruliaceae (KIRK et al., 2001), tem certas espécies poróides, sendo próximo a Phanerochaete Karsten segundo ERIKSSON e seus colaboradores (1981). Estudos moleculares, que consideram o gênero Phlebia na família Corticiaceae, o localizam dentro de um grupo denominado clado poliporóide, i. e., aparentado tanto a Ceriporiopsis, quanto a Phanerochaete (HIBBETT E THORN, 2001). Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. et Burds. tem sido citada como outra espécie promissora para biopolpação e pré-tratamento de resíduos agrícolas para produção de ração animal, uma vez que degrada lignina seletivamente (VARES et al.,1994). No entanto, existem poucos trabalhos na área de biopolpação com esta espécie e pouco se conhece sobre o seu perfil de produção de enzimas extracelulares. Alguns 22

27 autores caracterizam P. tremellosa como produtora de LiP e lacase (VARES et al., 1994; TUOR et al., 1995). No entanto, HATAKKA (1994) afirma que esta espécie produz todas as enzimas ligninolíticas (LiP, MnP e lacase), o que demonstra que são necessários mais trabalhos para avaliar completamente esta espécie Mecanismo de ação sobre a lignina Apesar da crescente importância de C. subvermispora na aplicação industrial, o sistema enzimático extracelular deste fungo ainda não está completamente esclarecido. Um grande problema a ser elucidado é o diferente comportamento do sistema enzimático frente a cada tipo de substrato. Muitas publicações têm mostrado que o crescimento fúngico em substrato sólido é diferente quando comparado ao meio líquido, e conseqüentemente, os padrões de produção das enzimas e das isoenzimas são diferentes (MACHUCA e FERRAZ, 2001; VICUÑA et al., 1996; URZÚA et al., 1995). SETHURAMAN et al. (1998) acrescentam, ainda, que o padrão de produção das enzimas é extremamente dependente da fonte de carbono utilizada. C. subvermispora degrada lignina de um substrato ligninocelulósico através da ação de manganês peroxidase e lacase. A não produção da lignina peroxidases (LiP) seria crítica, pois essas enzimas apresentam a habilidade de atacar estruturas não fenólicas da lignina (RUTTIMANN-JOHNSON,1993, ENOKI et al., 1999, CÓRDOVA, 1999). No entanto, vários estudos revelaram ser eficiente a degradação de lignina por C. subvermispora mesmo sem a produção de LiP (RUTTIMANN-JOHNSON, 1993; SETHURAMAN, 1998). A produção de LiP não tem sido detectada em cultivos desse fungo mesmo em diversos meios e formas de cultivo (LOBOS et al., 1994). Um fato intrigante nesse aspecto é a não detecção de lacases em condições de cultivo onde o único substrato orgânico é o próprio composto lignocelulósico 23

28 (FERRAZ et al., 2002, SOUZA-CRUZ, 2002). Com isso, a degradação de lignina por esse fungo deveria, a princípio, ser atribuída principalmente a ação de MnP. Outro dado intrigante no modo de ação desse organismo é o fato de que a degradação de lignina ocorre notoriamente em pontos distantes da hifa fúngica, ou seja, o modelo erosivo de degradação da parece celular vegetal não se aplica. Em uma série de trabalhos esclarecedores JENSEN et al.(1996); SREBOTNIK et al. (1997) e KAPICH et al. (1999) demonstraram que o mecanismo químico envolvido na decomposição de lignina por C. subvermispora deve enquadrar-se necessariamente em um modelo onde um elétron é retirado diretamente de estruturas não fenólicas. Ou seja, a retirada do elétron é induzida por uma espécie ativa com elevado potencial de oxidação. Isso tem sido demonstrado pela verificação dos produtos de degradação de um composto modelo de lignina, marcado com carbono 14, ligado a uma cadeia polimérica de polietilenoglicol (PEG). Nesses estudos propõe-se que a degradação estaria relacionada com a peroxidação de lipídeos iniciada por Mn 3+ oriundo da ação de MnP. Essa hipótese poderia, inclusive, explicar a degradação da lignina no interior da parede celular da madeira através de um processo não erosivo, uma vez que este é baseado na ação de um mediador de baixa massa molar. Recentemente, KAPICH et al. (1999) demonstraram que os radicais peroxila oriundos da peroxidação de ácido linoléico por MnP de C. subvermispora podem atuar em modelos de lignina não fenólicos, abstraindo um elétron (e um próton) do carbono alfa, levando a posterior degradação de um composto modelo de lignina Aspectos fisiológicos e morfológicos que interferem no crescimento e na competição dos fungos pelo substrato Quando falamos em fungos, uma exata definição de crescimento 24

29 depende do método utilizado em sua determinação. A maioria dos métodos determina, diretamente ou indiretamente, o aumento em massa de um inóculo após um conhecido tempo de incubação em um meio de cultura completo. O aumento em massa ou o número de células pode dessa forma ser usado como uma definição funcional de crescimento. Em trabalhos experimentais utilizam-se meios sólidos em placas de Petri e/ou meios líquidos, em culturas agitadas ou estáticas (GRIFFIN, 1994). Um meio de cultura completo para o crescimento do fungo deve ter além de água, substâncias orgânicas apropriadas como fonte de carbono (ex. glicose), fonte de nitrogênio (ex. aminoácidos), certos íons inorgânicos (ex. K +, SO 2-4, PO 3-4, íons metálicos) em quantidades necessárias, e certos fatores orgânicos de crescimento (ex. vitaminas) em concentrações baixas. Além da composição do meio, um outro fator que afeta extensamente o desenvolvimento dos fungos na cultura é o ph. A investigação da relação entre ph e crescimento apresenta dificuldades. O problema é que o ph não varia sem alterar outras características do meio de cultura e raramente se mantém constante durante o crescimento, mesmo se o meio de cultura for tamponado (INGOLD E HUDSON, 1993). Há uma lacuna na informação sobre o efeito do ph nos parâmetros de crescimento do fungo, já que suas atividades metabólicas alteram o ph, aumentando-o através da absorção de ânions ou produção de amônia a partir de compostos nitrogenados; ou reduzindo-o pela formação de ácidos orgânicos ou absorção de cátions. Um tampão efetivo é difícil de ser utilizado em cultura, já que estes podem ser assimilados pelo fungo ou serem tóxicos em quantidades necessárias para uma tamponação eficiente. A concentração de íons hidrogênio pode afetar o crescimento tanto indiretamente pelo efeito na disponibilidade de nutrientes como diretamente pela ação nas superfícies celulares e sobre a permeabilidade da membrana. Quando os nutrientes requeridos são satisfatórios, a maioria dos fungos cresce bem sobre uma larga faixa de ph entre 4 e 7. Alguns fungos que produzem ácidos orgânicos são 25

30 capazes de tolerar condições consideravelmente mais ácidas (CARLILE E WATKINSON, 1996). Os sapróbios pertencentes à classe Basidiomycetes são morfologicamente e bioquimicamente adaptados a viver sobre substratos lignocelulósicos. Uma hipótese de sucessão na madeira iniciaria com os mitospóricos comuns (mofos) e com os de tingimento ( staining fungi ), continuando com os causadores de podridão mole e culminaria com a penetração de micélio dos basidiomicetes causadores de podridão parda e/ou branca (RAYNER & TODD, 1982). A colonização de um determinado substrato por uma espécie de fungo depende em parte pela habilidade competitiva saprofítica intrínseca e em parte pelo balanço entre o potencial do próprio inóculo e as espécies competidoras. A habilidade competitiva do fungo é determinada pela velocidade de germinação dos esporos e a taxa de crescimento da hifa jovem na presença de nutrientes solúveis do substrato; na habilidade de produzir enzimas necessárias a decomposição de componentes solúveis e insolúveis da madeira; na capacidade de lançar substâncias antibióticas capazes de inibir o crescimento de outro fungo e bactéria; e na habilidade de tolerar substâncias fungistáticas lançadas pelos outros organismos. Conhecendo a habilidade competitiva sapróbia do fungo no substrato é importante ainda considerar a energia para o crescimento que cada fungo tem quando começa a colonização, isto é chamado potencial de inóculo. Este depende do nível da população de um fungo contaminante (número de esporos e unidades de hifa), idade, presença de nutrientes no substrato e das condições ambientais (EATON E HALE, 1993). Os basidiomicetes, especialmente aqueles que utilizam a madeira como substrato tem um comportamento conhecido por ocupar um nicho economicamente e por muito tempo, ou seja, mantém uma população constante por longos períodos em equilíbrio com seu ambiente, a fim de não esgotar o substrato. Este tipo de comportamento faz com que métodos de competição antagonísticos sejam melhores para repelir uma 26