Enzimas em conversão de biomassa

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1 Enzimas em conversão de biomassa Conteúdo: 1. Biodegradação de biomassa lignificada em ambientes naturais: organismos envolvidos, aspectos macroscópicos e microscópicos da degradação, secreção de enzimas e outros metabólitos, mecanismos de ação das enzimas oxidativas e hidrolíticas. 2. Produção de enzimas de origem microbiana envolvidas na degradação de biomassa lignificada: cinética do crescimento e produção de metabólitos. 3. Controle sobre a síntese enzimática indução e repressão. 4. Celulases, hemicelulases e oxidorredutases: estrutura, função e aplicação. 5. Organismos degradadores de biomassa amilácea, oleaginosa e protéica 6. Produção de enzimas envolvidas na degradação de amido, lipídeos e proteínas. 7. Controle sobre a síntese enzimática indução e repressão. 8. Lipases e proteases: estrutura, função e aplicação. Forma de Avaliação: O estudante será avaliado: (i) por duas provas escritas; (ii) por sua participação durante as aulas da disciplina

2 Enzimas em conversão de biomassa Porque esta foto pode servir para abrir a disciplina sobre enzimas em conversão de biomassa?

3 Enzimas em conversão de biomassa Qual é a composição de um galho de árvore?? Qual é o alimento deste fungo?? Qual seria a forma de absorção dos nutrientes por esse fungo?? Este fungo requer enzimas EXTRACELULARES para a conversão de biomassa...

4 Enzimas em conversão de biomassa O que difere esta foto da foto anterior?

5 Enzimas em conversão de biomassa 2014 Colonização intensa por um fungo verde O substrato parece ter sido "pré-tratado" O substrato colonizado corresponde a uma biomassa de "acesso" facilitado

6 % da massa de celulose inicial dias Comparativo de eficiências para a metabolização de celulose Ascomiceto Trichoderma reesei Trametes versicolor (WR) Irpex lacteus(wr) Gleophyllum trabeum (BR) Enoki et al, Holzforschung 42(1988) Tempo de biodegradação (semanas) Basidiomicetos de decomposição branca e parda semanas

7 Biodegradação de biomassa lignificada em ambientes naturais: organismos envolvidos, aspectos macroscópicos e microscópicos da degradação Referências básicas: Nilsson T Biological Wood degradation. In: Pulp and Paper Chemistry and Technology Volume 1, Wood Chemistry and Wood Biotechnology Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson cap. 10, pp LEVY JF The natural-history of the degradation of wood. Philosophical transactions of the royal society of London - series a-mathematical physical and engineering sciences 321: :1987

8 A biodegradação da madeira, e dos lignocelulósicos em geral, constitui um importante ciclo do carbono na natureza

9 Pode ser indesejável nos casos onde se usa a madeira com função estrutural: construção civil; cercas e postes em áreas rurais; embarcações de madeira.

10 Biodegradação da madeira em ambientes naturais 1. Alguns insetos se alimentam de fragmentos de madeira que são posteriormente decompostos por fungos e bactérias. Perfuradores marinhos usualmente utilizam a madeira como local de refúgio e não como alimento (ambos não serão abordados nesse tópico) 2. Para os fungos degradadores, a madeira se parece com uma série de cavidades convenientemente orientadas rodeadas por alimento. 3. O nível de umidade é crítico. - deve ser elevado o suficiente para a difusão de enzimas e outros metabólitos - não deve ser elevado em demasia para evitar a formação de ambientes anaeróbios - não deve ser baixo em demasia para evitar que fique abaixo do limite que permite a sobrevivência dos microrganismos

11 Biodegradação da madeira em ambientes naturais 1. Baixas concentrações de Nitrogênio nos lignocelulósicos representam uma condição limitante para a maioria dos microrganismos 2. Um lignocelulósico quando em contato com o solo em um ambiente natural é atacado por uma série de grupos de microrganismos que se sucedem ao longo de todo o processo biodegradativo a) bactérias b) bolores primários c) fungos de tingimento d) fungos de decomposição branda e) fungos degradadores de madeira (decomposição parda e decomposição branca) f) bolores secundários Estude e responda: do que cada grupo é capaz de se alimentar The natural-history of the degradation of wood (LEVY JF). Philosophical transactions of the royal society of London series a-mathematical physical and engineering sciences 321: , 1987

12 Organismos envolvidos na biodegradação da madeira fungos de decomposição branca white-rot fungi degradam todos os componentes da madeira fungos de decomposição parda brown-rot fungi degradam principalmente polissacarídeos fungos de decomposição branda soft-rot fungi Degradam lignina e polissacarídeos, porém em velocidades muito baixas

13 Componente (% do inicial) Componente (% do inicial) Componente (% do inicial) Balanço de massas dos componentes durante a biodegradação da madeira - Decomposição de Eucalyptus grandis 100 A 100 B Massa do lignocelulósico (% do inicial) Parda: Wolfiporia cocos Massa do lignocelulósico (% do inicial) Branca, não seletivo: Trametes versicolor 100 C Massa do lignocelulósico (% do inicial) Branca, seletivo: Ceriporiopsis subvermispora Símbolos: Quadrado = glucana triângulo = polioses Círculo = lignina

14 Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico - As hifas do fungo penetram pelo lúmen

15 Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico Três tipos de ataque da parede celular 1. escamação no sentido lúmemlamela média, levando à diminuição progressiva e irregular da espessura da parede celular. 2. Remoção de lignina e polioses sem a simultânea erosão da parede celular vegetal (tem sido observado em fungos seletivos para a degradação de lignina). 3. Formação de microcavidades na parede secundária, causada por fungos de decomposição branda

16 Enzimas envolvidas no processo degradativo O processo é extracelular

17 Degradação da celulose (ação das Celulases, modelo clássico) Endo-glucanase Exo-glucanase CELULOSE beta-glucosidase OLIGÔMEROS CELOBIOSE Sinergismo na ação das celulases Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a hidrólise completa de celulose de algodão. Enzima Atividade relativa das celulases Endo-glucanase < 1% Exo-glucanase < 1% ß-glucosidase Nenhuma Endo-glucanase + ß-glucosidase 5% Exo-glucanase + ß-glucosidase 4% Endo-glucanase + Exo-glucanase 103% + ß-glucosidase Caldo de cultura original 100% GLICOSE

18 Degradação das hemiceluloses (ação das xilanases e enzimas acessórias)

19 Degradação das hemiceluloses (ação das mananases e enzimas acessórias)

20 Degradação das hemiceluloses (ação de feruloil esterases) Éster passível de hidrólise enzimática

21 Enzimas envolvidas na degradação de lignina a) Fenoloxidases b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio Enzimas oxidativas (peroxidases) C 0 H 2 O H 2 O H 2 O 2 H 2 O 2 C I C 0 C I S S Mn 3+ Mn 2+ ou S + C II S + Mn 3+ Mn 2+ PhOH PhO. C II LiP MnP

22 Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP) Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.

23 Enzimas oxidativas (lacases) O 2 Lacase (Cu 2+ ) PhO H 2 O Lacase red. (Cu 1+ ) PhOH

24 Enzimas que produzem peróxido (são acessórias às peroxidases) glicose oxidase (intracelular) glioxal oxidase (extracelular) aril-álcool oxidase (extracelular)

25 Enzimas que produzem peróxido Também MnP pode gerar H 2 O 2 a partir da oxidação de ácidos orgânicos como o malônico e oxálico. HO-(C=O)-(C=O)-OH Mn 3+ Mn 2+ O=C=O + H + + HO-C. =O O=O H-O-O. + CO 2 Doador de H H 2 O 2

26 Enzimas com descrição recente: LPMOs Oxidação intracadeia e clivagem da celulose e também hemiceluloses

27 Celobiose desidrogenase (CDH) - Atua sobre celobiose, oligômeros de glicose e mesmo celulose, oxidando o terminal redutor - Utiliza quinonas, Fe 3+ ou O 2 como aceptor de elétrons - Pode gerar radicais hidroxila, indiretamente, via reação de Fenton

28 Degradação de celulose (modelos contemporâneos) - AA9 (anteriormente denominadas com GH61 e LPMOs (lytic polysaccharide monoxigenases)

29 Complexidade dos sistemas enzimáticos revelados com os estudos recentes de proteômica - Exemplos G. trabeum em madeira P. chrysosporium em madeira

30 Bao D, Gong M, Zheng H, Chen M, Zhang L, et al. (2013) Sequencing and Comparative Analysis of the Straw Mushroom (Volvariella volvacea) Genome. PLoS ONE 8(3): e doi: /journal.pone Table S12. The number of genes encoding the lignin oxidative enzymes in V. volvacea and other basidiomycetes species lignin peroxidase manganese-dependent peroxidase laccases versatile peroxidase V. volvacea C. cinerea A. bisporus S. commune P. chrysosporium P. placenta S. lacrymans

31 - Limitação da parede celular lignificada à infiltração das enzimas (teorias emergentes sobre o processo degradativo) A parede celular vegetal não é "porosa" o suficiente para permitir a penetração das enzimas. Desse fato surge a dúvida de como alguns fungos poderiam atacar a parede celular de forma não erosiva Erosiva versus não erosiva

32 Esse tópico carece de teorias bem estabelecidas e comprovadas. No entanto, vários artigos tomados em conjunto permitem compilar informações que indicam claramente a importância de compostos de baixa massa molar como intermediários do processo degradativo: Um dos artigos mostrou de forma inequívoca que a degradação de lignina na parede celular tem início mesmo antes de ser porosa às enzimas Blanchette RA, Krueger EW, Haight JE, Akhtar M, Akin DE. Cell wall alterations in loblolly pine wood decayed by the white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora. J. BIOTECHNOL. 53: , 1997

33 Remoção de lignina evidenciada por TEM com contraste para lignina Madeira não tratada Tratada por 2 semanas Tratada por 4 semanas Infiltração de Ovoalbumina contendo partículas de ouro, após 8 semanas de biodegradação Amostra insulina 5,7 kda mioglobina 17,6 kda ovoalbumina 44,3 kda não trat não infiltra não infiltra não infiltra 2 semanas infiltra início da S2 não infiltra não infiltra 4 semanas infiltra começa a infiltrar não infiltra 8 semanas infiltra infiltra começa a infiltrar

34 MnP/Mn-ácido oxálico MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados - Enoki M, Watanabe T, Nakagame S, Koller K, Messner K, Honda Y, Kuwahara M. Extracellular lipid peroxidation of selective white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora. FEMS MICROBIOL LETT 180: , Kapich AN, Jensen KA, Hammel KE. Peroxyl radicals are potential agents of lignin biodegradation. FEBS LETT 461: , Kapich AN, Stefen KT, Hofrichter M, Hataka A. Involvement of lipid peroxidation in the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla. BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMM. 330: , 2005.

35 MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados COOH.. O O O O 2 Mn 3+ ou. OH COOH Abstração de H de um doador OH COOH COOH Degradação de um modelo não fenólico por radicais peroxila Mn 2+ ou H 2 O HO. O OH COOH OCH 3 OC 2 H 5 OH. O + OCH 3 OC 2 H 5 (etapa de iniciação) OCH 3 COOH. (etapa de propagação) B HO HO Peroxidação de ácidos graxos iniciada por Mn 3+ ou OH radical OH O COOH OCH 3 OCH 3 OC 2 H 5. ROO. O ROOH OH OCH 3 OC 2 H 5 OCH 3 A HO. OO O OCH 3 OC 2 H 5 HOO. OH O OH O O 2 OCH 3 OC 2 H 5 OCH 3 OCH 3

36 Degradação in vitro de lignina contida em um material lignocelulósico pelo sistema MnP/ácido linoleico G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and Microbial Technology 46 (2010)

37 Sistema lacase/mediador Origem : sistemas in vitro desenhados para degradação de lignina durante o biobranqueamento de polpas celulósicas BOURBONNAIS, R., PAICE, M. G., FREIERMUTH, B., BODIE, E. & BORNEMAN, S. (1997) Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds. Appl Environ Microbiol 63: SREBOTNIK E, HAMMEL KE (2000) Degradation of nonphenolic lignin by the laccase:1-hydroxybenzotriazole system. Journal of Biotechnology 81:

38 Mediadores naturais de lacase Li K, Horanyi PS, Collins R, Phillips RS, Eriksson K-EL. Investigation of the role of 3-hydroxyanthranilic acid in the degradation of lignin by white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 28: , 2001.

39 Fungos de decomposição parda e a reação de Fenton Goodell, B. Brown-rot fungal degradation of wood: our evolving view. In: Wood deterioration and preservation advances in our changing world. ACS Symp. Ser. 845, p , Hammel KE, Kapich AN, Jensen KA, Ryan ZC. Reactive oxigen species as agents of wood decay by fungi. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 30: , Reação de Fenton H 2 O 2 + Fe 2+ + H H 2 O + Fe OH Fe 2+ pode ser gerado pela ação de Celobiose desidrogenase ou por ação de hidroquinonas produzidas pelos fungos de decomposição parda