Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas diabéticas

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1 Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas diabéticas Maysa de Souza Campos 1, Ariane Zamarioli 1, Patrícia Sena Pinheiro 1, Ana Paula Franttini 1, Mariana Maloste Butezloff 1, Larissa Azevedo 1, José Batista Volpon 1 1 Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. 1 INTRODUÇÃO maysa_scampos@hotmail.com Apesar dos avanços ortopédicos para obtenção da consolidação óssea normal após fratura, aproximadamente 10% delas ainda apresentam atraso na consolidação (AZAD et al., 2009). Considerando os Estados Unidos isoladamente, em que o número anual de fraturas ósseas chega a oito milhões, o impacto clínico e financeiro das alterações da consolidação óssea no sistema de saúde é significante (ASSIOTIS; SACHINIS; CHALIDIS, 2012). Múltiplos fatores podem ser considerados como de risco para interferências no reparo ósseo, como idade, tabagismo, doenças osteometabólicas, agentes farmacológicos e algumas condições sistêmicas como a diabetes (AZAD et al., 2009; DINIZ et al., 2008; OGASAWARA et al., 2008; URABE et al., 2003). Estima-se que cerca de 16 milhões de pessoas, aproximadamente 4% da população, sejam portadoras de diabetes nos Estados Unidos, sendo responsável por mais de mortes e amputações anualmente (DINIZ et al., 2008). De acordo com estatísticas da Federação Internacional de Diabetes, em 2013 o número de pessoas com diabetes foi de 382 milhões; em 2035 essa estatística será elevada para 592 milhões (FEDERATION, 2006). No Brasil, há previsão de que haverá 12 milhões de indivíduos diabéticos, no ano de 2025 (DINIZ et al., 2008). A relação entre distúrbio da consolidação óssea e diabetes tem sido referida em humanos (MONTAGNANI et al., 2011; KIM et al., 2012) e investigada em ratos desde a década de 60 (HERBSMAN et al., 1968). Embora o assunto tenha sido abordado em diversos estudos (AL-ZUBE et al., 2009; AZAD et al., 2009; BEAM; PARSONS; LIN, 2002; DINIZ et al., 2008; FOLLAK et al., 2004; HERBSMAN et al., 1968; KIDDER et al., 2009; MACEY et al., 1989; OGASAWARA et al., 2008; URABE et al., 2003; WANG et al., 2012), os mecanismos e a severidade das alterações ósseas decorrentes da diabetes ainda não estão completamente elucidados na literatura científica. 2 OBJETIVOS Investigar os efeitos da diabetes na qualidade do tecido ósseo e na consolidação de fraturas ósseas em ratas diabéticas. 3 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas 28 ratas Rattus Norvegicus albinus, variedade Wistar, com massa corpórea inicial de 200 gramas, fornecidas pelo Biotério Central da Prefeitura do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e alojadas no Biotério do Laboratório de Bioengenharia durante todo o período experimental sem restrição de acesso à água e ração, em temperatura ambiente de 20 a 24 C, controle de claro/escuro (12 x 12 horas) e controle da umidade relativa do ar em 55±10%.

2 Os animais foram aleatoriamente divididos em 4 grupos experimentais: (1) CON: ratas normais; (2) DM: ratas diabéticas; (3) CON+FRAT: ratas normais submetidas à fratura óssea e; (4) DM+FRAT: ratas diabéticas submetidas à fratura óssea. A indução da diabetes foi realizada por meio de uma única aplicação intravenosa de 40 mg/kg de estreptozotocina (dissolvida em solução tampão de citrato 0.1M, ph 4.9). Nos animais controle foi realizada aplicação de solução de citrato, com mesma dosagem e seguindo os mesmos procedimentos para injeção de estreptozotocina. Os animais com taxa glicêmica superior a 250 mg/dl, avaliada uma semana após a aplicação da estreptozotocina, foram diagnosticados como diabéticos e incluídos no estudo. Durante o período experimental, a taxa glicêmica foi avaliada três vezes por semana, por meio de coleta de sangue obtida por punção venosa da cauda. Valores inferiores a 250 mg/dl em duas medidas consecutivas determinaram a exclusão do animal do estudo, segundo critérios usados por Follak et al. (2004). Após 30 dias da indução foi realizada fratura na diáfise do fêmur direito pelo método fechado (Figura 1). Figura 1 - Figura esquemática da alavanca inter-resistente confeccionada no laboratório que foi utilizada para produzir a fratura fechada do terço médio do fêmur dos animais experimentais. Em seguida, os fragmentos ósseos foram fixados com implante ortopédico intramedular (Figura 2) e os animais foram acompanhados por 14 e 28 dias. Figura 2 - A foto mostra o foco da fratura fixado com fio de Kirschner intramedular (A), cuja estabilização pode ser verificada radiograficamente após a cirurgia (B).

3 A qualidade do tecido e do calo ósseo foi avaliada por meio da densitometria por absorciometria (DXA). Os ossos foram escaneados no densitômetro com software para animais de pequeno porte (Discovery Hologic QDR Series, USA) e a análise permitiu mensurar os valores de densidade mineral óssea (DMO), além da área do calo ósseo em duas regiões de interesse; na metáfise distal do osso intacto (fêmur esquerdo) e no calo ósso do fêmur fraturado. Para avaliar o tecido ósseo íntegro, a região de interesse utilizada na análise foi padronizada em um quadrado de 0,90cm 2 e posicionada imediatamente proximal à cartilagem de crescimento distal do fêmur, permitindo mensurar a DMO da metáfise distal do fêmur. Para avaliar o calo ósseo, a região de interesse utilizada na análise apresentava forma e tamanho variáveis abrangendo toda região de tecido ósseo neoformado, permitindo mensurar a DMO e a área do calo ósseo. 4 RESULTADOS Com relação à densidade nos ossos íntegros foi observada redução significativa (p<0,05) da DMO nos ossos dos ratos diabéticos (DM: 0,06±0,01 g/cm²) em comparação com os ratos controle (CON 0,14±0,008). Com relação à densidade no calo ósseo, a DMO também foi significativamente inferior (p<0,02) nos ratos diabéticos que nos ratos controle, tanto no segmento de 14 dias (DM+FRAT: 0,09±0,12; CON+FRAT: 0,20±0,001) como no de 28 dias (DM+FRAT: 0,20±0,004; CON+FRAT: 0,25±0,005). 5 DISCUSSÃO Em nosso estudo observamos redução expressiva de 57,14% da densidade óssea nos ratos diabéticos. A relação entre diabetes e perda de massa óssea já está bem documentada na literatura (KAYAl et al., 2009; KRAKAUER et al., 1995) e foi confirmada neste estudo experimental, que também investigou os efeitos da diabetes na consolidação óssea. Estudamos os efeitos da diabetes na consolidação óssea devido à conhecida relação entre diabetes e aumento na incidência de fraturas ósseas (DINIZ et al., 2008; FOLLAK et al., 2004; KAYAL et al., 2009; KRAKAUER et al., 1995; OGASAWARA et al., 2008), além dos relatos de atraso na consolidação óssea (DINIZ et al., 2008). Observamos que os calos ósseos dos animais diabéticos sem controle da glicemia apresentaram menor densidade mineral óssea que os animais do grupo controle. No período de 14 dias pós-fratura, a densidade do calo ósseo do rato diabético foi 55% inferior à densidade do calo do osso do rato não diabético. Essa redução passou para 20% no período de 28 dias pós-fratura. Além disso, observamos redução do volume e mineralização do calo ósseo nos ratos diabéticos, quando comparados aos animais do grupo controle. As alterações ósseas observadas tanto no osso intacto como no osso fraturado apresentam relação com a taxa glicêmica dos animais, sendo que, quanto maior o valor de glicemia, maior a deterioração do tecido e do calo ósseo. 6 CONCLUSÃO Concluímos que a diabetes provocou alterações negativas na qualidade do tecido e do calo ósseo, reduzindo a densidade do osso intacto e retardando a formação e mineralização do calo ósseo durante a consolidação. Palavras-chave: diabetes mellitus, tecido ósseo, calo ósseo, fratura.

4 AGRADECIMENTOS Agradecimentos à Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). REFERÊNCIAS AL-ZUBE, L. et al. Recombinant human platelet-derived growth factor BB (rhpdgf-bb) and beta-tricalcium phosphate/collagen matrix enhance fracture healing in a diabetic rat model. J Orthop Res, v. 27, n. 8, p , ASSIOTIS, A.; SACHINIS, N. P.; CHALIDIS, B. E. Pulsed electromagnetic fields for the treatment of tibial delayed unions and nonunions. A prospective clinical study and review of the literature. J Orthop Surg Res, v. 7, p. 24, AZAD, V. et al. rhbmp-2 enhances the bone healing response in a diabetic rat segmental defect model. J Orthop Trauma, v. 23, n. 4, p , BEAM, H. A.; PARSONS, J. R.; LIN, S. S. The effects of blood glucose control upon fracture healing in the BB Wistar rat with diabetes mellitus. J Orthop Res, v. 20, n. 6, p , DINIZ, S. F. et al. Alloxan-induced diabetes delays repair in a rat model of closed tibial fracture. Braz J Med Biol Res, May;41(5): FEDERATION ID. Diabetes Atlas. Brussels, FOLLAK, N. et al. Improving metabolic control reverses the histomorphometric and biomechanical abnormalities of an experimentally induced bone defect in spontaneously diabetic rats. Calcif Tissue Int, v. 74, n. 6, p , HERBSMAN, H. Retardation of fracture healing in experimental diabetes. J Surg Res, v. 8, n. 9, p , KAYAL, R. A. et al. Diabetes causes the accelerated loss of cartilage during fracture repair which is reversed by insulin treatment. Bone, v. 44, n. 2, p , KIDDER, L. S. et al. Osteogenic protein-1 overcomes inhibition of fracture healing in the diabetic rat: a pilot study. Clin Orthop Relat Res, v. 467, n. 12, p , KIM, J. H. et al. Diabetic peripheral neuropathy is highly associated with nontraumatic fractures in Korean patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Endocrinol (Oxf), v. 77, n. 1, p , KRAKAUER, J. C. et al. Bone loss and bone turnover in diabetes. Diabetes, v. 44, n. 7, p , MACEY, L. R. et al. Defects of early fracture-healing in experimental diabetes. J Bone Joint Surg Am, v. 71, n. 5, p , 1989.

5 MONTAGNANI, A. et al. Osteoporosis and risk of fracture in patients with diabetes: an update. Aging Clin Exp Res, v. 23, n. 2, p , OGASAWARA, A. et al. Molecular basis for affected cartilage formation and bone union in fracture healing of the streptozotocin-induced diabetic rat. Bone, v. 43, n. 5, p , URABE, K. et al. Determination of the complete cdna sequence of rat type II collagen and evaluation of distinct expression patterns of types IIA and IIB procollagen mrnas during fracture repair in rats. J Orthop Sci, v. 8, n. 4, p , WANG, C. Y. et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium facilitates angiogenesis and fracture healing in diabetic rats. J Tissue Eng Regen Med, v. 6, n. 7, p , 2012.