UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE PAULA FASSICOLO VARIZA

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1 UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE PAULA FASSICOLO VARIZA CARACTERIZAÇÃO DA FAUNA DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE) NO SUL DE SANTA CATARINA, BRASIL. TUBARÃO 2016

2 PAULA FASSICOLO VARIZA CARACTERIZAÇÃO DA FAUNA DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE) NO SUL DE SANTA CATARINA, BRASIL. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientadora: Profa. Josiane Somariva Prophiro Dra. TUBARÃO 2016

3 PAULA FASSICOLO VARIZA CARACTERIZAÇÃO DA FAUNA DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE) NO SUL DE SANTA CATARINA, BRASIL. Esta Dissertação foi julgada adequada pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde - Mestrado, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Tubarão (SC), 15 de dezembro de Orientadora: Profa. Josiane Somariva Prophiro Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina - UNISUL Prof. Luiz Alberto Kanis Dr. Universidade do Sul de Santa Catarina - UNISUL Profa. Ana Caroline Dalla Bona Dra. Forrest Innovations Ltda, FORREST INNOVATI, Brasil.

4 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente e especialmente a minha mãe, Rosana Fassicolo, pelo apoio que me deu em tudo que eu sempre quis realizar academicamente. A minha orientadora Dra. Josiane Somariva Prophiro um agradecimento mais que especial pela ajuda, dedicação e principalmente pela paciência que teve em todos os momentos. Ao pessoal do laboratório de Imunoparasitologia, Alex Silveira, Millena Fernandes, Felipe Allan da Silva Costa e Guilherme Werner, que de uma forma ou de outra auxiliaram no andamento do trabalho. Aos amigos novos que fiz e parceiros de coletas, Thiago Pereira Nunes e Joice Guilherme Oliveira, nem tenho palavras para descrever o quanto me ajudaram desde o início. Sempre lembrarei com carinho das situações que vivemos durante esse tempo. Aos moradores das residências por nos atenderem prontamente todos os meses para colocação das armadilhas e por entenderem a importância desse trabalho. Ao tenente coronel comandante Márcio César Ribas Cerqueira, do 28º Grupo de Artilharia de Campanha (GAC) Grupo Severiano Martins da Fonseca de Criciúma, por permitir o acesso e sempre disponibilizar pessoas para nos ajudar quando necessário. Ao ex-coordenador do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Tubarão José Carlos Lopes e ao atual coordenador Volnei Miranda, por nos autorizar a utilizar as dependências e por ir fora do horário de funcionamento para abrir os portões de acesso ao local. Aos pesquisadores, técnicos e alunos de iniciação científica da Fundação Oswaldo Cruz - Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ Belo Horizonte/MG), em especial Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo, Dr. José Dilermando Andrade Filho, Rogério Pereira e Felipe Dutra Rêgo, muito obrigada pelo auxílio e atenção que tiveram durante o período do treinamento. Agradeço de maneira geral a qualquer pessoa que de alguma maneira auxiliou na realização dessa pesquisa e que por ventura não tenha sido citado.

5 RESUMO As leishmanioses são zoonoses provocadas pela infecção por protozoários do gênero Leishmania spp.. A transmissão das leishmanioses ocorre por meio da picada das fêmeas de insetos flebotomíneos infectados. Estudos de caracterização clínica, biológica e epidemiológica são fundamentais para que possam ser elaboradas estratégias de ação e prevenção individualizadas para as leishmanioses, visto que os padrões de transmissão, espécies dos vetores e espécies de Leishmania podem apresentar-se de forma muito distinta em diferentes regiões. Dessa forma o monitoramento constante das espécies de flebotomíneos circulantes é extremamente importante uma vez que, se perceber o aumento de espécies ou espécimes ao longo dos anos, deve-se atentar para o estabelecimento de métodos de controle para esses vetores. A presente pesquisa teve como objetivo caracterizar a fauna de flebotomíneos, ao que se refere à riqueza e abundância (em peridomicílio, mata urbana e fonte alimentar animal) e identificação molecular de Leishmania spp. das espécies de três municípios (Criciúma, Imaruí e Tubarão), da região Sul de Santa Catarina, Brasil. As coletas dos insetos foram realizadas nos três municípios em diferentes pontos de coleta: fonte alimentar animal, mata urbana e peridomicílio. Foram realizadas coletas mensais de abril de 2015 a março de 2016, totalizando 108 coletas, onde insetos da família Psychodidae foram coletados. Foram identificadas a presença de duas subfamílias: Sycoracinae e Phlebotominae. A subfamília Sycoracinae apresentou um expressivo número de espécimes totalizando indivíduos e a subfamília Phlebotominae 7 espécimes de duas espécies: Nyssomyia neivai e Pintomyia fisheri. Os municípios de Imaruí e Tubarão foi onde houve a presença de flebotomíneos, sendo o habitat com maior frequência próximo ao peridomicílio. As fêmeas dos flebotomíneos foram submetidas à análise molecular para detecção da presença de protozoários do gênero Leishmania spp., entretanto nenhuma amostra foi positiva para a presença do parasito. Descritores: Insetos Vetores. Leishmaniose. Psychodidade.

6 ABSTRACT Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by protozoan parasites of the genus Leishmania spp.. The transmission of leishmaniasis occurs by the bites of infected female sandfly. Studies of clinical, biological and epidemiological characterization are fundamental for the development of individualized action and prevention strategies for leishmaniasis, since the transmission patterns, species of Leishmania vectors and species may present very differently in different regions. Thus, the constant monitoring of circulating sandfly species is extremely important since, if they perceive the increase of species or specimens over the years, one must consider the establishment of control methods for these vectors. This study had as a goal to identify the phlebotomine fauna, as for its abundance (in peri-domiciliary, woods, animal food source) monthly flow and the molecular identification of Leishmania species in three cities of southern Santa Catarina, Brazil. The collecting of the insects occurred in the cities of Criciuma, Imaruí and Tubarão, where three collecting points were set in each city: animal food source, woods and peridomiciliary. In order to collect the insects, it was used CDC light traps. There were monthly collections from April 2015 to march 2016 passing through the four seasons of the year, giving a total of 108 collections, where insects of the family Psychodidae were collected. There was the presence of two subfamilies: Sycoracinae and Phlebotominae. The subfamily Sycoracinae is the one with the highest number of specimens collected, 4.193, while the subfamily Phlebotominae 7 specimens of two species: Nyssomyia neivai and Pintomyia fischeri. The cities of Imaruí and Tubarão were where there was the presence of sand flies, being the habitat more frequently near the peri-domiciliary.the females sand flies went through molecular analysis in order to detect the presence of protozoa of the genus Leishmania spp., however, the samples were negative. Keywords: Insect Vectors. Leishmaniasis. Psychodidade.

7 LISTAS Lista de abreviaturas μl: Microlitro DNA: Ácido desoxirribonucleico dntp: Desoxirribonucleotídeos 5 fosfato ITS1: Internal Transcribed Spacer 1 L. Leishmania LTA Leishmaniose Tegumentar Americana Lu. Lutzomyia LV Leishmaniose Visceral mm: Milimolar MS Ministério da Saúde Ng - Nanogramas Nm - Nanômetros OMS Organização Mundial de Saúde Pb - Pares de bases PCR - Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) PM - Peso molecular Pmol - Pico mols SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação SVS Secretaria de Vigilância Sanitária UV - Ultravioleta WHO - World Health Organization Lista de figuras Figura 1 Evolução e aspecto das lesões cutâneas após a picada do vetor flebotomíneo fêmea infectado com protozoários do gênero Leishmania spp...12 Figura 2 Manifestação do quadro clinico da forma mucocutânea demonstrando lesões nas mucosas oral e nasal...12 Figura 3 Pacientes com leishmaniose visceral em diferentes estágios demonstrando o aumento do baço e do fígado...14

8 Figura 4 Fêmea de flebotomíneo no estágio adulto, ingurgitada (A) e macho de flebotomíneo (B)...15 Figura 5 Comparação entre macho (esquerda) e fêmea de flebotomíneo demonstrando aspectos do dimorfismo sexual...16 Figura 6 Ciclo de vida dos flebotomíneos: ovos, estádios larvais, pupa e adultos...17 Figura 7 Formas promastigota (A) e amastigota (B) de Leishmania spp...18 Figura 8 Ciclo de transmissão das leishmanioses...19 Figura 9 Área de estudo indicando os municípios de Criciúma, Imaruí e Tubarão...21 Figura 10 Fluxograma com o panorama geral dos espécimes da família Psychodidae coletados com o período de coletas, as cidades onde foi realizado o estudo e os pontos onde foram feitas as coletas...27 Figura 11 Quantidade de espécimes coletados da família Psychodidae em relação aos municípios estudados...30 Figura 12 Ocorrência de flebotomíneos em relação aos municípios estudados indicando a quantidade de machos e fêmeas coletados...30 Figura 13 Quantidade de espécimes coletados da família Psychodidae em relação aos pontos de coletas (mata urbana, fonte alimentar animal e peridomicílio)...31 Figura 14 Quantidade de espécimes coletados da família Psychodidae em relação às quatro estações do ano...32 Figura 15 Ocorrência de flebotomíneos em relação às quatro estações do ano...32 Figura 16 Ocorrência de flebotomíneos em relação a umidade relativa do ar e a temperatura...33 Figura 17 Gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, mostrando produtos amplificados pela PCR its1 de amostras das fêmeas capturadas: PM 100pb - peso molecular de 100pb...34

9 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO LEISHMANIOSES Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) Leishmaniose Visceral (LV) INSETOS FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE) Ciclo de vida dos flebotomíneos Transmissão das leishmanioses OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MÉTODOS TIPO DE ESTUDO ÁREA DE ESTUDO PROCEDIMENTOS Coleta Triagem Preparação, montagem e identificação dos flebotomíneos Extração de DNA das fêmeas PCR dirigida ao Internal Transcribed Spacer I (ITS I) do rdna VARIÁVEIS DE ESTUDO PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO PERSPECTIVAS FUTURAS...36 REFERÊNCIAS...37 APÊNDICE APÊNDICE A Ficha de coleta de dados em campo... 43

10 10 1. INTRODUÇÃO As leishmanioses são zoonoses provocadas pela infecção por protozoários do gênero Leishmania spp. e estão entre as doenças mais negligenciadas do mundo, afetando em grande parte as populações mais carentes, principalmente nos países em desenvolvimento. Segundo a organização mundial da saúde (OMS), a cada ano são registrados quase dois milhões de novos casos de leishmaniose no mundo 1. As leishmanioses são doenças que podem se apresentar nas formas cutânea e mucocutânea (Leishmaniose Tegumentar Americana - LTA) e visceral (Leishmaniose Visceral - LV), dependendo da espécie de parasito envolvido na infecção. A Leishmaniose visceral é a forma mais grave da doença, e quando não é precocemente diagnosticada e tratada, o índice de mortalidade pode chegar a 10% 1-3. No Brasil, entre os anos de 2010 e 2015, foram confirmados casos de Leishmaniose Visceral e casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. Em Santa Catarina de 2006 a 2013, 7 casos de Leishmaniose Visceral foram confirmados e de 2013 a casos de Leishmaniose Tegumentar Americana 4. O mapeamento dos casos revelou novas áreas endêmicas no Nordeste de Santa Catarina, com duas espécies de leishmanias presentes, enquanto no Sul predominou os casos com infecção de origem importada. Com exceção de três casos de Leishmania (Leishmania) amazonenses, a maioria das amostras positivas encontradas foram de L. braziliensis 5. A transmissão das leishmanioses ocorre por meio da picada das fêmeas de flebotomíneos, que são os vetores da leishmaniose. Diversos tipos de flebotomíneos são considerados vetores suspeitos ou confirmados dos protozoários do gênero Leishmania spp 6. Esses insetos pertencem a ordem Diptera, família Psychodidae e subfamília Phlebotominae e no Brasil são conhecidos popularmente como mosquitos palha, birigui, cangalhinha, asa dura, asa branca etc. Possuem atividade crepuscular e noturna, podendo aparecer também entre as primeiras horas da manhã 6-8. Algumas espécies de flebotomíneos podem possuir associação íntima com os seres humanos ou com animais domésticos, enquanto outras vivem em ambientes mais afastados, podendo frequentar habitações humanas e animais ou regiões próximas às habitações, tendo preferência em áreas de mata secundária. Podem se

11 11 desenvolver também em floresta primária, onde pode ocorrer o contato com o homem ou com outros animais quando algum destes adentram esse habitat 9. O habitat dos flebotomíneos de uma determinada área pode sofrer influência de vários fatores, tais como disponibilidade de alimentos e índice pluviométrico. Com o crescente desmatamento e o processo acelerado de urbanização, estes insetos estão se desenvolvendo também em áreas periurbanas e urbanas, indicando assim a capacidade de habitar ambientes antrópicos Conhecer a fauna desses insetos é necessária para a comparação com outras regiões, a fim de estabelecer um perfil epidemiológico, já que cada região, dependendo da sua localização, temperatura e outras variáveis, podem apresentar diferenças quanto à quantidade e variedade de espécies. Sendo assim, o conhecimento da fauna de flebotomíneos é de extrema importância para as medidas de monitoramento e controle adequadas para as leishmanioses. Além disso, a fauna de flebotomíneos de Santa Catarina é pouco descrita, poucas espécies foram listadas para o estado, e até o momento, nenhum estudo dessa natureza havia sido realizado na região Sul. 1.1 LEISHMANIOSES Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, não contagiosa causada por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania spp. e que afeta a pele e as mucosas, como o nariz, a boca e a faringe, provocando úlceras. A leishmaniose mucocutânea é uma manifestação mais grave do que a cutânea, podendo causar lesões mutilantes na face 14,16. A transmissão ocorre por meio da picada da fêmea de flebotomíneo infectada com o protozoário. Afeta primariamente outros animais, como cães, gatos e equinos, porém os seres humanos podem ser envolvidos secundariamente. No local da picada, após dois a três meses, aparece um ponto avermelhado que aumenta de tamanho com o passar do tempo. A úlcera vai tomando forma arredondada com bordas elevadas que pode causar coceira, porém é indolor As lesões podem

12 12 ser localizadas ou darem origem a novas lesões na pele, Figura 1, ou nas mucosas, conforme a Figura Figura 1 Evolução e aspecto das lesões cutâneas após a picada do vetor flebotomíneo fêmea infectado com protozoários do gênero Leishmania spp. Fonte: SVS/MS, Figura 2 Manifestação do quadro clínico da forma mucocutânea demonstrando lesões nas mucosas oral e nasal. Fonte: SVS/MS, O diagnóstico da doença pode ser realizado por exames laboratoriais por meio da coleta do material da lesão para identificação da presença do parasito, e a associação com dados epidemiológicos e o mapeamento de casos da região onde foi confirmada a infecção, pode ajudar a descobrir o possível local de transmissão 16. A LTA constitui um problema de saúde pública em 88 países distribuídos em quatro continentes. É considerada pela OMS, como uma das seis mais importantes doenças infecciosas, principalmente com relação a forma mucocutânea, que possui a capacidade de produzir deformidades graves 15. As leishmanioses cutâneas na Europa, Ásia e África são causadas principalmente pelas espécies: Leishmania infantum, L. tropica, L. major, L. aethiopica e L. donovani ¹. Nas Américas as principais espécies envolvidas são: Leishmania (Viannia) braziliensis, L. (V.) peruviana, L. (V.) guyanensis, L. (V.)

13 13 panamensis, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi, L. (Leishmania.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. (L.) venezuelensis e L. (L.) pifanoi 3. No Brasil a LTA é uma doença amplamente distribuída e casos já foram relatados por todo o país. O agente etiológico que está amplamente distribuído no Brasil é o L. (V.) braziliensis, e a sua transmissão ocorre em diversas regiões do país e está relacionada a uma grande variedade de vetores flebotomíneos como: Lutzomyia whitmani, Lu. wellcomei e Lu. Intermedia 17,18. Várias espécies de Leishmania spp., assim como o L. (V.) braziliensis, eram encontradas somente em florestas da América do Sul, porém com as mudanças ambientais, esses protozoários estão encontrando novos vetores e hospedeiros, levando ao aumento de casos urbanos de leishmaniose cutânea e mucocutânea no Brasil e em outros países Sul Americanos 1, Leishmaniose Visceral (LV) A leishmaniose visceral (LV) é uma doença endêmica em várias regiões do mundo e tem ampla distribuição ocorrendo na Ásia, Europa, Oriente Médio, África e nas Américas, podendo ser chamada também de leishmaniose visceral americana ou calazar neotropical. É mais grave que a LTA por possuir alta mortalidade principalmente em indivíduos que não são tratados precocemente, crianças desnutridas ou em pessoas com idade superior a 65 anos 17,20. Inicialmente a LV foi caracterizada como sendo uma doença rural, mas com o passar dos anos tem se expandido para o meio urbano. Por possuir reservatórios silvestres e também urbanos, se tornou um grave problema de saúde pública. Mesmo recebendo o tratamento adequado 1% a 5% dos pacientes acometidos por essa forma clínica de leishmaniose vem a óbito, devido a alta resistência do parasito ao tratamento ou por complicações secundárias 3,19,20. A doença já foi identificada em 12 países da América latina e a grande maioria dos casos ocorrem no Brasil, com foco principal na região nordeste, porém sendo identificada também em outras regiões 21.

14 14 Os agentes etiológicos envolvidos na leishmaniose visceral são: Leishmania (Leishmania) donovani, L. (L.) infantum e L. (L.) chagasi. e os principais vetores envolvidos na transmissão, até o momento, são Lu. longipalpis e Lu. cruzi 17, 21. Esta doença apresenta sintomas e aspectos clínicos completamente diferentes da LTA. Os principais sintomas são febre, perda de peso, anemia, aumento do baço e do fígado, conforme mostrado na Figura O período de incubação varia entre 10 dias a 24 meses e o parasito pode ficar presente no organismo por longos períodos. Somente algumas pessoas infectadas desenvolvem a doença clínica, geralmente isso ocorre muito tempo depois de terem tido contato com o agente etiológico ou quando o seu sistema imunológico está debilitado 19. Figura 3 Pacientes com leishmaniose visceral em diferentes estágios demonstrando o aumento do baço e do fígado. Fonte: SVS/MS, FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE) Os flebotomíneos são insetos pertencentes à ordem Diptera e família Psychodidae as espécies com importância médica e veterinária se agrupam na subfamília Phlebotominae 24. Segundo Young e Duncan (1994) os vetores de Leishmania spp. nas Américas pertencem a um gênero, Lutzomyia, porém em uma classificação mais recente de Galati (2003) foram divididos em diversos gêneros,

15 15 com destaque para: Lutzomyia, Migonemyia, Pintomyia, Bichronomyia, Psychodopygus, Nyssomyia e Trichophoromyia 25,26. São insetos que costumam viver em matas e a sua atividade é crepuscular e noturna, permanecendo protegidos durante o dia. Podem ser encontrados em currais, bananais, chiqueiros, porém tem sido encontrados frequentemente em regiões urbanas onde se abrigam próximo ou dentro das casas em locais mais escuros. As fêmeas da maioria das espécies são hematófagas, necessitando de sangue para o desenvolvimento e maturação dos ovos 7,11,22. Além disso, necessitam de matéria orgânica e umidade para a postura dos ovos, por isso a quantidade desses insetos pode aumentar em épocas quentes e chuvosas 9. Os flebotomíneos que vivem em ambientes modificados tentam sobreviver se alimentando do sangue de mamíferos que encontram em matas residuais, animais domésticos ou o homem, que vivem no peridomicílio 16. São insetos muito pequenos medindo de 1 a 3 mm de comprimento, costumam voar em pequenos saltos e pousar com as asas entre abertas, possuem o corpo coberto por muitos pelos e com uma cor castanho clara ou palha, por isso são também chamados popularmente de mosquito-palha (Figura 4) 20. A B Figura 4 - Fêmea de flebotomíneo no estágio adulto, ingurgitada (A) e macho de flebotomíneo (B). Fonte: SVS/MS, Os flebotomíneos apresentam dimorfismo sexual bastante acentuado (Figura 5), possuindo além de diferenças na forma corporal, distinção quando ao comportamento alimentar. Tanto machos quanto fêmeas necessitam de carboidratos

16 16 para a sua alimentação, que podem retirar de substâncias açucaradas de plantas como néctar e seiva ou secreções açucaradas de outros insetos. Porém uma das diferenças é a hematofagia que somente a fêmea realiza 22. Figura 5 - Comparação de macho (esquerda) e fêmea demonstrando aspectos do dimorfismo sexual. Fonte: Marques F., Ciclo de vida dos flebotomíneos As fêmeas geralmente procuram substratos ricos em matéria orgânica para realizar a postura dos ovos, pois as larvas necessitam de umidade, matéria orgânica em decomposição e temperatura amena para se desenvolverem. O ciclo de vida se caracteriza por apresentar a fase de ovo, fase larval com quatro estádios de desenvolvimento, uma fase de pupa e a fase adulta (Figura 6) 23. Os ovos possuem forma elipsoide ou ovoide e medem cerca de 300 a 500 mm de comprimento e 70 a 150 mm de largura, as variações podem ocorrer dependendo da espécie. Após a postura apresentam cor esbranquiçada ou amarelada e depois de algumas horas tornam-se castanho escuro. Uma fêmea pode fazer em média uma postura com cerca de 40 ovos, podendo variar também de acordo com a espécie 22. As larvas apresentam forma vermiforme, são pequenas e brancas e logo após a eclosão se alimentam da casca dos ovos e de matéria orgânica que estiver

17 17 disponível. São constituídas por 12 segmentos, além da cabeça que é bem desenvolvida e possui coloração mais escura, sendo três segmentos do tórax e nove segmentos do abdômen. As peças bucais são do tipo triturador e possuem antenas que variam de acordo com a espécie e o estádio larval 22,25. As pupas possuem coloração esbranquiçada ou amarelada que escurece conforme se aproxima a eclosão do estádio adulto. A pupa não se movimenta ficando presa ao substrato pela exuvia larval, executando apenas pequenos movimentos até a formação do inseto adulto. Quando adultos os flebotomíneos podem viver em diversos ambientes, tanto no meio rural quanto no meio urbano 20,22. Figura 6 Ciclo de vida dos flebotomíneos: ovos, estádios larvais, pupa e adultos. Fonte: Fortes KP,

18 Transmissão das leishmanioses A transmissão das leishmanioses ocorre por meio da picada da fêmea do inseto flebotomíneo infectada pelo protozoário, ela se contamina quando faz o repasto sanguíneo em algum outro animal que já tinha o parasito no seu organismo. A fêmea ingere, por meio da alimentação sanguínea, formas amastigotas (sem flagelos) do protozoário que estão no hospedeiro ou reservatório que se transformam em formas promastigotas (flageladas) e se multiplicam no seu intestino (Figura 7). O ciclo de vida do protozoário é intracelular e a multiplicação ocorre dentro dos macrófagos. 6,16. A B Figura 7 Formas promastigota (A) e amastigota (B) de Leishmania spp. Fonte: BESTEIRO et al, A transmissão ocorrerá, portanto, quando a fêmea for realizar o segundo repasto sanguíneo, liberando na epiderme do hospedeiro a forma promastigota que será fagocitada e no interior dos macrófagos irão se diferenciar na forma amastigota. A partir da inoculação inicia-se a interação entre o parasito e a resposta imunológica do hospedeiro que irá determinar a expressão clínica da leishmaniose, dependendo da espécie de Leishmania envolvida da infecção (Figura 8) 6,16.

19 19 Figura 8 Ciclo de transmissão das leishmanioses. Fonte: FAPERJ, Os hospedeiros e reservatórios do parasito podem ser os mais variados, dentre os animais silvestres podem ser citados os ratos silvestres, gambás, raposas, marsupiais e tatus, porém animais domésticos tais como cachorros, gatos e cavalos também podem fazer esse papel. Além de que, alguns animais possuem hábitos sinantrópicos podendo estabelecer a ligação entre os ciclos silvestres e domésticos 27. A inserção de casas próximas a região de mata primária, a diminuição cada vez maior biodiversidade e a supressão de recursos naturais podem ter uma grande influência nos hábitos desses vetores e dos animais que são reservatórios da doença, fazendo com que se desenvolvam cada vez mais em ambiente construído 28. Algumas espécies de flebotomíneos ainda são restritas a floresta, porém outras já encontraram habitats em áreas modificadas pelo homem, o que pode aumentar as chances de os humanos serem envolvidos no ciclo de transmissão das leishmanioses 29.

20 20 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Caracterizar a fauna de flebotomíneos, ao que se refere a riqueza e abundância (em peridomicílio, mata urbana e fonte alimentar animal), flutuação mensal e identificação molecular de Leishmania spp. das espécies de três municípios da região Sul de Santa Catarina, Brasil. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Descrever a riqueza e a abundância das espécies de flebotomíneos em peridomicílio, mata urbana e fonte alimentar animal nos municípios de Criciúma, Imaruí e Tubarão. Identificar os habitats com maior prevalência desses insetos nos municípios analisados. Avaliar a influência de fatores climáticos na distribuição mensal de flebotomíneos nos municípios estudados. Verificar a possibilidade da presença de protozoários do gênero Leishmania spp. nas fêmeas das espécies encontradas.

21 21 3. MÉTODOS 3.1 TIPO DE ESTUDO O estudo realizado foi do tipo transversal com abordagem quantitativa. O estudo transversal é o tipo de estudo epidemiológico que tem como característica a observação em uma única oportunidade e em um determinado período de tempo ÁREA DE ESTUDO O estudo foi realizado em três municípios do Sul do estado de Santa Catarina: Criciúma, Tubarão e Imaruí, apresentados na Figura 9. Figura 9 Área de estudo indicando os municípios de Criciúma, Imaruí e Tubarão. Fonte: Google Earth, 2015.

22 22 O município de Tubarão apresenta uma área de 301,755 km², possui uma população de habitantes, apresenta um clima subtropical, e a temperatura média varia entre 15,5ºC e 23,6ºC. O município de Criciúma localiza-se no extremo sul catarinense, com uma área de 235,627 km², possui uma população de aproximadamente habitantes, com clima subtropical e temperatura entre 15ºC e 30ºC. O município de Imaruí está localizado no litoral de Santa Catarina com uma área de 542,236 km², uma população de habitantes, possui clima mesotérmico úmido com verões quentes e a temperatura média anual é de 19,5ºC Em cada município foram estabelecidos três locais para coleta: um ponto em peridomicílio, um em área de mata urbana e outro próximo a uma fonte alimentar animal. Para a escolha dos três pontos de coleta também foi levada em consideração locais onde as armadilhas ficariam seguras contra possíveis danos. 3.3 PROCEDIMENTOS Coleta A coleta dos insetos foi realizada no período de abril de 2015 a março de 2016, sendo utilizadas armadilhas do tipo CDC luminosa, que é um dos métodos mais utilizados para a captura desses dípteros. As armadilhas foram colocadas próximas a locais que constituem abrigos naturais dos insetos flebotomíneos, como ocos em árvores, fendas em rochas, espaços em troncos de árvores, tocas de outros animais e raízes tabulares 22. Mensalmente as armadilhas foram colocadas nas três cidades, sendo que em cada cidade, as coletas foram feitas nos três pontos no mesmo dia, totalizando três coletas por dia e nove por mês. Ficavam ativas por aproximadamente 12 horas (18:00 as 06:00) e cada uma das três armadilhas utilizadas foi alimentada com uma bateria de 12 volts e 7 amperes. As informações de campo foram anotadas em uma ficha de coleta de dados (Apêndice A) e a obtenção dos dados de temperatura e umidade relativa do ar foi foram obtidas utilizando termohigrômetro digital.

23 Triagem Os insetos coletados em campo foram abatidos em câmara de éter e levados ao laboratório de Imunoparasitologia da Universidade do Sul de Santa Catarina UNISUL onde foi feita a primeira triagem, separando os insetos suspeitos dos demais que por ventura foram capturados nas armadilhas. Os insetos permaneceram armazenados em tubos do tipo eppendorf com álcool 70% para a conservação do material biológico e foram encaminhados para a Fundação Oswaldo Cruz - Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ Belo Horizonte/MG), onde foi realizada uma segunda triagem fazendo a sexagem dos insetos encontrados, separando os machos para preparação, montagem das lâminas e identificação, e as fêmeas para a dissecação, montagem das lâminas, identificação e extração de DNA Preparação, montagem e identificação dos flebotomíneos Os machos foram montados em lâmina com bálsamo do Canadá e para as fêmeas utilizou-se líquido de Berlese. A utilização do bálsamo para os machos se deve a maior durabilidade das lâminas, enquanto o Berlese para as fêmeas se justifica pela visualização das estruturas internas com maior nitidez. Para as fêmeas, como identificação específica, foi utilizada a visualização das espermatecas e do cibário. A identificação dos flebotomíneos foi realizada por meio da observação de características morfológicas internas e externas em microscópio óptico seguindo as chaves e a classificação proposta por Galati (2003) Extração de DNA das fêmeas A extração do DNA foi realizada com o kit de extração de tecidos e células Gentra Puregene da QIAGEN seguindo o protocolo modificado por Quaresma et al (2011) 35 : as fêmeas foram maceradas em 100µl de solução de lise celular sendo adicionado a mistura 1µl de proteinase K. A solução foi homegeneizada por inversão do tubo e incubada a 55ºC overnight. Após a incubação foi adicionado a solução 1µl de RNAse sendo homogeneizada por inversão e incubada por trinta

24 24 minutos a 37ºC. Após esse procedimento as amostras foram incubadas por três minutos no gelo e foram adicionados 100 µl de solução de precipitação de proteínas. Os tubos foram vortexados por 20 segundos e em seguida centrifugados durante cinco minutos a 1200 x g (1400 rpm), o sobrenadante foi acondicionada em um novo tubo, onde foram adicionados 300µl de isopropanol vertendo com cuidado por inversão a amostra remanescente, e na sequencia realizada outra centrifugação a 1220 x g (1400 rpm) durante cinco minutos. Na sequencia o sobrenadante foi descartado e o tubo foi deixado secando invertido contra um papel absorvente. Adicionou-se álcool a 70% no tubo seco invertendo-o várias vezes seguido de outra centrifugação a 1200 x g (1400 rpm) por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado deixando o tubo secar invertido contra um papel absorvente até que o álcool tenha secado completamente. Por fim foram adicionados 25µl de H20 ultra pura para a hidratação de DNA PCR dirigida ao Internal Transcribed Spacer I (ITS I) do rdna Para determinação da infecção natural das fêmeas de flebotomíneos coletadas as amostras de DNA extraídas foram analisadas por meio da técnica de PCR dirigida ao ITS1 de Leishmania 36, que amplifica um fragmento de aproximadamente pares de bases (pb) 37. Para amplificação foi utilizado o par de iniciadores LITSR: 5 CTGGATCATTTTCCGATG 3 e L5.8S: 5 TGATACCACTTATCGCACTT 3. A reação foi preparada para um volume final de 25µl contendo 5µl de DNA da amostra, 2,5µl de solução tampão 10x, 0,75µl de MgCl 2 (50 mm), 0,5µl de dntp mix a 10mM, 1,25µl de cada um dos iniciadores (LITSR e L5.8R) a 10µM, 0,25µl de Taq DNA polimerase a 10U/µl, 1,25µl de dimetilsulfóxido (DMSO) e 12,25µl de água destilada estéril. A amplificação do DNA foi processada em termociclador automático Eppendorf Mastercycler Gradient, utilizando o ciclo: desnaturação inicial durante dois minutos a 95ºC, na sequência 35 repetições de desnaturação por 30 segundos a 95ºC, anelamento por 60 segundos a 53ºC e extensão por 60 segundos a 72ºC. A extensão final foi a 72ºC durante dez minutos. Em todas as reações foi utilizado controle positivo com 20 nanogramas de DNA extraído de cepas referência de Leishmania amazonenses (IFLA/BR/67/PH8), Le. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), Le. infantum (MOHOM/BR/74/PP75) e Le.

25 25 guyanensis (MHOM/BR/75/M4147), e como controle negativo utilizou-se água destilada estéril. Os resultados foram visualizados em gel de agarose 2,0% corado com brometo de etídio e analisados em exposição a luz ultravioleta (UV), onde se considera positivas as amostras que apresentam banda de peso molecular correspondente a pb, utilizando peso molecular (PM) de 100pb. 3.4 VARIÁVEIS DE ESTUDO Os dados analisados foram: riqueza (variedade de espécies), abundância (quantidade de espécimes), sexo (macho ou fêmea), fêmeas infectadas (sim ou não), estações do ano (primavera, verão, outono e inverno), temperatura do ar, umidade relativa do ar, municípios de coleta (Criciúma, Imaruí e Tubarão) e pontos de coleta (peridomicílio, mata urbana e fonte alimentar animal). 3.5 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS Os dados foram organizados em planilhas e as análises descritivas foram registradas no programa Microsoft Excel. A significância das diferenças no número de insetos suspeitos entre os locais de amostragem foi testada através de uma análise de variância uni-fatorial (1- ANOVA) utilizando o software STATISTICA 6.0. Como a ANOVA requer a homogeneidade entre as variâncias, os dados foram submetidos ao teste Cocharan s, e quando necessário, sofreram transformação do tipo log (x+1). O teste a posteriori de comparação múltipla de Tukey foi usado quando diferenças significativas foram detectadas (p<0,05) 38. A relação entre valores de temperatura e umidade do ar e a ocorrência de flebotomíneos foi avaliada por meio de uma análise de regressão.

26 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA Os trabalhos analisados pela CEUA (Comissão de Ética no Uso de Animais) se referem a utilização de animais das espécies classificadas como filo Chordata, subfilo Vertebrata, conforme disposto na Lei n , de 8 de outubro de Como o objeto de estudo se enquadra na categoria A (experimentos que não usam seres vivos ou que usam plantas, bactérias, protozoários ou espécies de animais invertebrados), não foi necessária a submissão a Comissão de Ética no Uso de Animais 39.

27 27 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Ao todo para a realização deste trabalho foram realizadas 108 coletas mensais, iniciando em abril de 2015 e finalizando em março de Nesse período foi possível contemplar as quatro estações do ano, onde insetos da família Psychodidae foram coletados, destes houve a presença de duas subfamílias: Sycoracinae e Phlebotominae (Figura 11). Figura 10 Fluxograma com o panorama geral dos espécimes da família Psychodidae coletados com o período de coletas, as cidades onde foi realizado o estudo e os pontos onde foram realizadas as coletas.

28 28 A subfamília Sycoracinae foi a que apresentou um maior número de espécimes totalizando e a subfamília Phlebotominae 7 espécimes de duas espécies: Nyssomyia neivai ( = Lutzomyia neivai) e Pintomyia fischeri ( = Lutzomyia fischeri) (Tabela 1). Na subfamília Phlebotominae é onde se agrupam os insetos de importância médica e veterinária 6. Tabela 1 Espécies de flebotomíneos coletados, quantidade, sexo, mês e ano de coleta, cidades e os pontos de coletas onde foram capturados. Espécie de Flebotomíneo Quantidade e sexo Mês/Ano de coleta Ponto de coleta e cidade Nyssomyia neivai 2 machos 1 fêmea 1 macho 1 fêmea 1 fêmea Abril / 2015 Outubro / 2015 Novembro / 2015 Janeiro / 2016 Março / 2016 Peridomicílio / Imaruí Mata urbana / Tubarão Mata urbana / Tubarão Peridomicílio / Imaruí Peridomicílio / Imaruí Pintomyia fischeri 1 fêmea Março / 2016 Peridomicílio / Imaruí Em um levantamento realizado em 2010 na cidade de Florianópolis foram coletados 413 espécimes fêmeas de flebotomíneos distribuídos nas seguintes espécies: Brumptomyia sp., Lutzomyia fischeri, Lu. migonei e Lu. neivai. Embora o autor não tenha informado o número de machos e não tenha detalhado as características dos pontos de coletas, podemos inferir que o número de indivíduos coletados para Lu. neivai foi próximo ao obtido na presente pesquisa, pois o autor relatou a presença de 10 fêmeas dessa espécie, entretanto para Lu. fischeri o relato foi de 39 fêmeas 40. Já em outro estudo mais ao leste de Santa Catarina, na cidade de Piçarras, os autores observaram em suas coletas a presença de três espécies: Lu. neivai, Lu. fischeri e Lu. ayrozay. Quando comparado à similaridade entre os pontos de coletas e o número de indivíduos coletados pode-se observar que em peridomicílio os autores coletaram 4 machos de Lu. neivai, enquanto no presente estudo em peridomicílio, foram coletados 2 machos e 2 fêmeas em Imaruí, e em Tubarão no ponto de mata urbana 1 macho e 1 fêmea. Além desse ponto, os autores também observaram uma maior predominância dessa espécie perto de residências. Para a espécie Lu. fischeri os autores tiveram o mesmo número de indivíduos que foram encontrados nas coletas realizadas nesse estudo, sendo esse ponto próximo a

29 29 locais com bananeiras onde a houve a presença de 1 fêmea para ambos os estudos 6. Marcondes et al (2005) em coletas realizadas na região leste de Santa Catarina no ano de 2000 e Grott et (2014) al em coletas feitas na região nordeste no ano de 2008, observaram a presença de Nyssomyia neivai, como espécie de flebotomíneo predominante, assim como no presente estudo. Resultados semelhantes também foram obtidos por Santos et al (2016) em um estudo realizado em 2012 no estado do Paraná. Esta espécie de flebotomíneo é encontrada frequentemente em regiões de peridomicílio, que foram os locais com maior predominância nos trabalhos citados anteriormente Pintomyia fischeri já foi registrada nos estados brasileiros do Sul do país 13 e é considerada como uma espécie essencialmente silvestre, mas tem sido encontrada em habitats rurais peridomésticos. Embora no presente trabalho houve a presença de apenas um exemplar dessa especie, as características de habitat que o autor correlaciona ao encontro de P. fischeri corresponde à similaridade do ponto de coleta onde a espécie foi encontrada. Considerando a abundância desta espécie em áreas desmatadas pode-se sugerir que está bem desenvolvida a viver no entorno de matas e ambientes com alterações antrópicas A distribuição geográfica das espécies dos Dipteras: Psychodidae pode ser influenciada por barreiras físicas, precipitação pluviométrica, vegetação, luminosidade e abundância de hospedeiros vertebrados 47. Sabe-se ainda que a presença de animais influência na densidade dos flebotomíneos dentro ou próximo à habitações humanas e, consequentemente, aumenta os riscos de transmissão de espécies de leishmania para humanos 48,49. Pode-se verificar, como mostra as Figuras 11 e 12, a quantidade de espécimes coletados em relação às cidades de Criciúma, Imaruí e Tubarão onde foram realizadas as coletas. Podemos observar que na região de Imaruí teve um maior número de indivíduos da família Psychodidade, seguido por Criciúma e Tubarão. E para a subfamília Phlebotominae se teve registro nas cidades de Imaruí e Tubarão. Alguns estudos têm mostrado que a agregação de flebotomíneos principalmente em ambiente peridomiciliar está relacionada com a liberação de feromônios pelos insetos e cairomônios pelos hospedeiros

30 Ocorrência de Flebotomíneos 30 Figura 11 Quantidade de espécimes coletados da família Psychodidae em relação aos municípios estudados Imaruí Tubarão Criciuma Macho Fêmea Figura 12 Ocorrência de flebotomíneos com relação aos municípios estudados indicando a quantidade de machos e de fêmeas coletados. Além disso, a presença de um maior número de indivíduos tanto para a família Psychodidae quanto para a subfamília Phlebotominae na cidade de Imaruí, provavelmente está relacionado ao fato de que essa cidade possui uma grande quantidade de vegetação ao seu entorno, mesmo nas áreas próximas do peridomicílio. Assim como em Tubarão, onde os espécimes de flebotomíneos encontrados foram na região próxima à mata urbana, corroborando assim os autores

31 31 que descrevem que a maioria das espécies de flebotomineos são essencialmente silvestres, porém tem sido encontradas em habitats rurais peridomésticos 5,6,9. Quando é feita a comparação entre os pontos de coletas (fonte alimentar animal, mata urbana e peridomicílio) e os espécimes coletados, pode-se observar que houve um maior número de indivíduos nos locais próximos à fonte alimentar animal em ambas as cidades (Figura 13). Figura 13 - Quantidade de espécimes coletados da família Psychodidae em relação aos pontos de coletas (fonte alimentar animal, mata urbana e peridomicílio) Este fato, possivelmente, se deve a diversidade de ecótopos que compõe os locais selecionados como fonte alimentar animal e aos hábitos ecléticos das espécies capturadas, uma vez que nesses pontos há a ocorrência de animais domésticos como cães, aves, suínos e bovinos. Já o ambiente peridomiciliar apresenta um maior grau de interferência humana o que provavelmente dificulta a adaptação de algumas espécies de flebotomíneos. Vale ressaltar que o peridomicílio das casas estudadas tem na sua maioria características rurais com a presença de animais domésticos e plantações de árvores frutíferas e grãos o que propicia um ambiente com refúgios e fonte alimentar para os flebotomíneos e a matéria orgânica necessária para o desenvolvimento das formas imaturas. Isto pode explicar a ocorrência dos registros de flebotomíneos nessa área, embora em baixa quantidade. As Figuras 14 e 15 mostram a comparação entre o número de espécimes da família Psychodidade e da subfamilia Phlebotominae coletados com relação às quatro estações do ano (outono, inverno, primavera e verão).

32 Ocorrência de Flebotomíneos 32 No intuito de encontrar outros fatores relevantes para a presença dos flebotomineos nas cidades estudadas, foram segregados os dados de várias formas para permitir análise e discussão. Quando se categorizou as estações do ano, foi observado que a família Psychodidae foi constante nas coletas, tendo um pico maior no outono e menor no inverno. Para os flebotomíneos, não houve a presença de nenhum espécime no inverno, sendo coletados apenas nas outras estações do ano. Figura 14 - Quantidade de espécimes coletados da família Psychodidae em relação às quatro estações do ano Outono Inverno Primavera Verão Macho Fêmea Figura 15 Ocorrência de flebotomíneos em relação às quatro estações do ano indicando a quantidade de machos e fêmeas.

33 Unidadde relativa (%) Temperatura (ºC) 33 No estado do Paraná, pesquisadores avaliaram a sazonalidade dos flebotomineos, demostrando que nas épocas quentes e úmidas do ano estes são capturados em maior número 52,53. Em outro estudo onde a autora aborta fatores geográficos e climáticos relacionados à distribuição de flebotomíneos, foi observado que no inverno foi à estação que mais houve captura de Lu. fischeri e o outono a estação que mais foi escassa a presença dessa espécie 54. A densidade populacional de flebotomíneos é passível de grande interferência pela variação das estações do ano 55,56. Em áreas tropicais, a população aumenta durante ou após períodos chuvosos, pois é a alta umidade resultante das primeiras chuvas que proporciona a eclosão das pupas 57. Por outro lado, usualmente se registra uma redução populacional durante longos períodos secos 56, resultando um complexo dependente de fatores bióticos, físicos e ambientais para encontrar esses insetos 59. A Figura 16 mostra os dados de umidade relativa do ar e de temperatura com relação à ocorrência de flebotomíneos, onde é possível observar que não houve diferença estatisticamente significativa entre eles. 100 R² = 0, Ocorrência de Flebotomíneos R² = 0, Ocorrência de Flebotomíneos Figura 16 Ocorrência de flebotomíneos em relação à umidade relativa do ar e a temperatura. Os locais considerados criadouros naturais desses insetos são muito difíceis de serem encontrados, assim como os adultos quando em áreas não endêmicas 60. Vale ressaltar que, segundo o SINAN, Santa Catarina apresentou nos últimos anos (2013 a 2015) confirmação de 16 casos de LTA e nenhum caso de LV e

34 34 especificamente o sul não apresentou nenhum registro de confirmação de casos de leishmaniose nesse período 4. O fato da região Sul do estado de Santa Catarina ter tido pouca ocorrência de flebotomíneos, pode explicar o baixo registro de notificação de casos leishmaniose, uma vez que a região Sul não é um local endêmico. Dessa forma o monitoramento constante das espécies circulantes é extremamente importante uma vez que, se perceber o aumento de espécies ou espécimes ao longo dos anos, deve-se atentar para métodos de controle que possam prevenir que o Sul de Santa Catarina se torne um local endêmico. Para verificação de infecção das fêmeas de flebotomíneos coletadas por protozoários do gênero Leishmania spp., foram utilizadas técnicas de análise molecular. Todas as nossas três amostras foram negativas, conforme apresentado na Figura 17. Provavelmente esse resultado tem relação com o fato do número baixo de amostras. Outro fator que contribui para falta de detecção do protozoário é que em áreas não endêmicas sua circulação é baixa. Figura 19 Gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, mostrando produtos amplificados pela PCR its1 de amostras das fêmeas capturadas: PM 100pb - peso molecular de 100pb.

35 35 A detecção do parasito no inseto geralmente é feita quando se encontra formas promastigotas (flageladas) no intestino médio do vetor. A pesquisa de flagelados no tubo digestório do vetor e a identificação da espécie do parasito, normalmente são realizadas por observação microscópica após dissecção ou tentativa de isolamento do agente proveniente de insetos em meios de cultura. Porém, fêmeas de flebotomíneos também são hospedeiras de algumas espécies de Trypanosoma e Endotrypanum, que podem comprometer o diagnóstico microscópico 61. No Brasil e outros países sul-americanos nas áreas endêmicas das leishmanioses, quando utilizado o método convencional os valores variam de 0,06% a 0,47%, enquanto que quando são utilizadas técnicas de biologia molecular a chance de identificar o parasito é maior, pois, essa técnica é bem sensível. Dias, avaliou a infecção natural de flebotomíneos por Leishmania spp. na cidade de Florianópolis através da técnica de PCR SSUrRNA e o mesmo obteve 413 espécimes fêmeas de flebotomíneos distribuídos nas seguintes espécies: Brumptomyia sp. Lu. (Pintomyia) fischeri, Lu. migonei e Lu. (Nyssomyia) neivai, entretanto dos 65 pools de fêmeas por espécie de flebotomíneo capturado, apenas 1 pool, o da espécie Lu.(Nyssomyia) neivai, apresentou- se positivo para Leishmania spp. 40. Portanto, deve-se levar em consideração que, a epidemiologia das leishmanioses está condicionada a presença de seus vetores (flebotomíneos) que podem transmitir o agente etiológico Leishmania spp. e a presença de hospedeiros e/ou reservatórios mamíferos silvestres e sinantrópicos 10. A grande diversidade de vetores, reservatórios e agentes influenciam nas mudanças dos padrões epidemiológicos das leishmanioses e a ação do homem sobre o meio ambiente também dificulta o controle da doença ². Estudos de caracterização clínica, biológica e epidemiológica são fundamentais para que possam ser elaboradas estratégias de ação e prevenção individualizadas, visto que os padrões de transmissão, espécies dos vetores, espécies de leishmanias, resposta ao tratamento podem apresentar-se de forma muito distinta em diferentes regiões. Logo, é muito importante que possamos compreender/conhecer quais espécies são circulantes em nossa área de estudo, pois esse conhecimento poderá embasar pesquisas posteriores.

36 36 5. CONCLUSÃO Nesse período foi possível comtemplar as quatro estações do ano, onde insetos da família Psychodidae foram coletados, destes houve a presença de duas subfamílias: Sycoracinae e de duas Phlebotominae Nos três municípios de Santa Catarina, Criciúma, Imaruí e Tubarão, onde foi realizado o estudo, houve a presença de duas espécies diferentes de flebotomíneos (Nyssomyia neivai e Pintomyia fisheri). Do total de sete espécimes de flebotomíneos coletados quatro foram para o município de Imaruí e 3 para o município de Tubarão. O habitat com maior prevalência de flebotomíneos foi no ponto de coleta próximo ao peridomicílio na cidade de Imaruí, seguido do ponto de mata urbana na cidade de Tubarão. Os flebotomíneos foram coletados na primavera, verão e outono quando houve temperaturas mais quentes não tendo a presença de nenhum espécime do inverno. Nas fêmeas dos espécimes obtidos não foi verificado a presença de infecção por protozoários do gênero Leishmania spp. 5.1 PERSPECTIVAS FUTURAS Como perspectiva futura pode-se sugerir que outros municípios do Sul de Santa Catarina sejam analisados para que se possa ter um panorama geral das espécies recorrentes e fazer uma comparação com as que já foram listadas para o estado. A utilização de outros métodos de coletas, além do que foi utilizado no presente estudo, também pode ser um aspecto a ser introduzido em trabalhos futuros, além de um período maior de tempo para a realização das mesmas.