Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico -recaptulando. - As hifas do fungo penetram pelo lúmen

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1 Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico -recaptulando - As hifas do fungo penetram pelo lúmen

2 Biodegradação da madeira do ponto de vista microscópico Três tipos de ataque da parede celular 1. escamação no sentido lúmemlamela média, levando à diminuição progressiva e irregular da espessura da parede celular. 2. Remoção de lignina e polioses sem a simultânea erosão da parede celular vegetal (tem sido observado em fungos seletivos para a degradação de lignina). 3. Formação de microcavidades na parede secundária, causada por fungos de decomposição branda

3 Enzimas envolvidas no processo degradativo O processo é extracelular Endo-glucanase CELULOSE Degradação da celulose (ação das Celulases) GLICOSE Exo-glucanase beta-glucosidase OLIGÔMEROS CELOBIOSE Sinergismo na ação das celulases Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a hidrólise completa de celulose de algodão. Enzima Atividade relativa das celulases Endo-glucanase < 1% Exo-glucanase < 1% ß-glucosidase Nenhuma Endo-glucanase + ß-glucosidase 5% Exo-glucanase + ß-glucosidase 4% Endo-glucanase + Exo-glucanase 103% + ß-glucosidase Caldo de cultura original 100%

4 Celobiose desidrogenase (CDH) - Atua sobre celobiose, oligômeros de glicose e mesmo celulose, oxidando o terminal redutor - Utiliza quinonas, Fe 3+ ou O 2 como aceptor de elétrons - Pode gerar radicais hidroxila, indiretamente, via reação de Fenton

5 Participação de proteínas que desestruturam a celulose - AA9 (anteriormente denominadas com GH61 e LPMOs (lytic polysaccharide monoxigenases)

6 Degradação das hemiceluloses (ação das Hemicelulases)

7 Degradação das hemiceluloses (ação das Hemicelulases)

8 Enzimas envolvidas na degradação de lignina a) Fenoloxidases b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio Enzimas oxidativas (peroxidases) C 0 H 2 O H 2 O H 2 O 2 H 2 O 2 C I C 0 C I S S Mn 3+ Mn 2+ ou S + C II S + Mn 3+ Mn 2+ PhOH PhO. C II LiP MnP

9 Enzimas oxidativas (lacases) O 2 Lacase (Cu 2+ ) PhO H 2 O Lacase red. (Cu 1+ ) PhOH

10 Enzimas que produzem peróxido (são acessórias às peroxidases) glicose oxidase (intracelular) glioxal oxidase (extracelular) aril-álcool oxidase (extracelular)

11 Enzimas que produzem peróxido Também MnP pode gerar H 2 O 2 a partir da oxidação de ácidos orgânicos como o malônico e oxálico. HO-(C=O)-(C=O)-OH Mn 3+ Mn 2+ O=C=O + H + + HO-C. =O O=O H-O-O. + CO 2 Doador de H H 2 O 2

12 Proteínas extracelulares estudos atuais de proteômica G. trabeum em madeira P. chrysosporium em madeira

13 Bao D, Gong M, Zheng H, Chen M, Zhang L, et al. (2013) Sequencing and Comparative Analysis of the Straw Mushroom (Volvariella volvacea) Genome. PLoS ONE 8(3): e doi: /journal.pone Table S12. The number of genes encoding the lignin oxidative enzymes in V. volvacea and other basidiomycetes species lignin peroxidase manganese-dependent peroxidase laccases versatile peroxidase V. volvacea C. cinerea A. bisporus S. commune P. chrysosporium P. placenta S. lacrymans

14 A biodegradação de lignina depende de um processo de despolimerização que de origem a compostos de baixa massa molar susceptíveis ao metabolismo intracelular dos fungos Os três modos principais de degradação da lignina são: a) Ruptura oxidativa de cadeias laterais envolvendo os carbonos e ß, levando à formação de ácidos carboxílicos b) Ruptura de ligações ß-aril-éter e consequente modificação das cadeias laterais c) Degradação de núcleos aromáticos através da abertura oxidativa dos anéis 14

15 - Limitação da parede celular lignificada à infiltração das enzimas (teorias emergentes sobre o processo degradativo) A parede celular vegetal não é "porosa" o suficiente para permitir a penetração das enzimas. Desse fato surge a dúvida de como alguns fungos poderiam atacar a parede celular de forma não erosiva Erosiva versus não erosiva

16 Esse tópico carece de teorias bem estabelecidas e comprovadas. No entanto, vários artigos tomados em conjunto permitem compilar informações que indicam claramente a importância de compostos de baixa massa molar como intermediários do processo degradativo: Um dos artigos mostrou de forma inequívoca que a degradação de lignina na parede celular tem início mesmo antes de ser porosa às enzimas Blanchette RA, Krueger EW, Haight JE, Akhtar M, Akin DE. Cell wall alterations in loblolly pine wood decayed by the white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora. J. BIOTECHNOL. 53: , 1997

17 Remoção de lignina evidenciada por TEM com contraste para lignina Madeira não tratada Tratada por 2 semanas Tratada por 4 semanas Infiltração de Ovoalbumina contendo partículas de ouro, após 8 semanas de biodegradação Amostra insulina 5,7 kda mioglobina 17,6 kda ovoalbumina 44,3 kda não trat não infiltra não infiltra não infiltra 2 semanas infiltra início da S2 não infiltra não infiltra 4 semanas infiltra começa a infiltrar não infiltra 8 semanas infiltra infiltra começa a infiltrar

18 Prováveis mediadores redox Álcool veratrílico / LiP

19 MnP/Mn-ácido oxálico MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados - Enoki M, Watanabe T, Nakagame S, Koller K, Messner K, Honda Y, Kuwahara M. Extracellular lipid peroxidation of selective white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora. FEMS MICROBIOL LETT 180: , Kapich AN, Jensen KA, Hammel KE. Peroxyl radicals are potential agents of lignin biodegradation. FEBS LETT 461: , Kapich AN, Stefen KT, Hofrichter M, Hataka A. Involvement of lipid peroxidation in the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla. BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMM. 330: , 2005.

20 MnP/Mn-ácido oxálico/ácidos graxos insaturados COOH.. O O O O 2 Mn 3+ ou. OH COOH Abstração de H de um doador OH COOH COOH Degradação de um modelo não fenólico por radicais peroxila Mn 2+ ou H 2 O HO. O OH COOH OCH 3 OC 2 H 5 OH. O + OCH 3 OC 2 H 5 (etapa de iniciação) OCH 3 COOH. (etapa de propagação) B HO HO Peroxidação de ácidos graxos iniciada por Mn 3+ ou OH radical OH O COOH OCH 3 OCH 3 OC 2 H 5. ROO. O ROOH OH OCH 3 OC 2 H 5 OCH 3 A HO. OO O OCH 3 OC 2 H 5 HOO. OH O OH O O 2 OCH 3 OC 2 H 5 OCH 3 OCH 3

21 Degradação in vitro de lignina contida em um material lignocelulósico pelo sistema MnP/ácido linoleico G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and Microbial Technology 46 (2010)

22 Sistema lacase/mediador Origem : sistemas in vitro desenhados para degradação de lignina durante o biobranqueamento de polpas celulósicas BOURBONNAIS, R., PAICE, M. G., FREIERMUTH, B., BODIE, E. & BORNEMAN, S. (1997) Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds. Appl Environ Microbiol 63: SREBOTNIK E, HAMMEL KE (2000) Degradation of nonphenolic lignin by the laccase:1-hydroxybenzotriazole system. Journal of Biotechnology 81:

23 Mediadores naturais de lacase Li K, Horanyi PS, Collins R, Phillips RS, Eriksson K-EL. Investigation of the role of 3-hydroxyanthranilic acid in the degradation of lignin by white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 28: , 2001.

24 Fungos de decomposição parda e a reação de Fenton Goodell, B. Brown-rot fungal degradation of wood: our evolving view. In: Wood deterioration and preservation advances in our changing world. ACS Symp. Ser. 845, p , Hammel KE, Kapich AN, Jensen KA, Ryan ZC. Reactive oxigen species as agents of wood decay by fungi. ENZYME MICROBIAL TECHNOL. 30: , Reação de Fenton H 2 O 2 + Fe 2+ + H H 2 O + Fe OH Fe 2+ pode ser gerado pela ação de Celobiose desidrogenase ou por ação de hidroquinonas produzidas pelos fungos de decomposição parda

25 Degradação de celulose por OH radical

26 Ação OH radical sobre lignina

27 Síntese da aula sobre biodegradação da madeira - Entender o processo de biodegradação da madeira pode permitir a manipulação do processo - Fungos de decomposição branca, parda e branda são os principais organismos degradadores em ambientes naturais - O processo é extracelular e depende de enzimas hidrolíticas e oxidativas - Os fungos requerem compostos de baixa massa molar que atuam como mediadores do processo