Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública Sub-área : Abordagem Ecológica de Doenças Transmissíveis

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1 Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública Sub-área : Abordagem Ecológica de Doenças Transmissíveis Busca ativa de criadouros de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) na Ilha da Marambaia, Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Thaís Leal de Souza Rio de Janeiro 2014

2 i Busca ativa de criadouros de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) na Ilha da Marambaia, Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Thaís Leal de Souza Dissertação de Mestrado em Saúde Pública da Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca da Fundação Oswaldo Cruz. Orientadores: Dr. Fabiano Borges Figueiredo Dr. Marcos Barbosa de Souza Rio de Janeiro, 2014

3 ii Este trabalho foi realizado no Departamento de Ciências Biológicas (DCB) - Laboratório de Vetores Miguel Alves de Souza e Laboratório de Vetores do Campus da Fiocruz em Jacarépaguá, além do Laboratório de Dermatozoonoses (IPEC/Fiocruz), com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

4 iii Agradecimentos Primeiramente, agradeço Àquele a quem sempre recorro nos momentos de maiores dificuldades. À ele que me deu forças o tempo inteiro e não me desampara em nenhum momento de minha vida. Deus, obrigada! Ao orientador e amigo Marcos Barbosa de Souza, que desde o primeiro momento me abriu as portas e me acolheu, ajudando de coração, sem esperar algo em troca.ao querido orientador Fabiano Borges Figueiredo, que com muita paciência e carinho me amparou nos momentos difíceis. Ambos contribuíram para não só meu crescimento profissional, mas pessoal também. Obrigada pela confiança depositada. Aos meus pais, Rita de Cássia Gomes Henrique de Souza e Marcos Augusto Leal de Souza, meu porto seguro. Devo à eles tudo que sou, tudo que me tornei. Obrigada a tudo que me ensinaram e puderam me proporcionar. Amo-os demais. Ao meu noivo, Bruno Braga, por deter tanta paciência e me ajudar durante esses dois anos de mestrado. Por me ouvir, mesmo errada ou exagerada. Por mostrar que sou capaz e que sou a melhor bióloga do mundo. É você que me dá forças todos os dias para continuar. À minha família, tios, primos e avós, por entenderem minha ausência e confiarem tanto em mim. Em especial aos meus avós Maria de Lourdes Leal de Souza (in memorian) e Manoel Leal de Souza (in memorian). Vos dedico essa vitória. Ao meu querido amigo e fiel escudeiro nos trabalhos de campo, Adilson Benedito de Almeida. Sem ele eu realmente não sei se tudo isso se tornaria realidade. Obrigada por todo tempo dedicado, pelas risadas, pelo carinho e por ser, de graça, sempre tão prestativo. O mundo precisa de mais pessoas como você, meu amigo! A conquista também é sua. As minhas amigas Renata Albuquerque, Isadora Alonso, Stephanie Porthun e Thaíse Alves, por compreender toda a minha ausência e por me fornecer tantas risadas e momentos felizes que fazem com que meus problemas desapareçam. Amo vocês!

5 iv Ao meu amigo Carlos Eduardo (Cadu), por compartilhar experiências e me acalmar nos momentos difíceis. Por me fazer rir até do que não tem graça. Você é uma pessoa iluminada! Obrigada pela amizade. Aos meus amigos que fiz no mestrado, Denise, Maíra, Hugo, Ricardo, Jefferson, Carolzinha, Lívia (fiel escudeira de campo), Shênia, Amanda e a todos os outros que estão no meu coração, sou grata a todos vocês. Agradeço a Deus por ter me proporcionado conhecer pessoas tão maravilhosas. Aos meus queridos amigos de Itaipuaçú e demais amigos, que embora não estejam aqui, não são menos importantes. A toda equipe do Laboratório de Vetores, que sempre me acolheu, desde a época do estágio. Que sempre me ajuda com ensinamentos técnicos profissionais, mas que também me ajuda a crescer como pessoa. A cada flebotomíneo que eu identifico, é de vocês que eu me lembro. Agradeço também a toda equipe do Laboratório de Pesquisa Clínica em Animais Domésticos (Dermatozoonoses/IPEC). Pessoas que eu tive o prazer de conhecer e que pretendo manter em minha vida pessoal. A todos da secretaria do Departamento de Ciências Biológicas, DCB, da ENSP que estavam sempre a disposição para qualquer coisa que precisássemos! À Escola Nacional de Saúde Pública, minha escolha! À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo auxílio financeiro.

6 v "Na vida, não vale tanto o que temos, nem tanto importa o que somos. Vale o que realizamos com aquilo que possuímos e, acima de tudo, importa o que fazemos de nós!" (Chico Xavier)

7 vi Resumo As formas imaturas de flebotomíneos, vetores das Leishmanioses, desenvolvem-se em solos com características essenciais e ideais para seus ciclos vitais, como matéria orgânica, umidade, sombra e temperatura. Informações referentes aos potenciais criadouros naturais destes dípteros são fundamentais para compreensão da epidemiologia e ecologia das Leishmanioses. Este trabalho teve como objetivo localizar criadouros naturais de flebotomíneos na Ilha da Marambaia, com o auxilio de armadilhas de emergência e busca direta das formas imaturas, através da técnica de flutuação com solução saturada de açúcar em substratos orgânicos da região, além de coletas com armadilhas luminosas do tipo CDC. A armadilha de emergência utilizada neste trabalho foi uma armadilha adaptada e composta por uma bacia de plástico escura na base e potes coletores transparentes na parte superior. Estas permaneceram no ambiente durante 12 meses, o substrato para processamento na solução saturada de açúcar foram coletados nos 6 primeiros meses e as armadilhas luminosas do tipo CDC nos últimos 6 meses. Ambas as metodologias utilizadas para a busca de criadouros foram eficazes, com um total de 42 exemplares de 6 espécies distintas, capturadas pelas armadilhas de emergência e, 5 formas imaturas obtidas através da técnica de flutuação com solução saturada de açúcar. Vale ressaltar que foram capturadas espécies de importância epidemiológica, em ambas as armadilhas, pois participam do ciclo de transmissão das Leishmanioses, sendo elas Lutzomyia intermedia e L. migonei. Apesar da necessidade de estudos futuros, principalmente no que se refere à ecologia e biologia das formas imaturas, foi possível concluir que a Ilha da Marambaia, mais especificamente a região da Vacaria, apresentam condições favoráveis ao desenvolvimento de criadouros de flebotomíneos, uma vez que possuem cobertura conferida por árvores e presença de serapilheira, fatos estes que podem proteger as formas imaturas. Estas condições devem ser consideradas, uma vez que, estão presentes na maioria dos peridomicílios na Ilha da Marambaia e de ambientes rurais no geral. Palavras-chaves: criadouros, flebotomíneos, formas imaturas, armadilhas de emergência, leishmaniose

8 vii Abstract The immature sandflies, vectors of Leishmaniasis, develop in soils with essential and ideal characteristics for their life cycles, such as organic matter, moisture, shade and temperature. Information regarding the potential breeding places of these dipterans is fundamental to understand the epidemiology and ecology of Leishmaniasis. This study aimed to find natural breeding sites of sandflies in Marambaia Island, with the aid of emergence traps and direct search of immature stages through the flotation technique in saturated sugar solution in organic substrates in the region, in addition to collections with traps light of the CDC. The emergence trap used in this work was a trap adapted and consisting of a bowl of dark plastic base and transparent collectors pots on top. These remained in the environment for 12 months, the substrate processing in the saturated sugar solution were collected in the first 6 months and CDC light traps in the last 6 months. Both methods used to search for breeding sites were effective, with a total of 42 samples of 6 different species caught in the emergence traps, and 5 immature stages obtained by flotation technique with saturated sugar solution. It is noteworthy that species of epidemiological importance were caught in both traps, for participating in the transmission cycle of Leishmaniasis, which were Lutzomyia intermedia and L. migonei. Despite the need for further studies, particularly in relation to the ecology and biology of the immature stages, it was concluded that the Marambaia Island, more specifically the region of Vacaria, present favorable to the development of sandfly breeding sites conditions, since they have coverage afforded by the presence of trees and litter, facts that may protect the immature stages. These conditions should be considered, since they are present in most peridomestic on Marambaia Island and rural environments in general. Keywords: breeding sites; phlebotomine sand flies; immature forms; emergence traps; leishmaniasis

9 viii Sumário 1 INTRODUÇÃO PRESSUPOSTOS TEÓRICOS As leishmanioses Agente etiológico Os flebotomíneos Criadouros Ilha da Marambaia JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Atividades desenvolvidas Área de estudo Trabalho de campo Armadilhas de emergência Busca direta de formas imaturas Armadilhas luminosas do tipo CDC Trabalho laboratorial... 28

10 ix Armadilhas (emergência e CDC) Busca direta de formas imaturas Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Artigo científico CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS APÊNDICES Algumas armadilhas de emergência na área de estudo: (a) Ponto1; (b) Ponto Armadilhas luminosas do tipo CDC no campo: (a,b) Ponto 1; (c,b) Ponto Coleta do solo no perímetro das armadilhas de emergência Processo das amostras de solo na solução saturada de açúcar: (a) amostra do solo em solução saturada de açúcar; (b) amostra do solo em álcool 70% após o processamento na solução saturada de açucar; (c) material triado Formas imaturas de flebotomíneos obtidas através da solução saturada de açúcar: (a) larva de 2º estádio; (b) larva de 4º estádio; (c) pupa

11 x Lista de Tabelas Tabela 1: Frequência das espécies e dos sexos dos flebotomíneos capturados pelas armadilhas de emergência em cada Ponto de coleta (P1 e P2), ao longo de 12 meses (agosto de 2012 a julho de 2013) Tabela 2: Frequência das espécies e dos sexos dos flebotomíneos capturados pelas armadilhas luminosas do tipo CDC em cada Ponto de coleta (P1 e P2), ao longo dos últimos 6 meses de trabalho Tabela 3: Frequência das espécies e dos sexos dos flebotomíneos capturados de maneira concomitante tanto pelas armadilhas de emergência (A.E.) quanto pelas armadilhas luminosas do tipo CDC nos dois Pontos de coleta, ao longo dos últimos 6 meses de trabalho

12 xi Lista de Figuras Figura 1: Mapa mundial das áreas endêmicas de leishmaniose cutânea e visceral, atualizado em Mapa adaptado a partir de mapas da Organização Mundial da Saúde, Figura 2: Ciclo biológico do parasito Leishmania spp., com sintomatologia geral para Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Cutânea (LC). Adaptado de Organização Mundial da Saúde, Figura 3: Sistematização do ciclo biológico do flebotomíneo (fora de escala). Adaptado dos Relatórios Técnicos da Organização Mundial da Saúde (2010) Figura 4: Fluxograma das atividades desenvolvidas na região da Vacaria, Ilha da Marambaia Figura 5: Localização da Ilha da Marambaia e dos municípios limítrofes. Adaptado de Souza (2007) Figura 6: Visão panorâmica da região conhecida como Vacaria, administrada pela Marinha do Brasil, situada a Noroeste da Ilha da Marambaia. Fonte: Google Earth Figura 7: Ponto 1, caracterizado como borda de mata, porém com antropização significativa, pois está localizado próximo a uma trilha por onde passam militares, visitantes e moradores da região Figura 8: Ponto 2, também caracterizado como borda de mata, porém menos antropizado quando comparado ao Ponto 1, uma vez que é neste Ponto que inicia-se a mata na região da Vacaria Figura 9: Armadilha de emergência utilizada no presente estudo. Esta armadilha é uma adaptação da armadilha confeccionada por Casanova (2001) Figura 10: Abertura dos 3 tipos de malhas que foram utilizadas para o processo de lavagem e filtragem do substrato para a busca de formas imaturas de flebotomíneos. (a) ilustração da maior malha (0,5 cm); (b) ilustração da

13 xii malha intermediária (0,2 cm); (c) ilustração da malha mais fina, na qual todo o material é retido e armazenado em álcool 70%

14 1 1 INTRODUÇÃO Os flebotomíneos são insetos de grande importância na saúde pública, pois são responsáveis pela transmissão das leishmanioses. O controle dessas doenças parasitárias é de difícil implementação, visto que estas apresentam inúmeros fatores epidemiológicos e ambientais que as influenciam. O conjunto de informações referentes à ecologia e biologia dos flebotomíneos permite apontar características relevantes para o planejamento de medidas de controle das leishmanioses 1. A natureza dos criadouros de flebotomíneos ainda não é bem definida 2, mas se reconhece sua importância para a compreensão da dinâmica populacional de insetos adultos de uma determinada região 1. As formas imaturas de flebotomíneos se desenvolvem ao nível de solo e este deve apresentar características essenciais ao desenvolvimento das mesmas, como matéria orgânica, temperatura, sombra e umidade 3. Existem poucos trabalhos publicados com relação aos criadouros de flebotomíneos, principalmente quando se considera o número de formas imaturas coletadas 2, mesmo que estes não tenham economizado esforços durante a sua realização. A busca de formas imaturas, em sua maioria, é realizada de forma indireta, com o auxílio de armadilhas de emergência, assentadas no solo. Essas armadilhas são fixadas em substratos de interesse, sendo estas capazes de capturar insetos adultos que ali eclodem. Existem variações de formas, tamanho e estruturas, adaptadas por autores ao longo dos anos, mas as armadilhas, mesmo diferentes, apresentam o mesmo objetivo 4. Outra técnica empregada para a localização de criadouros é a busca direta de formas imaturas com o auxílio de solução saturada de açúcar, proposta por Hanson (1961) 5. As amostras processadas por essa solução tem seu conteúdo separado com base na densidade, permitindo assim que as formas imaturas de insetos ou outros artrópodes que vivem no solo fiquem localizadas no sobrenadante da solução.

15 2 Esse trabalho teve como objetivo principal caracterizar microambientes na Ilha da Marambaia capazes de fornecer condições favoráveis ao desenvolvimento e sucesso de criadouros de flebotomíneos. A Ilha da Marambaia encerra a Baía de Sepetiba, litoral sul do estado do Rio de Janeiro e pertence ao município de Mangaratiba. É uma área administrada pelas Forças Armadas do Brasil, que exercem atividades de treinamento, além de receber militares de diversas áreas do Brasil e do mundo. A Ilha da Marambaia foi escolhida como área de estudo por conta de uma parceria entre a Marinha do Brasil e a Fundação Oswaldo Cruz/RJ. Esta localidade apresenta uma variada fauna flebotomínica, assim como densidad e significativa desses dípteros 6. Sendo assim, uma região conhecida como Vacaria foi monitorada durante 12 meses (agosto de 2012 julho de 2013), com o auxílio de armadilhas de emergência, análise do solo pela técnica de flutuação com solução saturada de açúcar e armadilhas luminosas do tipo CDC. Vale lembrar que, esta região apresenta características chaves para o desenvolvimento das formas imaturas de flebotomíneos, como presença de matéria orgânica, umidade e sombra 3, assim como alta densidade de insetos adultos 6 e fonte alimentar para as fêmeas. Outros trabalhos também partiram da alta concentração de flebotomíneos para realizar a busca por formas imaturas 5,7,8,9, assim como a presença de condições essenciais ao desenvolvimento das formas imaturas. Além disso, nada se conhece a respeito dos criadouros de flebotomíneos na Ilha da Marambaia. A diversidade de espécies do gênero Leishmania, protozoários incriminados na transmissão das leishmanioses, assim como a variedade e biologia dos flebotomíneos, as adversas situações epidemiológicas, tanto em regiões prevalentes como em regiões incidentes e com um agravante de tendência à urbanização, vem mostrando a necessidade de diferentes estratégias para o controle dessas zoonoses 10. Diante disso, este trabalho vem com a proposta de contribuir com informações importantes para a compreensão da dinâmica da fauna flebotomínica na Ilha da Marambaia, principalmente no que se refere à características inerentes aos criadouros em ambientes antropizados. Este trabalho está organizado em nove capítulos. No início, consta a Introdução com informações gerais sobre o trabalho, o problema central e a

16 3 justificativa para o desenvolvimento do trabalho. No segundo capítulo está a base teórica de fundamental importância para a compreensão do problema estudado, como a biologia dos flebotomíneos e a natureza de seus criadouros. A seguir, no terceiro capítulo a justificativa e a relevância do estudo é aprofundada, incluindo características da região escolhida para análise. O quarto capítulo fornece os objetivos do estudo e em sequência, o quinto capítulo apresenta, detalhadamente, a metodologia desenvolvida e sua fundamentação. Os resultados e a discussão, apresentam-se em formato de artigo, submetido à revista Acta Tropica no capítulo seis. O sétimo capítulo contempla a conclusão e as referências bibliográficas utilizadas estão apresentadas no penúltimo capítulo. O último capítulo é destinado aos apêndices, que possuem fotos da metodologia, desenvolvimento do trabalho de campo e resultados, fotos essas que não puderam ser apresentadas no artigo.

17 4 2 PRESSUPOSTOS TEÓRICOS 2.1 As leishmanioses As leishmanioses encontram-se entre as seis endemias mais prevalentes no mundo. Ainda hoje é uma das doenças mais negligenciadas no mundo inteiro e ocorre principalmente em países pobres, em processo de desenvolvimento 11. Segundo a Organização Mundial da Saúde (2010) 11, aproximadamente 350 milhões de pessoas encontram-se sob risco de contrair leishmaniose, com 2 milhões de novos casos anualmente. Segundo o Ministério da Saúde (2010) 12,13, as leishmanioses são zoonoses que podem acometer seres humanos e animais domésticos quando estes entram em contado com o ciclo de transmissão do parasito, através da picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas. Além disso, são doenças com crescente importância epidemiológica por conta da sua tendência à urbanização, influenciada não só por fatores de riscos ambientais, como desmatamento, migrações e mudanças climáticas, mas também aos fatores particulares dos indivíduos, como co-infecções, influências imunológicas, desnutrição e e fatores genéticos 14. Os fatores de risco para infecção em áreas urbanas estão provavelmente associados às condições de moradias, presença de animais e a probabilidade de contato com o inseto vetor, fruto das características que o ambiente favorece para esses artrópodes e fonte alimentar para os mesmos 15. Essas doenças são causadas por parasitas pertencentes ao gênero Leishmania da família Trypanosomatidae 12,13. Tais protozoários possuem ciclos silvestres ou peridomésticos e, por conta disso, existe o risco ao ser humano e aos animais domésticos 16. Por apresentarem características epidemiológicas e clínicas diferentes, recebem nomenclaturas distintas, como leishmaniose cutânea, leishmaniose cutâneo-mucosa ou leishmaniose mucocutânea, leishmaniose cutânea difusa e leishmaniose visceral ou calazar. As leishmanioses cutâneas são benignas

18 5 quando tratadas corretamente, enquanto que as leishmanioses viscerais podem apresentar alta letalidade. Essas doenças são endêmicas em partes da África, Índia, Oriente Médio, sul da Europa, América Central e América do Sul (Figura 1) 17. Figura 1: Mapa mundial das áreas endêmicas de leishmaniose cutânea e visceral, atualizado em Mapa adaptado a partir de mapas da Organização Mundial da Saúde, Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que determinam alterações do sistema fagocítico mononuclear (SFM). Estes possuem duas formas principais em seu ciclo biológico: promastigota e amastigota. A forma promastigota é alongada e flagelada enquanto a forma amastgota um flagelo rudimentar e são parasitas intracelulares obrigatórios, altamente infectantes. Quando o vetor artrópode realiza o repasto sanguíneo em um hospedeiro mamífero infectado, formas amastigotas são transmitidas e, no trato digestivo desses dípteros, desenvolvem-se em formas promastigotas. Durante o período do ciclo em que essas formas promastigotas extracelulares permanecem no interior do trato digestivo do vetor, se diferenciam em formas promastigotas metacíclicas, essas sem a capacidade replicativa mas altamente infectantes. São

19 6 essas formas as responsáveis pela infecção inicial no hospedeiro vertebrado, quando o vetor infectado realiza um novo repasto sanguíneo. Uma vez dentro dos hospedeiros, as formas promastigotas metacíclicas podem ser fagocitadas por células do SFM, dentro das quais as formas promastigotas transformam-se em amastigotas. Quando um vetor realiza o repasto sanguíneo nesse hospedeiro infectado, ele é capaz então recomeçar o ciclo (Figura 2) 17,18,19. Figura 2: Ciclo biológico do parasito Leishmania spp., com sintomatologia geral para Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Cutânea (LC). Adaptado de Organização Mundial da Saúde, A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) ocorre em todo o território brasileiro 13. Caracterizada por lesões cutâneas ou mucosas que podem ser simples ou múltiplas, com caráter extensivo ou com tendência a metástase 20, essa doença ocorre no município do Rio de Janeiro desde o início do século XX 21, assim como em outros Estados do país 22,23. É reconhecida a predominância de seu principal vetor, Lutzomyia intermedia 21,24, em todas as áreas endêmicas do Estado do Rio de Janeiro 25,26. A Leishmaniose Visceral é caracterizada pela invasão de órgãos mais profundos, depois que os protozoários já colonizaram a pele, fato atribuído à necessidade das espécies responsáveis pela doença de temperaturas um pouco mais elevadas para seu desenvolvimento (37ºC). Órgãos como fígado, baço,

20 7 medula óssea, nódulos linfáticos (órgãos ricos em células do SFM), além de rins, pulmão, intestino e pele são tomados pelas formas amastigotas de Leishmania. Assim, os indivíduos doentes podem apresentar esplenomegalia, hepatomegalia, alterações de medula óssea, anemia e imunossupressão, por conta da hipertrofia e hiperplasia de células do SFM 20. O primeiro caso autóctone de LV em humano no município do Rio de Janeiro foi notificado em 1977, na área periurbana da zona norte da cidade 27 e seu principal vetor, Lutzomyia longipalpis, registrado pela primeira vez no litoral sul do estado 28. Entre 1997 e 2003, foram diagnosticados 17 novos casos humanos, também autóctones 29. Essa doença era considerada primariamente silvestre e com características rurais, mas mudanças nos padrões sócioambientais e migrações das periferias para as cidades de pessoas e animais de áreas endêmicas são apontadas como promotoras no quadro epidemiológico da LV, com ocorrência de casos em regiões urbanas 30. A Leishmaniose Visceral (LV) destaca-se em relação à LTA, pois pode se tornar fatal quando o tratamento for negligenciado 14.

21 8 2.2 Agente etiológico A classificação das espécies do gênero Leishmania está diretamente ligada ao modo como se desenvolvem no trato digestivo dos vetores, permitindo a divisão desses em três grupos: o primeiro compreende as espécies que se desenvolvem no intestino posterior do inseto e, em sua maioria, são espécies primitivas registradas em lagartos no Velho Mundo; no segundo, o desenvolvimento no intestino posterior é mantido, porém o parasito pode migrar para outras regiões do trato digestivo. A maioria das espécies encontra-se distribuída na terceira secção, onde os parasitas se desenvolvem somente no intestino médio e estômago. São nessas últimas duas secções onde é possível encontrar as espécies que infectam seres humanos e animais domésticos 19. No Brasil, as três principais espécies de Leishmania responsáveis pela Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) são L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (Leishmania) amazonensis 13. Estudos mais recentes apontam as espécies L. (V.) lainsoni, a L. (V.) naiffi e L. (V.) shawi como novos agentes de leishmaniose 31. A Leishmaniose Visceral (LV) possui como agente etiológico somente uma espécie de Leishmania, a Leishmania (Leishmania) chagasi, nas Américas 32. Entretanto, já era descrito L. infantum como agente etiológico da LV e a polêmica em torno da nomenclatura a ser utilizada iniciouse quando Cunha e Chagas (1938), citado por Dantas-Torres (2006) 33, descreveram L. chagasi como nova espécie responsável pela doença, de acordo com variações bioquímicas entre os parasitas encontrados na Europa e nas Américas 33. Ainda hoje, alguns autores separam ambas as espécies de acordo com características fenotípicas e genotípicas, considerando-as como subespécies 34, sem distinção entre ambas 35 ou que ainda deve prevalecer as normas de nomenclatura, sendo L. infantum a forma correta de se nomear este protozoário 33. Por outro lado, alguns estudos taxonômicos por isoenzimas ou biologia molecular apontam para o conceito de que ambas as espécies são indistinguíveis 33.

22 9 2.3 Os flebotomíneos Os flebotomíneos são insetos pertencentes ao Filo Arthropoda, Classe Hexapoda, Ordem Diptera, Família Psychodidae, Subfamília Phlebotominae. A Subfamília Phlebotominae abrange insetos importantes na transmissão de diferentes espécies de Leishmania 3 e por isso, possuem grande importância na Saúde Pública. Vale ressaltar que os gêneros de importância médica são Phlebotomus, na Europa, África e Ásia e Lutzomyia, nas Américas, dentre as mais de 800 espécies descritas 36. Em 2003, Galati descreveu, nas Américas, 22 gêneros de flebotomíneos, de acordo com diversos aspectos taxonômicos, principalmente voltados para os apêndices, dividindo o gênero Lutzomyia. Entre eles estão: Nyssomyia, Migoneimyia, Lutzomyia e Pintomyia 37. No Brasil, segundo atualizações do Ministério da Saúde, as espécies com maiores competências vetoriais de LTA são: Lutzomyia flaviscutellata, L. whitmani, L. umbratilis, L. intermedia e L. migonei. Outras espécies como L. neivai e L. fisheri são frequentemente encontradas em áreas endêmicas, porém ainda não são incriminadas na transmissão do parasito. Até o momento, as espécies de flebotomíneos L. longipalpis e L. cruzi estão relacionadas com a transmissão de LV, sendo essa última recentemente incriminada no estado do Mato Grosso do Sul 38. Rangel e Lainson (2003) 16 afirmam que, no Brasil, 19 espécies são suspeitas ou incriminadas de transmitir Leishmania spp. e capazes de infectar humanos. É reconhecida a ampla distribuição de L. intermedia, que vai desde o estado do Piauí até o do Rio Grande do Sul, além de percorrer o litoral do Brasil até o norte da Argentina e sul da Bolívia, ocorrendo em áreas de clima e altitude bastante variados 39. Antes, L. neivai e L. intermedia eram consideradas sinônimas, mas diferenças taxonômicas das espermatecas e seus dutos as diferem e hoje, ambas constituem o complexo L. intermedia 40. A abundância de L. intermedia em áreas endêmicas de LTA no estado do Rio de Janeiro é conhecida e estudos demonstram que esta espécie pode ser encontrada tanto

23 10 dentro das casas como no peridomicílio, revelando sua capacidade de adaptação à ambientes antropizados 41,42. L. flaviscutellata e L. umbratilis distribuem-se principalmente na região da floresta Amazônica 3,43,44. Porém, existem registros de ambas em alguns estados do Nordeste do Brasil, incluindo áreas endêmicas de LTA 45,46,47,48. A espécie L. whitmani é mais frequente em florestas e matas residuais, mas sua presença já é significativa no peridomicílio 49,50 e dentro das casas 46. Teodoro e colaboradores (1998) 50 sugerem que essa espécie apresenta amplo hematofagismo, mesmo dentro do perímetro urbano. Acredita-se também que esta espécie desempenha sazonalidade em alternância com L. intermedia no estado do Rio de Janeiro, sendo L. whitmani mais comum no inverno e L. intermedia mais comum no verão, contribuindo para ampliar o risco de infecção durante o ano 51. Assim como L. intermedia, a espécie L. migonei também é encontrada no peridomicílio e dentro das casas, às vezes predominante em abrigos de animais, como galinhas 42,52. Souza e colaboradores (2003) 29 em inquérito entomológico em áreas endêmicas de LV no município do Rio de Janeiro constataram que ambas as espécies são abundantes mesmo em áreas endêmicas de LV e com ausência do principal vetor incriminado por transmitir tal doença. Também na Ilha da Marambaia, município de Mangaratiba, Rio de Janeiro, L. intermedia e L. migonei apresentam densidades bastante elevadas 6. Além disso, L. migonei, que já é incriminada como vetora de LTA, foi encontrada naturalmente infetada por Leishmania chagasi em Pernambuco por Carvalho e colaboradores (2010) 53, sugerindo sua participação também no ciclo de transmissão da LV. O principal vetor da LV, L. longipalpis, apresenta ampla distribuição geográfica, abrangendo as Américas Central e do Sul 3. Pode adaptar-se a diferentes ecótopos para a oviposição, como foi observado em currais no Nordeste do Brasil e, da mesma maneira, usar tais locais de abrigo para as formas adultas, principalmente espaços entre pedras, grutas e troncos ocos de árvores 54. Este vetor apresenta atividade, tanto intradomiciliar como extradomiciliar, ressaltando sua capacidade de adaptação à ambientes antrópicos 54,55,56,57 e, segundo Barata e colaboradores (2005) 58, é um espécie

24 11 oportunista, pois realiza o repasto sanguíneo em diversas espécies de vertebrados. A espécie L. cruzi, também incriminada por transmitir Leishmania 16,38, pode coexistir com L. longipalpis 59, mas acredita-se que L. cruzi tenha preferência por regiões de cerrado 59,48. A biologia de cada espécie de flebotomíneo é única e complexa, por conta de seus aspectos de reprodução, alimentação, dispersão e outras atividades relacionadas diretamente com a epidemiologia das leishmanioses 11. De acordo com a literatura, os fatores climáticos como temperatura, umidade e pluviosidade influenciam de modo variável na densidade de flebotomíneos adultos, dependendo da região analisada 3,60,58,61. As formas imaturas de flebotomíneos adquiriram o hábitat terrestre como local de desenvolvimento, característica relacionada às fontes de matéria orgânica em decomposição. Dá-se o nome de criadouro aos locais onde, dípteros no geral, fazem a postura de seus ovos 3. O ciclo de vida dos flebotomíneos está esquematizado na Figura 3. \ Figura 3: Sistematização do ciclo biológico do flebotomíneo (fora de escala). Adaptado dos Relatórios Técnicos da Organização Mundial da Saúde (2010) 11.

25 12 Os ovos de flebotomíneos não apresentam mobilidade e a oviposição é realizada em locais com características especiais para o desenvolvimento larval. A oviposição é realizada de maneira individual ou em pequenos conjuntos, que permanecem aderidos ao substrato durante a incubação. O tempo de incubação pode variar de acordo com a espécie e com diversos fatores externos. A eclosão ocorre no período noturno e a diapausa, parada do desenvolvimento até que o ambiente apresente condições ideais para a eclosão, parece fazer parte do fenômeno de desenvolvimento do embrião 3. Além disso, a umidade atmosférica é necessária para o sucesso da eclosão 62. As larvas apresentam quatro estádios e se diferenciam morfologicamente, principalmente no tamanho e número de cerdas caudais. Assim como os ovos, não resistem à dessecação, necessitando, desta maneira, de criadouros úmidos para o desenvolvimento. Após o endurecimento da quitina, as larvas se locomovem com movimentos ondulatórios, de maneira semelhante às larvas de lepidópteros, característica proporcionada graças à pseudopernas existentes na face ventral dos segmentos abdominais. Sua atividade parece aumentar com seu desenvolvimento e está associada com a procura de alimento, que se compõe basicamente de matéria orgânica no geral. No período de um ou dois dias que precedem a pupação, as larvas deixam de se alimentar e sob o ponto de vista morfológico, após escolha de um suporte sólido, inicia-se um processo de entumescimento e os segmentos corporais passam a ser menos evidentes 3. Aparentemente, as larvas de último estádio resistem mais à seca, porém não resistem por um longo tempo à submersão completa assim como as pupas 62. Na natureza, os ovos desenvolvem-se num período de 7-10 dias, assim como as pupas. As larvas desenvolvem seus 4 estádios em aproximadamente 3 semanas 63. A partir de observações em laboratório, sabe-se que o ciclo de vida dos flebotomíneos pode variar em função da temperatura e que o ciclo gonotrófico (tempo que decorre entre o repasto sanguíneo e a oviposição) normalmente não é inferior a 6 semanas 63. As fases imaturas são sensivelmente afetadas pelo excesso ou escassez de umidade e assim como nos adultos são influenciados pela temperatura, o que pode levar a taxas significativas de mortalidade 64.

26 13 Os flebotomíneos machos, assim como outros dípteros, apresentam rotação de 180º da genitália nas primeiras horas de vida, característica importante para interpretar resultados referentes aos criadouros e reprodução desses dípteros 65. Após a oviposição, as fêmeas morrem ou não resistem por mais de 24 horas 66,67,64, Criadouros O estudo de potenciais criadouros dos vetores das Leishmanioses sempre foi de fundamental importância para o conhecimento da ecologia e epidemiologia da doença. A procura de formas imaturas não deve ser considerada como uma abordagem prática e direta de controle da doença, porém é de fundamental importância conhecer a dinâmica e densidade da população de vetores de uma região 1. O Ministério da Saúde preconiza, dentro das medidas de controle, que se realize a manipulação do solo: limpezas periódicas dos terrenos e rodízio de pocilgas, canis, galinheiros e currais 69. Apesar da importância das Leishmanioses, os trabalhos realizados em torno dos criadouros naturais de flebotomíneos apresentam resultados insatisfatórios em relação ao número de imaturos coletados. Ainda existem poucos trabalhos científicos que possam somar informações claras nesse aspecto, fato atribuído principalmente às dificuldades de extração e localização dos imaturos 2,3. Vale ressaltar que a maioria dos trabalhos voltados para estudos da fauna flebotomínica apresentam como objeto de estudo os insetos adultos. Alguns trabalhos dessa natureza sugerem a presença ou não de criadouros, dependendo da densidade populacional, sem buscar a localização das formas imaturas 70,71,57. Durante as duas décadas iniciais do século XX, trabalhos foram realizados com o objetivo de localizar os locais onde os flebotomíneos fazem a oviposição 4, nos quais os esforços foram voltados para a detecção de ovos e formas imaturas desses vetores, seja por busca direta de hábitats naturais em potencial para criadouros, através de formas imaturas 5 ou pela busca indireta através de adultos jovens, com armadilhas de emergência 72.

27 14 As características inerentes ao crescimento das formas imaturas inferem diretamente na análise deste estudo. Fatores físicos e químicos parecem influenciar o desenvolvimento e sucesso das larvas, como a disponibilidade de alimento, temperatura, iluminação e umidade 3. A distribuição das espécies de flebotomíneos também encontra-se relacionada com as características geográficas e hidrológicas dos solos, influenciando diretamente na escolha dos locais de criadouros pelas fêmeas no momento da oviposição 60. Rutledge e Ellenwood (1975) 60 sugerem que a sazonalidade dos flebotomíneos está relacionada com os padrões de distribuição das chuvas que agem modificando as condições dos criadouros no solo. Feliciangeli (2004) 4 aponta, em uma revisão bibliográfica, algumas metodologias utilizadas em diferentes trabalhos realizados com o objetivo de localizar formas imaturas (busca direta) e de adultos recém emergidos do solo (busca indireta), revelando assim, potenciais criadouros desse inseto. Das técnicas mencionadas, a mais utilizada para a busca indireta é a armadilha de emergência. Kellick-Kendrik (1999) 63 sugeriu que as fêmeas de flebotomíneos não fazem a oviposição indiscriminadamente, como outros dípteros, realizando tal ciclo vital em lugares específicos que favoreçam o desenvolvimento das larvas. Tanto os adultos como as formas imaturas apresentam comportamentos associados às condições do ambiente. Ferreira e colaboradores (1938) 72, registraram flebotomíneos translúcidos e com dificuldades no vôo, próximo a folhas secas no solo de floresta no estado do Pará, levantando a hipótese de que esses indivíduos tinham eclodido recentemente. Com coleta de material do solo, próximo às raízes, esse trabalho também registrou ovos no solo, próximo à base das árvores. Os ovos, que totalizaram 47 exemplares, foram colocados em papel filtro umedecidos em placas de Petri para que se desenvolvessem. Depois de 6 dias, larvas foram observadas e evoluíram normalmente até a fase adulta, totalizando 44 dias de evolução. Este parece ter sido o primeiro registro de formas imaturas de flebotomíneos na natureza no continente Americano 54.

28 15 Deane e Deane (1957) 54 desenvolvera um trabalho e nele objetivaram localizar formas imaturas e lugares de abrigos de flebotomíneos no sertão semiárido do Brasil, estado do Ceará. Os autores afirmam que em estações chuvosas os criadouros tornam-se mais numerosos e este fato pode dificultar os trabalhos que possuem como objetivo localizar lugares de desenvolvimento de formas imaturas de flebotomíneos. Desta forma, as estações mais secas podem demarcar melhor esses lugares, facilitando sua descoberta, pois reduzem os locais úmidos e sombreados, como casas, abrigos para animais, solo próximo às árvores, serrapilheira, grutas, espaços entre raízes, entre outros. Partindo desses pontos, a equipe optou por uma região onde a densidade de insetos adultos era considerável e demarcou os locais que apresentavam características bióticas e abióticas propícias, utilizando armadilhas de emergência e busca direta no substrato por formas imaturas, totalizando 32 formas imaturas de flebotomíneos: 19 de L. longipalpis, 9 de L. oswaldoi, 1 de L. cortelezzii e 3 exemplares não identificados. Um trabalho que merece destaque foi realizado por Hanson (1961) 5 no Panamá. Com um total de larvas, este trabalho consistiu na busca intensiva e prolongada com base em uma técnica na qual todas as formas imaturas são capturadas, independente da busca por emergência dos insetos, quer seja em laboratório ou no campo. Esta técnica apreesenta algumas vantagens em relação à busca direta das formas imaturas no solo, visto que reduz a quantidade de material excedente, como folhas, pedras e terra. As amostras são processadas em uma solução saturada de açúcar de modo que partículas mais densas do solo se depositam no fundo do recipiente, e os componentes menos densos, assim como as formas imaturas dos flebotomíneos, flutuam. O sobrenadante é recolhido com peneiras de malha fina, para evitar a perda dos ovos, larvas e pupas e analisado posteriormente para a contagem dos mesmos. Casanova (2001) 73 testou uma armadilha de emergência por ele adaptada em duas áreas rurais e endêmicas de Leishmaniose, localizadas em Mogi Guaçú, estado de São Paulo. Desta maneira, os insetos quando eclodem são atraídos pela luz do ambiente e ficam presos na estrutura superior da armadilha. O trabalho foi realizado de abril à novembro de 1999 e o período no qual as

29 16 armadilhas permaneciam e a troca da gaze variou de 14 a 39 dias. No final desses meses, o estudo revelou 73 formas aladas capturadas nas armadilhas de emergência: 41 machos e 7 fêmeas no peridomicílio e 11 machos e 14 fêmeas em solo de floresta, sendo L. intermedia o flebotomíneo mais frequente. Alencar (2007) 2 desenvolveu seu trabalho também com o intuito de localizar criadouros desses dípteros, utilizando uma armadilha composta de duas partes principais: uma inferior com uma armação metálica de estrutura piramidal, coberta por um tecido semitransparente de náilon, e uma superior, formada por um aparato composto por dois potes de plástico e um funil. Nesta estrutura, os insetos ficam presos e conservados em álcool 96%, ácido acético 10% e caulim. As armadilhas foram instaladas em trilhas de chão de floresta no estado do Amazonas e o trabalho realizado durante um ano. Ao final do estudo foram contabilizados 27 exemplares, distribuídos em 9 espécies, sendo L. umbratilis a mais frequente. Feitosa (2009) 7 localizou 4 larvas de flebotomíneos dentro de três casas por busca direta, no município de Santarém, Pará, associando tal achado como agravante para a transmissão das leishmanioses. Müller e colaboradores (2011) 8 através de armadilhas adaptadas à troncos de árvores em 16 microambientes de um oásis no deserto de Israel, pôde localizar locais de abrigo de flebotomíneos, que encontravam-se descansando em maior densidade em troncos de palmeiras. Flebotomíneos também foram capturados através de armadilhas de emergência nesses mesmos locais. A associação de locais de abrigo com criadouros, mesmo que em ecótopos distintos é apontado pelo autor como produto da condição semiárida do ambiente de deserto, onde as condições ótimas para o desenvolvimento de adultos e formas imaturas encontram-se mais restritas no ambiente. Em 2011, no estado da Bahia, Sangiorgi e colaboradores (2011) 9 realizaram um trabalho em 3 anos, na qual não foram utilizadas armadilhas de emergência, sendo a busca ativa através da técnica de flutuação 5 seu principal método para a coleta das formas imaturas, totalizando ao término do estudo 64 imaturos de 1757 amostras de solo de diferentes microambientes.

30 Ilha da Marambaia A Ilha da Marambaia é considerada reserva biológica e apresenta relevo e vegetação bastante variados. Áreas de praias, matas de encosta, restinga e mangues podem ser encontrados ao longo da ilha. Conecta-se com o continente através de uma faixa estreita de areia com cerca de 40 km de extensão, a leste, com a região de Guaratiba 74. Além disso, é uma localidade que recebe constantemente militares regiões endêmicas de leishmanioses, como por exemplo, outros estados do Brasil. Composta por relevo montanhoso, a Ilha da Marambaia resguarda parte significativamente preservada de Mata Atlântica no estado do Rio de Janeiro. Sua vegetação é caracterizada basicamente por mata secundária, com regiões bastante densas, mas ainda conserva uma vegetação da Restinga e de Mata Pluvial Costeira 75. Seu clima é tropical chuvoso, classificado como AF pela classificação climática de Koopen-Geiger 76. A Ilha da Marambaia foi escolhida como área de estudo por conta de uma parceria entre a Marinha do Brasil e a Fundação Oswaldo Cruz/RJ. Porém, o peso na escolha foi dado ao fato de que essa região apresenta variada e densa fauna de flebotomíneos 6, incluindo espécies importantes na transmissão da LTA e LV. Segundo Novo e colaboradores (2012) 6 durante o ano de 2009 foi possível identificar 13 espécies diferentes desses dípteros, 4 delas com importância epidemiológica na transmissão das Leishmanioses: L. longipalpis, L. migonei, L intermedia e L. fischeri. Com um total de espécimes coletados, L. intermedia foi a espécie mais abundante, seguida de L. migonei, enquanto que L. longipalpis apresentou densidade relativamente baixa em comparação com L. intermedia.

31 18 3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA Em relação ao controle vetorial, o Ministério da Saúde (2010) 12,13 preconiza o controle químico dos vetores somente na fase adulta, com aspersões focais periódicas de inseticidas de ação residual nos domicílios e anexos existentes das áreas endêmicas ou com surto da doença, recomendada para proteção coletiva da população. A obtenção de novos subsídios relacionados aos possíveis criadouros de flebotomíneos corroboraria para estratégias de controle destas zoonoses, com métodos menos invasivos ao meio ambiente, isto é, com manejo ambiental. Teodoro e colaboradores (2003) 77 afirma que a reorganização e limpeza do ambiente peridomiciliar, incluindo drenagem do solo para evitar umidade e remoção de matéria orgânica do mesmo, representada principalmente por folhas e frutos em decomposição, pode reduzir a densidade populacional de insetos adultos, diminuindo o risco para humanos e animais domésticos 69,77. A escassez de trabalhos sobre criadouros naturais desses vetores é uma limitação apontada por alguns autores 2,3. Informações sobre os hábitos desses insetos auxiliam na compreensão da manutenção do agente etiológico, estimativa da densidade populacional, identificação dos riscos aos homens e animais domésticos, além de contribuir com informações para o planejamento e aplicação de medidas de controle vetorial. Portanto, caracterizar os locais de desenvolvimento das formas imaturas desses insetos permite apontar uma das características de importância epidemiológica, pelas possíveis relações entre os criadouros e os ambientes antrópicos. Além disso, pouco se conhece a respeito dos criadouros de flebotomíneos na Ilha da Marambaia, área endêmica com alta densidade desses dípteros 6.

32 19 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral Localizar criadouros de flebotomíneos na Ilha da Marambaia com o auxílio de duas técnicas distintas: armadilhas de emergência e da técnica de flutuação com solução saturada de açúcar em substratos orgânicos da área de estudo. 4.2 Objetivos específicos Testar a adaptação e eficácia da armadilha de emergência proposta; Descrever os ecótopos na qual as espécies foram encontradas; Identificar as espécies capturadas nas armadilhas de emergência e luminosas do tipo CDC, ressaltando as espécies com potencial zoonótico; Comparar a fauna adulta capturada através das armadilhas de emergência com a fauna capturada por armadilhas luminosas do tipo CDC;

33 20 5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 Atividades desenvolvidas O estudo foi realizado durante 12 meses, de agosto de 2012 a julho de Os estudos preliminares e piloto foram realizados nos dois meses que antecederam o início das atividades, compreendendo os meses de junho e julho de Após as adaptações e testes, as armadilhas de emergência foram confeccionadas pela própria equipe do laboratório de Vetores Miguel Alves de Souza ENSP/Fiocruz. O trabalho foi dividido em duas etapas. Na primeira etapa do trabalho, seis primeiros meses, a análise baseou-se no monitoramento das armadilhas de emergência de 15 em 15 dias, rodízio das mesmas a cada 2 meses e coleta do substrato no momento do rodízio das mesmas. Na segunda etapa do trabalho, seis meses restantes, o monitoramento e o rodízio das armadilhas permaneceram. No entanto, a coleta do substrato cessou e armadilhas luminosas do tipo CDC passaram a ser usadas no Ponto 1 e no Ponto 2. A Figura 4 detalha em forma de fluzograma, de uma maneira geral, as atividades desenvolvidas, que incluem as 3 metodologias: armadilhas de emergência, coleta do solo e armadilhas luminosas do tipo CDC.

34 21 Figura 4: Fluxograma das atividades desenvolvidas na região da Vacaria, Ilha da Marambaia. 5.2 Área de estudo A área de estudo compreende a Ilha da Marambaia. Seu território faz pertence ao município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro. Esta ilha situa-se na Restinga da Marambaia e, juntamente com a restinga propriamente dita, possuem certa de 79 km². Localiza-se a 18 km da borda continental, região que encerra a Baía de Sepetiba, no litoral Sul do estado do Rio de Janeiro (Figura 4). A região é administrada pelo Exército, Aeronáutica e Marinha do Brasil, que executam experimentos armamentistas e exercícios militares.

35 22 Figura 5: Localização da Ilha da Marambaia e dos municípios limítrofes. Adaptado de Souza (2007) 78. De acordo com a densidade de insetos adultos 6, foi eleita uma região para análise, conhecida como Vacaria (Figura 5). Esta região apresenta características importantes para o desenvolvimento das formas imaturas, como unidade, sombra, matéria orgânica para as formas imaturas e fonte de alimento para as fêmeas adultas, como pequenos mamíferos e alguns equinos. As capturas ocorreram em ambiente antropizado, mas com ausência de domicílios, caracterizada como borda de mata. Neste local foram colocadas 10 armadilhas, sendo 5 delas próximas à uma árvore isolada e à uma trilha, denomidado Ponto 1 (Figura 6) e as outras 5 em uma área mais próxima à mata, demominado de Ponto 2 (Figura 7).

36 23 Figura 6: Visão panorâmica da região conhecida como Vacaria, administrada pela Marinha do Brasil, situada a Noroeste da Ilha da Marambaia. Fonte: Google Earth. Figura 7: Ponto 1, caracterizado como borda de mata, porém com antropização significativa, pois está localizado próximo a uma trilha por onde passam militares, visitantes e moradores da região.

37 24 Figura 8: Ponto 2, também caracterizado como borda de mata, porém menos antropizado quando comparado ao Ponto 1, uma vez que é neste Ponto que inicia-se a mata na região da Vacaria. 5.3 Trabalho de campo Armadilhas de emergência A armadilha proposta para este trabalho é uma adaptação da armadilha utilizada por Casanova (2001) 73. Essa armadilha apresenta caracteristicas vantajosas como o baixo custo, fácil manipulaçao e frequência de visitas para coleta do material, que pôde ser realizado a cada 15 dias. A armadilha proposta por Casanova (2001) 73 é composta por uma bacia de plástico escura com 45 cm de diâmetro e 15 cm de altura, ligada à um pote de 7 cm de altura contendo uma gaze para dificultar a volta dos flebotomíneos para a bacia e um adesivo para a captura dos insetos. A armadilha utilizada neste trabalho foi composta por uma bacia de plástico retangular de cor preta, com a seguinte metragem: 34 cm por 56 cm e 14 cm de altura. Estas foram fixadas ao solo, permitindo que a abertura ficasse

38 25 em contato com o substrato. A base da bacia possuía dois orifícios, cada um com 5,5 cm de diâmetro, na qual se conectaram tubos de plásticos com o intuito de fixar um pote transparente onde os insetos coletados permaneceram presos. Esses tubos de plástico também possuíam a função de dificultar a volta dos insetos para a bacia. Os potes transparentes (potes coletores) apresentavam 12 cm de altura e, além de permitirem a passagem da luz para que os insetos fossem atraídos, continham dois orifícios com 2,5 cm de diâmetro cobertos por uma tela de náilon de malha fina para a circulação de ar, diferentemente da armadilha proposta por Casanova (2001) 73. Cada armadilha foi composta por 2 potes coletores (Figura 8). Figura 9: Armadilha de emergência utilizada no presente estudo. Esta armadilha é uma adaptação da armadilha confeccionada por Casanova (2001) 73. O monitoramente das armadilhas foi realizado a cada 15 dias, de acordo com o que já foi proposto por Casanova (2001) 73 e com experiências anteriores da equipe de pesquisa do Laboratório de Vetores Miguel Alves de Souza - ENSP/Fiocruz. Ao todo, dez armadilhas foram usadas e estas passaram por um rodízio a cada 2 meses, tempo definido a partir do tempo total que espécies descritas na região levam do momento da oviposição até a emergência dos adultos jovens, desconsiderando o processo de diapausa. A escolha do tempo

39 26 para este rodízio é baseado no tempo total que as formas imaturas das espécies encontradas na região levam da fase de ovo até a eclosão, como realizado por Alencar (2007) 2 na Floresta Amazônica. O referido rodízio consistiu basicamente na mudança de posição das armadilhas de forma que fosse possível abranger uma área maior e dar continuidade ao trabalho, visto que em aproximadamente 2 meses as formas imaturas já se desenvolveram até a fase adulta. Vale ressaltar que as armadilhas não foram colocadas nos mesmos lugares de maneira consecutiva, para que houvesse a chance das fêmeas realizarem a oviposição naqueles microambientes. Nas visitas ao local de estudo, todos os insetos foram coletados e armazenados em álcool 70% em tubos plásticos (Falcon), lacrados e identificados corretamente, para posterior triagem no Laboratório Busca direta de formas imaturas No momento do rodízio das armadilhas de emergência, 1 m² com 1,5 cm de profundidade, foi coletado durante os seis primeiros meses de trabalho (primeira etapa). Antes desse procedimento, toda a serrapilheira também foi coletada para posterior análise com o restante do material. Este material foi proveniente do perímetro das armadilhas, no momento em que estas passavam pelo rodízio e, totalizaram de 10 amostras por coleta. Todo o material do solo era armazenado em sacos plásticos resistentes e identificados e passaram por um processo de lavagem e filtragem que possuía como objetivo reduzir a quantidade de material excedente e concentrar componentes menores, incluindo as formas imaturas de flebotomíneos. Para este processo de lavagem e filtragem, utilizaram-se peneiras de malhas distintas (Figura 9), com o intuito de concentrar as partículas menores e descartar as maiores. Processo semelhante já foi realizado por Deane e Deane (1957) e McCombie-Young e Brendish (1926) 54,79. Folhas, galhos e outros componentes foram lavados e peneirados. Todo o material passou por duas filtragens. As peneiras foram dispostas da maior malha para a menor, de forma que esta posição favorecesse a passagem

40 27 de interesse para a análise, excluindo da melhor maneira possível o material excedente (Figura 10a,b). No final do processo, o material foi retido em um pano capaz de impedir a passagem total do material (Figura 10c). O material fruto deste processo foi armazenado em álcool 70% e identificado. Figura 10: Abertura dos 3 tipos de malhas que foram utilizadas para o processo de lavagem e filtragem do substrato para a busca de formas imaturas de flebotomíneos. (a) ilustração da maior malha (0,5 cm); (b) ilustração da malha intermediária (0,2 cm); (c) ilustração da malha mais fina, na qual todo o material é retido e armazenado em álcool 70%. Para garantir que o material biológico das amostras não se perdesse, no momento em que as amostras chegaram ao laboratório, mesmo em álcool 70% foram colocas na geladeira (2 6ºC) do Laboratório.

41 Armadilhas luminosas do tipo CDC As coletas com armadilhas luminosas do tipo CDC foram realizadas mensalmente, durante a segunda etapa do trabalho. As coletas realizadas com tais armadilhas iniciavam-se às 18 horas e encerradas às 7 horas da manhã do dia seguinte, totalizando 13 horas de coleta/armadilha. Os espécimes coletados foram acondicionados em tubos de plástico contendo álcool 70% devidamente rotulados e enviados ao laboratório de Vetores Miguel Alves de Souza ENSP/Fiocruz. 5.4 Trabalho laboratorial Armadilhas (emergência e CDC) O material recolhido das armadilhas de emergência e das armadilhas luminosas do tipo CDC foi triado e os flebotomíneos passaram pelo processo de clarificação, necessário para a identificação das espécies. Todos os exemplares foram clarificados em solução hidróxido de potássio (KOH) a 10% durante 2 horas. Em seguida, lâminas foram montadas para identificação dos flebotomíneos e estes foram levados ao microscópio para identificação, de acordo com a nomenclatura proposta por Young e Duncan (1994) Busca direta de formas imaturas As amostras de material dos substratos foram processadas pela técnica de flutuação com solução saturada de açúcar, proposta por Hanson (1961) 5 no Laboratório.

42 Análise estatística achados. A análise foi realizada de maneira descritiva, avaliando a frequência dos

43 30 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos no decorrer do mestrado e suas respectivas discussões estão dispostos em formato de artigo científico intitulado Criadouro natural de flebotomíneo (Diptera: Psychodidae) na Ilha da Marambaia, estado do Rio de Janeiro, Brasil submetido à revista Acta Tropica. Tal revista possui WebQualis A2 em Saúde Coletiva.

44 Artigo científico Criadouro natural de flebotomíneo (Diptera: Psychodidae) na Ilha da Marambaia, Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Natural Breeding Sites of Phlebotomine Sand Flies (Diptera: Psychodidae) on Marambaia Island, Rio de Janeiro State, Brazil. Souza, T. L. 1 ; Figueiredo, F. B. 2 ; Almeida, A. B. 2 ; Benigno, C. V. 1 ; Pontes, C. S. 1 ; Souza, M. B. 1. ¹ Departamento de Ciências Biológicas - Escola Nacional de Saúde Pública Fiocruz. ² Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos Instituto de Pesquisa Evandro Chagas Fiocruz. Resumo As formas imaturas de flebotomíneos, vetores das Leishmanioses, desenvolvem-se em solos com características essenciais e ideais para seus ciclos vitais, como matéria orgânica, umidade, sombra e temperatura. Informações referentes aos potenciais criadouros naturais destes dípteros são fundamentais para compreensão da epidemiologia e ecologia das Leishmanioses, além de sua importância para o controle das mesmas. Este trabalho teve como objetivo localizar criadouros naturais de flebotomíneos na Ilha da Marambaia, com o auxilio de armadilhas de emergência e busca direta das formas imaturas, através da técnica de flutuação com solução saturada de açúcar em substratos orgânicos da região. Ambas as metodologias foram eficazes, com um total de 42 exemplares de 6 espécies distintas, incluindo espécies que participam do ciclo de transmissão da Leishmaniose tegumentar Americana, coletados pelas armadilhas de emergência e 5 formas imaturas obtidas através da técnica de flutuação. Também foram utilizadas armadilhas

45 32 luminosas do tipo CDC em capturas mensais nos últimos meses de trabalho. Porém, ainda existe a necessidade de estudos futuros, principalmente no que se refere à ecologia e biologia das formas imaturas para que medidas de controle voltadas para os criadouros tenham resultados positivos e viáveis em ambientes naturais. Palavras chave: criadouros, flebotomíneos, formas imaturas, armadilhas de emergência, leishmaniose. Abstract Immature phlebotomine sand flies develop in soils with essential and ideal characteristics for their life cycle, such as organic matter, humidity, temperature and low levels of light. Information regarding the potential breeding places of these dipterans is fundamental to understand the epidemiology and ecology of leishmaniasis, in addition to its importance to control them. In the present study, we aimed to find natural breeding sites of sand flies on Marambaia Island with the aid of emergence traps and direct search of immature forms using the flotation technique with saturated sugar solution in organic substrates of the region. Both methods were effective, with a total of 42 specimens of six different species - including some species that participate in the transmission cycle of American Tegumentary Leishmaniasis - collected by the emergence traps, and five immature forms obtained by floatation technique. The CDC light traps were also used in monthly catches in the last months of work.however, further studies are still necessary, mainly with respect to the ecology and biology of immature sandfly stages, so that control measures focused on breeding sites can produce positive sustainable results in natural environments. Keywords: breeding sites; phlebotomine sand flies; immature forms; emergence traps; leishmaniasis

46 33 1. Introdução Os flebotomíneos são dípteros pertencentes à Subfamília Phlebotominae e possuem grande importância na Saúde Pública, pois são incriminados na transmissão de diferentes espécies de Leishmania (Forattini, 1973). Existem mais de 800 espécies conhecidas (Young e Duncan, 1994), porém só algumas delas são capazes de transmitir tais parasitos (Killick-Kendrick, 1990). Tais protozoários possuem ciclos silvestres ou peridomésticos, na qual o homem é infectado através da picada do flebotomíneo infectado (Rangel e Lainson, 2003). O conjunto de informações sobre ecologia e biologia dos flebotomíneos permite apontar características relevantes para o planejamento de medidas de controle das leishmanioses. A natureza dos criadouros de flebotomíneos ainda não é bem definida (Alencar, 2007), mas se reconhece a importância para a compreensão da dinâmica populacional de insetos adultos de uma determinada região (Warburg e Faiman, 2011). Caracterizar os locais de desenvolvimento das formas imaturas desses insetos permite apontar uma das características de importância epidemiológica, pelas possíveis relações entre os criadouros e os ambientes antrópicos, contribuindo com informações relevantes para estratégias de controle destas zoonoses, com métodos menos invasivos ao meio ambiente, isto é, com manejo ambiental. Reorganização e limpeza do ambiente peridomiciliar, incluindo drenagem do solo para evitar umidade e remoção de matéria orgânica do mesmo, representada principalmente por folhas e frutos em decomposição, pode reduzir a densidade populacional de insetos adultos, diminuindo o risco para humanos e animais domésticos (Teodoro et al., 2003; Marzochi et al., 2009). As formas imaturas de flebotomíneos se desenvolvem ao nível de solo e este deve apresentar características essenciais ao desenvolvimento das mesmas, como matéria orgânica, temperatura, sombra e umidade (Deane e Deane, 1957). Sendo assim, as fêmeas de flebotomíneos não fazem a oviposição indiscriminadamente, como outros dípteros, realizando tal ciclo vital em lugares específicos que favoreçam o desenvolvimento das larvas. Tanto os adultos

47 34 como as formas imaturas apresentam comportamentos associados às condições do ambiente (Killick-Kendrick, 1999). A busca de formas imaturas, em sua maioria, é desenvolvida através de armadilhas de emergência, assentadas em solo de interesse (Feliciangeli, 2004). Outra técnica utilizada foi descrita por Hanson (1961), utilizando solução saturada de açúcar para busca de formas imaturas no solo. Esse trabalho teve como objetivo principal caracterizar microambientes na Ilha da Marambaia capazes de fornecer condições favoráveis ao desenvolvimento e sucesso de criadouros de flebotomíneos. Recente estudo nessa região aponta para uma variada fauna de flebotomíneos, incluindo espécies importantes na transmissão da Leishmaniose Tegumentar Americana e Leishmaniose Visceral. Durante o ano de 2009 foi possível identificar 13 espécies diferentes desses dípteros, 4 delas com importância epidemiológica na transmissão das Leishmanioses: L. longipalpis, L. migonei, L intermedia e L. fischeri (Novo et al., 2013). 2. Materiais e Métodos Trata-se de um estudo seccional, no qual foi realizada pesquisa entomológica para identificação de criadouros de flebotomíneos na Ilha da Marambaia. Foram empregadas três metodologias distintas: armadilhas de emergência, durante os 12 meses de trabalho (agosto de 2012 a julho de 2013), análise do solo com solução saturada de açúcar, nos seis primeiros meses, e armadilhas luminosas do tipo CDC, nos últimos 6 meses Área de estudo A Ilha da Marambaia encerra a Baía de Sepetiba, litoral sul do estado do Rio de Janeiro e pertence ao município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro, Brasil. É uma área administrada pelas Forças Armadas do Brasil, que exercem atividades de treinamento, além de receber militares de diversas áreas do Brasil. Foram eleitos dois Pontos de coleta em uma região conhecida como

48 35 Vacaria (S W ), de acordo com a densidade de insetos adultos (Novo et al., 2013). As capturas ocorreram em ambiente antropizado, mas com ausência de domicílios. Ambos os Pontos eram caracterizados como borda de mata, sendo Ponto 1 composto por uma região com menos árvores e com presença de uma trilha, enquanto o Ponto 2 mais a dentro da mata, com maior cobertura v egetal Busca por criadouros Os flebotomíneos foram capturados tanto em sua forma alada (adultos jovens), através de armadilhas de emergência, adaptada da armadilha utilizada por Casanova (2001) quanto em sua forma imatura, pela técnica de flutuação em solução saturada de açúcar, proposta por Hanson (1961). A armadilha de emergência utilizada neste estudo foi composta por uma bacia de plástico retangular de cor preta, com a seguinte metragem: 34 cm por 56 cm e 14 cm de altura. Estas foram fixadas ao solo, permitindo que a abertura ficasse em contato com o substrato. A base da bacia possuía dois orifícios, cada um com 5,5 cm de diâmetro, na qual se conectaram tubos de plásticos com o intuito de fixar um pote transparentes onde os insetos coletados permaneceram presos. Esses tubos de plástico também possuíam a função de dificultar a volta dos insetos para a bacia. Os potes transparentes (potes coletores) apresentavam 12 cm de altura e, além de permitirem a passagem da luz para que os insetos fossem atraídos, continham dois orifícios com 2,5 cm de diâmetro cobertos por uma tela de náilon de malha fina para a circulação de ar, diferentemente da armadilha proposta por Casanova (2001). Cada armadilha foi composta por 2 potes coletores (Figura 1). Ao todo, dez armadilhas foram usadas, cinco no Ponto 1 e cinco no Ponto 2. O monitoramente das mesmas foi realizado de 15 em 15 dias além de um rodízio a cada 2 meses, de acordo com o que já foi proposto por Casanova (2001; 2013), estipulando esse tempo de acordo com o tempo de ciclo das fases imaturas das espécies existentes na região. Após o período de 2 meses, as armadilhas foram transferidas para outros pontos e consideradas como nova amostra, uma vez que representava uma outra área adjacente a que já havia sido considerada. Os espécimes coletados foram

49 36 acondicionados em tubos de plástico contendo álcool 70%, clarificados em solução hidróxido de potássio (KOH) a 10% durante 2 horas e classificados segundo a nomenclatura proposta por Young e Duncan (1994). A escolha do tempo para este rodízio é baseado no tempo total que as formas imaturas das espécies encontradas na região levam da fase de ovo até a eclosão, como realizado por Alencar (2007). No momento do rodízio das armadilhas de emergência, 1 m² com 1,5 cm de profundidade, foi coletado durante os seis primeiros meses de trabalho. Antes desse procedimento, toda a serrapilheira também foi coletada para posterior análise com o restante do material. Este material foi proveniente do perímetro das armadilhas, no momento em que estas passavam pelo rodízio e, totalizaram de 10 amostras por coleta. Todo o material do solo era armazenado em sacos plásticos resistentes e identificados e passaram por um processo de lavagem e filtragem que possuía como objetivo reduzir a quantidade de material excedente e concentrar componentes menores, incluindo as formas imaturas de flebotomíneos. Para este processo de lavagem utilizaram-se peneiras de malhas distintas, com o intuito de concentrar as partículas menores e descartar as maiores. No final do processo, o material era retido em um pano capaz de impedir a passagem total do material (Figura 2). Processo semelhante já foi realizado por Deane e Deane (1957), McCombie-Young, et al., (1926). Folhas, galhos e outros componentes foram lavados e peneirados. As amostras de solo foram processadas pela técnica de flutuação com solução saturada de açúcar, proposta por Hanson (1961) e em todos os momentos, desde a coleta, o material permaneceu acondicionados em geladeira (2 6ºC) e alcool 70%. Figura 1: Armadilha de emergência adaptada para o estudo.

50 37 Figura 2: Abertura dos 3 tipos de malhas que foram utilizadas para o processo de lavagem e filtragem do substrato para a busca de formas imaturas de flebotomíneos. (a) ilustração da maior malha (0,5 cm); (b) ilustração da malha intermediária (0,2 cm); (c) ilustração da malha mais fina, na qual todo o material é retido e armazenado em álcool 70% Armadilhas luminosas As coletas com armadilhas luminosas do tipo CDC foram realizadas mensalmente, nos últimos 6 meses de trabalho. As coletas realizadas com tais armadilhas iniciavam-se às 18 horas e encerradas às 7 horas da manhã do dia seguinte (Souza et al., 2000; Souza et al., 2003; Novo et al., 2013), totalizando 13 horas de coleta/armadilha, com uma armadilha para o Ponto 1 e outra para o Ponto 2. Os espécimes coletados foram acondicionados em tubos de plástico contendo álcool 70%, clarificados em solução hidróxido de potássio (KOH) a 10% durante 2 horas e classificados segundo a nomenclatura proposta por Young e Duncan (1994). 3. Resultados Ao longo dos 12 meses de estudo, as armadilhas de emergência capturaram um total de 42 espécimes alados, pertencentes em seis espécies distintas. A espécie e Lutzomyia schreiberi apresentou maior densidade, com predominância de 78.57%, quando comparado com o total de flebotomíneos capturados por essas armadilhas (Tabela 1). Cabe destacar L. ferreirana como um novo registro na Ilha da Marambaia, esta capturada em ambas as armadilhas utilizadas. O mês de maio apresentou maior densidade totalizando 47,6% do total de flebotomíneos coletados. Durante os meses de setembro, janeiro e março nenhum indivíduo adulto foi capturado.

51 38 Tabela 1: Frequência das espécies e dos sexos dos flebotomíneos capturados pelas armadilhas de emergência em cada Ponto de coleta (P1 e P2), ao longo de 12 meses (agosto de 2012 a julho de 2013). Espécies Ponto 1 Total (P1) Ponto 2 Total(P2) nº % nº % L. intermedia L. migonei L. schreiberi L. capixaba L. ferreirana L. edwardsi Total Além dos insetos de interesse, as armadilhas de emergência foram eficazes na captura de outros artrópodes, como próprios dípteros, coleópteros, quelicerados e até mesmo pequenos crustáceos, como isópodes. Dentre essa variada fauna, vale ressaltar a presença de pequenos predadores, como aranhas e formigas. Totalizando 30 m² de solo coletado, processado na solução saturada de açúcar, foi possível encontrar 5 formas imaturas de flebotomíneos: 2 larvas de 2 estádio, 2 larvas de 4 estádio e 1 pupa, todas no Ponto 2. As armadilhas luminosas totalizaram 65 horas de captura e 556 flebotomíneos coletados, dispostos em dez espécies distintas (Tabela 2).

52 39 Tabela 2: Frequência das espécies e dos sexos dos flebotomíneos capturados pelas armadilhas luminosas do tipo CDC em cada Ponto de coleta (P1 e P2), ao longo dos últimos 6 meses de trabalho. Espécies Ponto 1 Total (P1) Ponto 2 Total (P2) nº % nº % L. intermedia , ,43 L. migonei , ,88 L. fisheri , ,72 L. cortelezzii ,68 L. schreiberi , ,93 L. ferreirana ,68 L. edwardsi 1-1 0, L. bianchigalatiae , L. pelloni 1-1 0, L. pessoai ,68 Total , ,00 Para analisar de maneira conjunta os dados obtidos em ambas as armadilhas, só foram comparados os dados nos quais ambas as armadilhas permaneceram no ambiente concomitantemente, ou seja, dos meses de março a julho de Foi possível observar mudanças no padrão de distribuição, tanto em relação à densidade, quanto em relação ao sexo e às espécies (Tabela 3).

53 40 Tabela 3: Frequência das espécies e dos sexos dos flebotomíneos capturados de maneira concomitante tanto pelas armadilhas de emergência (A.E.) quanto pelas armadilhas luminosas do tipo CDC nos dois Pontos de coleta, ao longo dos últimos 6 meses de trabalho. Espécies Ponto 1 Ponto 2 A.E. CDC A.E. CDC A.E. CDC A.E. CDC L. intermedia L. migonei L. fisheri L. schreiberi L. edwardsi L. bianchigalatiae L. pelloni L. ferreirana L. cortelezzii L. pessoai L. capixaba Total Discussão e Conclusão O estudo de criadouros naturais de flebotomíneos contribui para elucidar características importantes no que se refere à dinâmica populacional e consequente manutenção das Leishmanioses em determinadas regiões (Warburg e Faiman, 2011). Todavia, trabalhos com detalhamento da biologia do ciclo de vida dos flebotomíneos são escassos, principalmente no que se refere ao número de imaturos capturados em ambientes naturais (Alencar, 2007). O método mais utilizado na busca de criadouros de flebotomíneos são as armadilhas de emergência (Feliciangeli, 2004). A armadilha de emergência utilizada neste trabalho mostrou-se eficaz na captura desses dípteros, mesmo estas sendo armadilhas adaptadas a partir das utilizadas por Casanova (2001), em Mogi Guaçu, São Paulo.

54 41 Com os resultados obtidos nesse estudo foi possível confirmar que a região estudada apresenta condições favoráveis ao desenvolvimento de criadouros naturais de flebotomíneos. Das seis espécies capturadas pelas armadilhas de emergência, L. intermedia e L. migonei participam do clico de transmissão da Leishmaniose Tegumentar Americana e L. ferreirana é um novo registro na Ilha da Marambaia. A espécie L. ferreirana já é descrita em outras áreas da região sudeste do Brasil (Foratini, 1973; Young e Duncan, 1994; Shimabukuro et al., 2011), mas ainda não havia sido registrada no municípios de Mangaratiba (Novo et al., 2013) e Rio de Janeiro (Souza, 2003). Com exceção da L. ferreirana, L. intermedia, L. migonei, L. schreiberi, L. capixaba e L. edwardsi representam aproximadamente 38,5% do total das 13 espécies encontradas, até o momento, na Ilha da Marambaia (Novo et al., 2013). Utilizando desta mesma metodologia, apesar de diferenças estruturais na armadilha de emergência, Alencar (2007) registrou a presença de 9 das 55 espécies (16%) presentes na área de estudo, utilizando também uma armadilha adaptada, mas com mudanças na metodologia. Outros trabalhos também partiram da alta concentração de flebotomíneos para realizar a busca por criadouros (Hanson, 1961; Feitosa, 2009; Sangiorgi et al., 2011; Müller et al., 2011; Casanova et al., 2013), assim como a presença de condições essenciais ao desenvolvimento das formas imaturas. Em relação ao sexo, outros autores (Alencar, 2007; Müller et al., 2011; Sangiorgi et al., 2011) já registraram a predominância das fêmeas em relação aos machos, mesmo que sem inferência de causalidade, como o que foi observado nesse estudo. A emergência relativamente baixa de flebotomíneos, quando comparada aquelas encontradas por Casanova e colaboradores (2001; 2013), Rutledge e Ellenwood (1975) e Sangiorgi e colaboradores (2011), por exemplo, pode não estar refletindo diretamente a eficiência da armadilha empregada e sim ao método e a outras condições inerentes ao local de estudo, como clima, período do ano e tipo de bioma. Portanto, o número de armadilhas empregadas, maior área analisada, tempo de permanência das armadilhas nos locais, tempo total de desenvolvimento do trabalho e condições adversas dos diferentes ambientes nos diferentes trabalhos (Deane e Deane, 1957; Casanova, 2001; Alencar, 2007, Müller et al., 2011; Sangiorgi et al, 2011; Casanova et al., 2013) são exemplos

55 42 de fatores que podem influenciar as capturas de insetos adultos nas armadilhas de emergência. Além disso, o padrão de distribuição espacial dos criadouros, influenciado pela oviposição, contribui para dificultar os achados em ambientes naturais (Deane e Deane, 1957; Feliciangeli, 2004; Sangiorgi et al., 2011; Casanova et al., 2013). Ao longo do trabalho foi possível perceber, por exemplo, que em uma das armadilhas, quando se passou o tempo previsto de coleta, flebotomíneos emergiram, sendo estes representados em maior número pela espécie L. schreiberi, sugerindo que esta espécie apresenta um período de desenvolvimento imaturo um pouco maior, ou que pode passar pelo período de diapausa. Apesar da metodologia baseada em trabalho realizado anteriormente (Casanova, 2001), acreditamos que um período mais curto entre as visitas poderia ter aumentado a eficácia e mesmo até o número de flebotomíneos capturados. Mudanças estruturais nas armadilhas, como o que foi proposto por Casanova e colaboradores (2013), podem aprimorar a técnica e diminuir as perdas. Diante disso, todos os resultados apresentados foram analisados somente de maneira descritiva (qualitativa) e não quantitativa, pois a frequência das visitas pode ter sido uma limitação da metodologia empregada. A emergência de flebotomíneos em áreas com presença predominante de árvores e serrapilheira parece estar relacionada com a proteção conferida às formas imaturas nesses ambientes (Ferreira, 1938; Deane e Deane, 1957; Hanson, 1961; Rutledge e Mosser, 1972; Alencar, 2007). O Ponto 2, do presente estudo, no qual apresenta maior densidade de flebotomíneos capturados oferece tal condição. No entanto, para compararmos o número de indivíduos capturados em ambos os pontos de coleta é preciso apontar algumas características importantes. No Ponto 2, a serrapilheira manteve-se presente em todo os meses de estudo, fruto da acumulação das folhas das árvores do próprio ambiente. Além disso, protegem o solo das chuvas e das enchentes, que eventualmente lavam o solo (Rutledge e Mosser, 1972). As chuvas parecem ajudar os flebotomíneos quando de maneira moderada, mas em abundância os prejudica, pois imunda os solos, matando as formas imaturas, principalmente as pupas (Rutledge e Ellenwood, 1975; Casanova et al., 2013). Já quando analisamos o Ponto 1, a serrapilheira esteve presente de maneira inconstante,

56 43 fato que pode estar atribuído a não proteção por árvores e por se caracterizar por campo aberto, a circulação de correntes de ar é facilitada e a ação dos ventos pode diminuir as folhas em decomposição no solo. A pouca cobertura vegetal neste ponto, ou quase nenhuma, não foi suficiente para manter a umidade e a sombra de maneira mais constante do que a borda de mata fechada do Ponto 2. No Ponto 1, as chuvas facilmente lavam o solo, pois a serrapilheira é ausente ou insuficiente para protegê-lo. Tal fato pode ser confirmado não só pela presença ou ausência de formas imaturas de flebotomíneos, mais outros artrópodes e pequenos moluscos mostraram maior diversidade nos locais mais protegidos, quando o solo foi analisado pela técnica com solução saturada de açúcar (Hanson, 1961). Casanova e colaboradores (2013), registram que a serrapilheira pode realmente conferir condições para o desenvolvimento de criadouros e que estes ambientes são importantes, uma vez que, muitas vezes, estão presentes próximos aos domicílios. Se reconhece que, a população de adultos está relacionada com a manutenção e sucesso dos criadouros (Rutledge e Ellenwood, 1975). Barata e colaboradores (2004) encontraram associação entre a sazonalidade de flebotomíneos adultos com umidade e pluviosidade, mas não com temperatura, enquanto que Dias e colaboradores (2007) não acharam associação entre nenhum desses fatores, mas registrou redução da densidade de adultos com os meses mais secos e frios, sugerindo que tal achado era fruto das condições desfavoráveis ao desenvolvimento dos criadouros. Mas, apesar de ambos terem sido realizados no mesmo bioma no Brasil, Dias e colaboradores (2007) só analisaram uma única localidade, diferentemente de Barata e colaboradores (2004) que trabalharam com mais de 5 localidades. No presente estudo, o mês de maior densidade de insetos capturados pelas armadilhas de emergência foram consequentes aos meses mais chuvosos (Estação Pluviométrica de Guatatiba, 2013), sugerindo também que as condições de umidade e pluviosidade podem influenciar na sazonalidade de flebotomíneos, independente das mudanças de metodologia e condições específicas de cada local de estudo. Esses dados corroboram com os achados de Casanova e colaboradores (2013) que sugerem os períodos radicais como de maior pluviosidade e secos podem diminuir a densidade de formas imaturas. Ou seja, as condições do ambiente podem

57 44 influenciar a flutuação de flebotomíneos adultos e distribuição dos criadouros (Rutledge e Ellenwood, 1975; Casanova et al., 2013). É conhecido, mesmo em laboratório, que algumas espécies podem apresentar diferenças na biologia das formas imaturas. Existem sugestões de que algumas espécies preferem realizar a oviposição em superfícies menos planas ou em fendas, como o que já foi observado em laboratório com fêmeas de L. longipalpis e L. migonei (Elnaiem e Ward, 1992; Nieves et al., 1997). As pupas, por exemplo, geralmente apresentam preferência por se fixar em superfícies verticais, sendo a metodologia utilizada no presente estudo, incapaz de capturar as pupas, ou adultos que dela ecolodem. Tal fato já foi registrado por Ivović e colaboradores (2010) em colônias de Phlebotomus neglectus criadas em laboratório. Algumas larvas, por sua vez, podem se distribuir de maneira distinta em relação à profundidade do solo e também na serrapilheira, como o que já foi observado por Hanson (1961). As armadilhas de emergência utilizadas nesse trabalho podem ter sido ineficazes para atingir microambientes com essas características presentes nos Pontos 1 e 2, como bases de árvores e rochas. Todavia, o ambiente natural também é passível de variações constantes. Além das características físicas, como a proteção contra chuvas, outros fatores podem influenciar na dinâmica populacional, sucesso dos criadouros e consequente emergência dos flebotomíneos. Em condições laboratoriais, Hassan e colaboradores (2010) e Ivović e colaboradores (2010) registraram mortalidade entre as fases imaturas de desenvolvimento, mesmo com toda preparação para manter o ambiente laboratorial em condições favoráveis. Outro fator importante é a predação natural por outros animais, principalmente artrópodes, que ocorre em ambientes naturais. Assim como registrado por Alencar (2007), foi comum encontrar aranhas e menos comuns formigas, sugerindo que pode haver perda de material para análise. As coletas de solo para busca de formas imaturas foram realizadas somente nos 6 primeiros meses do trabalho, a cada 2 meses. Poucos trabalhos vêm sendo publicados com busca de formas imaturas em ambientes naturais. As formas imaturas encontradas nesse estudo confirmam a existência de criadouros naturais de flebotomíneos e eficácia das armadilhas de emergência, mesmo que

58 45 estas só tenham sido encontradas no Ponto 2. Assim como nas armadilhas de emergência, o baixo número de exemplares coletados parece não estar relacionado à eficácia da técnica empregada e sim ao método. O tempo de trabalho e o número de amostras, por exemplo, parece influenciar nos resultados e não representar quantitativamente a população de formas imaturas da região. Mas apesar disso, esses resultados são corroborados pelos achados de formas imaturas em ambientes naturais de Deane e Deane (1957) e Hanson (1961), mesmo com diferenças metodológicas empregadas entre os estudos. Ambos os autores possuíam uma ampla gama de microambientes analisados e um período maior de trabalho, diferentemente do que foi realizado no presente estudo. Nos últimos meses de trabalho foram realizadas capturas com armadilhas luminosas do tipo CDC. Optamos por esta metodologia, mesmo com o estudo em andamento, porque os resultados encontrados nas armadilhas de emergência apresentaram resultados bastante distintos com o que até então havia sido encontrado na região com armadilhas luminosas do tipo CDC (Novo et al., 2013). Das espécies de maior densidade populacional, capturadas por armadilhas luminosas do tipo CDC na região, as espécies L. intermedia e L. migonei são as mais abundantes, representando 72.48% e 17.27% dos espécimes coletados, respectivamente, e ambas importantes no ciclo de transmissão da Leishmaniose Tegumentar Americana, como já registrado por Novo e colaboradores (2013) na área de estudo. Em relação ao sexo, os dados obtidos no presente estudo não são similares aos registrados por Novo e colaboradores (2013) na Ilha da Marambaia, nos quais os machos mostraram densidades bastante semelhantes em relação as fêmeas. Durante os 6 meses de coleta com as armadilhas luminosas do tipo CDC, foi possível capturar 76,9% do total de espécies já capturadas na Ilha da Marambaia. Para a comparação entre as armadilhas de emergência e as armadilhas luminosas do tipo CDC, foram analisados somente os meses nos quais ambas as armadilhas foram usadas concomitantemente. As diferenças encontradas na diversidade de espécies e na densidade dos flebotomíneos capturados por armadilhas distintas dentro da mesma área, parecem se confirmar com os resultados obtidos por Alves e colaboradores (2012). Deane e Deane (1957)

59 46 registraram a raridade de formas imaturas de L. longipalpis em área onde sua forma alada é bastante abundante e sugeriram que esta espécie apresenta criadouros distintos ou que podem se desenvolver de maneira mais espalhada no ambiente, dispersando sua oviposição de maneira ampla, dificultando seu encontro. Hanson (1961) também registrou padrão de capturas diferente, no qual nem todas as espécies capturadas na fase adulta foram encontradas em amostras de solo e vice-versa, como foi o caso de Phlebotomus skannom e P. hamatus, respectivamente. Em contrapartida, Casanova e colaboradores (2013) confirmam a predominância de L. longipalpis em ambas as armadilhas, tanto nas de emergência como nas luminosas, assim como Alencar (2007), no qual as mesmas espécies foram encontradas em densidades semelhantes nas duas metodologias. Porém, essa falta de correlação existente entre as armadilhas de emergências e as luminosas do tipo CDC não é fato raro e foi registrado por outros autores (Hanson, 1961; Deane e Deane, 1957; Rutlegde e Ellenwood, 1975). Infelizmente, o tempo de estudo e o baixo número de flebotomíneos adultos e de forma imaturas dos mesmos, impede uma análise mais detalhada e uma conclusão de flutuação sazonal. Dias e colaboradores (2007) afirmam que para um estudo que envolva sazonalidade de maneira clara e confiável é necessário um período de pelo menos 2 anos de acompanhamento, diminuindo assim a margem de erro. Além disso, nos meses de fevereiro e julho de 2013 foi impossível considerar os resultados encontrados por conta de acontecimentos adversos, como armadilhas quebradas por animais, manipuladas ou roubadas por pessoas da própria região. Mas, nenhuma das limitações citadas até o momento podem questionar a eficácia da armadilha, fato que pode ser confirmado com a presença de formas imaturas no solo e uma grande quantidade de outros artrópodes com desenvolvimento imaturo no solo, como coleópteros, outros dípteros além dos flebotomíneos, colêmbolas, quelicerados e até mesmo pequenos crustáceos, como isópodes e pequenos moluscos, como pulmonatas. Esses achados corroboram com o que já foi observado por Alencar (2007) e Casanova e colaboradores (2013). Assim como esses autores, sugerimos que a fauna associada pode oferecer informações importantes como indicadores de reprodução de flebotomíneos, como é o caso de presença de

60 47 larvas de outros dípteros, principalmente outros dípteros da família Psychodidae, encontrados nas amostras de solo do presente estudo. No entanto, mesmo com a positividade da metodologia utilizada, os resultados obtidos apontam para necessidade de estudos futuros, tanto em relação à ecologia e biologia das formas imaturas, como para aprimoramento das medidas de controle. Já se conhece a eficácia ou não de diferentes compostos químicos e agentes biológicos no controle de formas imaturas em laboratório (Alexandre e Molina, 2003), mas ainda são escassos trabalhos sobre a biologia e ecologia de criadouros naturais de flebotomíneos (Alencar, 2007) para que medidas de controle diretamente voltadas para as formas imaturas tenham resultados positivos e principalmente viáveis em ambientes naturais. Ambientes com cobertura vegetal viva, na forma de árvores, ou em decomposição, na forma de serrapilheira, permitem o desenvolvimento de locais de criadouros, mesmo que esses ambientes sejam afetados e modificado por ações antrópicas, estes que podem ser encontrados nos peridomicílios na Ilha da Marambaia. 5. Agradecimentos Agradecemos a toda equipe do Laboratório de Vetores da Escola Nacional de Saúde Pública, que de alguma forma contribuiu para o desenvolvimento do trabalho. Este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) - Estudo de Doenças Negligenciadas e Reemergentes / Jovem Cientista Nosso Estado e Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq). Fabiano Borges Figueiredo detém uma concessão do CNPq para a produtividade em pesquisa.

61 48 6. Referências Alencar, R.B., Emergence of phlebotomine sandflies (Diptera: Psychocidae) in non-flooded forest floor in Central Amazon, Brazil: a modified emergence trap model.acta Amazonica. 37, Alexander, B., Maroli, M., Control of phlebotmomine sandflies. Medical and Veterinary Entomology. 17, Alves, V.R., Freitas, R.A., Santos. F.L., Oliveira, A.F.J., Barrett, T.V., Shimabukuro, P.H.F., Sand flies (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) from Central Amazonia and four new records for the Amazonas State, Brazil. Revista Brasileira de Entomologia. 56, Barata, R.A., Silva, J.C.F., Costa, R.T., Fortes-Dias,C.L., Silva, J.C., Paula, E.V., Prata, A., Monteiro, E.M., Dias, E.S., Phlebotomine sand flies in Porteirinha, an area of American visceral leishmaniasis transmission in the State of Minas Gerais, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 99, Casanova, C., A soil emergence trap for collections of phlebotomine sand flies. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, Casanova, C., Andrighetti, M.T.M., Sampaio, S.M.P., Marcoris, M.L.G., Colla- Jaccques, F.E., Prado, A.P., Larval breeding sites of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) in visceral leishmaniasis endemic urban areas in Southeastern Brazil. Neglected Tropical Diseases. 7, 1-9. Deane, L.M., Deane, M.P., Observações sobre abrigos e criadouros de flebótomos no Noroeste do Estado do Pará. Revista Brasileira de Malariologia e Doenças Tropicais. 4, Dias, E.S.D., França-Silva, J.C., Silva, J.C., Monteiro, E.M., Paula, K.M., Gonçalves, C.M., Barata, R.A., Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) de um foco de leishmaniose tegumentar no Estado de Minas Gerais. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 40, Elnaiem, D.A., Ward, R.D., The thigmotropic oviposition response of the sandfly Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) to crevices. Annals of Tropical Medicine and Parasitology. 86, Feitosa, M.A.C., Castellon, E.G., Phlebotominae (Diptera: Psychodidae) in the outskirts of Santarém City. Horizontal stratification and aggravating

62 49 factores for the domiciliary transmission of leishmaniasis. Revista Colombiana de Ciencia Animal. 1, Feliciangeli, M.D., Natural breeding places of phlebotomine sandflies. Medical and Veterinary Entomology. 18, Ferreira, L.C., Deane, L., Mangabeira Filho, O., Sobre a biologia dos flebótomos das zonas de leishmaniose visceral ora em estudo no Estado do Pará. O Hospital. 14, Forattini, O.P., Entomologia médica, quarta ed. Edgard Blücher Ltda, São Paulo Hassan, M.M., Elhassan, A.M., Osman, O.F., El-Raba'a, F.M., Balkew, I.M.E., Establishment and maintenance of a laboratory colony of the sandfly Phlebotomus orientalis (Diptera: Psychodidae), the vector of visceral leishmaniasis in Sudan. Khartoum Medical Journal. 3, Hasson, W.J., The breeding places of Phlebotomus in Panama (Diptera, Psychodidae). Annals of The Entomological Society of America. 54, Ivović, V., Chaniotis, V., Vujanić, M., Bobić, B., Nikili, A., Klun, I., Živković, T., Djurković-Djaković, O., Life tables and reproductive parameters of Phlebotomus neglectus Tonnoir, 1921 (Diptera, Psychodidae) under laboratory conditions. Archives of Biological Science Belgrade. 3, Killick-Kendrick, R., Phlebotomine vectors of the leishmaniases: a review. Medical and Veterinaty Entomology. 4, Killick-Kendrick, R., The biology and control of phlebotomine sand flies. Clinics and Dermatology. 17, Marzochi, M.C., Fagunder, A., Andrade, M.V., Souza, M.B., Madeira, M.F., Mouta-Confort, E., Schubach, A.O., Marzochu,.B.F., Visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil: eco-epidemiological aspects and control. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 42, Mccombie-Young, T.C., Richmond, A.E., Brendish, G.R., Sandflies and sandfly fever in the Peshawar District. Indian J. M. Res. 13, Müller, G.C., Kravchenko, V.D., Rybalo, L., Schlein, Yosef., Characteristics of resting and breeding habitats of adults sand flies in the Judean Desert. Journal of Vector Ecology. 36,

63 50 Nieves, E., Ribeiro, A., Brazil, R., Physical factors influencing the oviposition of Lutzomyia migonei (Diptera: Psychodidae) in laboratory conditions. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 92, Novo, S.P.C., Souza, M.B., Villanova, C.B., Meródio, J.C., Meira, A.M., Survey of sandfly vectors of leishmaniasis in Marambaia Island, municipality of Mangaratiba, State of Rio de Janeiro, Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 46, Prefeitura do Estado do Rio de Janeiro, Sistema Alerta Rio da Prefeitura do Rio de Janeiro. Estação Pluviométrica de Guaratiba. Disponível em: Rangel, E.F., Lainson, R., Ecologia das leishmanioses. In: Flebotomíneos do Brasil. Editora Fiocruz, Rio de Janeiro Rutledge, L. C., Mosser, H., Biology of immature sandflies (Diptera: Psychodidae) at the bases os trees in Panama. Environmental Entomology. 1, Rutledge, L.C., Ellenwood. D.A., Production of plebotomine sandflies on the open forest floor in Panama: The species. Environmental Entomology. 4, Sangiorgi, B., Miranda, D.N., Oliveira, D.F., Santos, E.P., Gomes, F.R., Santos, E.O., Barral, A., Miranda, J.C., Natural breeding places for phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) in a semiarid region of Bahia State, Brazil. Journal of Tropical Medicine Shimabukuro, P.H.F., Tolezano, J.E., Galati, E.A.B., Chave de identificação ilustrada de Phlebotominae (Diptera: Psychodidae) do Estado de São Paulo. Papéis Avulsos de Zoologia. 51, Souza, M.B., Marzochi, M.C.A., Carvalho, R.W., Ribeiro, P.C., Pontes, C.S., Caetano, J.M., Absence of Lutzomyia longipalpis in some endemic visceral leishmaniasis areas in Rio de Janeiro municipality. Cadenos de Saúde Púplica. 19, Teodoro, U., Silveira, T.G.V., Santos, D.R., Santos, E.S., Santos, A.R., Oliveira, O., Kühl, J.B., Alberton, D., Influência da reorganização, da limpeza do peridomicílio e a da desinsetização de edificações na densidade populacional de flebotomíneos no Município de Doutor Camargo, Estado do Paraná, Brasil. Cadernos de Saúde Pública. 19,

64 51 Warburg, A., Faiman, R., Research priorities for the control of phlebotomine sand flies. Journal Vector Ecology. 36, Young, D.G., Duncan, M.A., Guide to the identification and geographic distribution of Lutzomyia sand-flies in Mexico, West Indies, Central and South America (Diptera: Psychodidae). Associated Publishers, Florida

65 52 7 Conclusão i. A Ilha da Marambaia e, mais especificamente, a região da Vacaria, apresenta condições favoráveis ao desenvolvimento de criadouros de flebotomíneos, contribuindo com a manutenção desses dípteros no ambiente. ii. A armadilha de emergência proposta, apesar da adaptação, foi eficaz para localizar criadouros de flebtomíneos. iii. Foram capturadas espécies de importância epidemiológica em ambas as armadilhas empregadas. iv. Ambientes com cobertura vegetal viva, na forma de árvores, ou em decomposição, na forma de serrapilheira, favorece o desenvolvimento de criadouros de flebotomíneos. v. A cobertura vegetal e a serrapilheira estão presentes em ambientes antropizados, como bordas de florestas e peridomicílio, o que reforça a importância do estudo para a Saúde Pública.

66 53 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Warburg A, Faiman R. Research priorities for the control of phlebotomine sand flies. J Vector Ecol 2011; 36: Alencar RB. Emergência de febotomíneos (Diptera: Psychodidae) em chão de floresta de terra firme na Amazônia Central do Brasil: uso de um modelo modificado de armadilha de emergência. Acta Amaz 2007; 37: Forattini, OP, editor. Entomologia Médica. São Paulo: Edgard Blücher Ltda; Feliciangeli MD. Natural breeding places of phlebotomine sandflies. Med Vet Entomol 2004; 18: Hanson WJ. The Breeding Places of Phlebotomus in Panama (Diptera, Psychodidae). Ann Entomol Soc Am 1961 Mai; 54: Novo SPC, Souza MB, Villanova CB, Meródio JC, Meira AM. Survey of sandfly vectors of leishmaniasis in Marambaia Island, municipality of Mangaratiba, State of Rio de Janeiro, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop 2013; 46: Feitosa MAC, Castellon EG. Phlebotominae (Diptera: Psychodidae) in the outskirts of Santarém City. Horizontal stratification and aggravating factores for the domiciliary transmission of leishmaniasis. Rev Colomb Cienc Anim 2009; 1: Müller GC, Kravchenko VD, Rybalo L, Schlein Y. Characteristics of resting and breeding habitats of adults sand flies in the Judean Desert. J Vector Ecol 2011; 36: Sangiorgi B, Miranda DN, Oliveira DF, Santos EP, Gomes FR, Santos EO, et al. Natural breeding places for phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) in a semiarid region of Bahia State, Brazil. J Trop Med 2012; Costa JML. Epidemiologia das Leishmanioses no Brasil. Gazeta Médica Bahia 2005; 75: World Health Organization. Cotrol of Leishmaniasis: Technical Report Series. Geneva: World Health Organization; Ministério da Saúde. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. Brasília: Ministério da Saúde; Ministério da Saúde. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasília: Ministério da Saúde; Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases 2004; 27: Moreno EC, Melo MN, Genaro O, Lambertucci JR, Serufo JC, Andrade ASR, et al. Risk factors for Leishmania chagasi infection in an urban area of Minas Gerais State. Rev Soc Bras Med Trop 2005; 38:

67 Rangel EF, Lainson R. Ecologia das leishmanioses. In: Flebotomíneos do Brasil. Editora Fiocruz, Rio de Janeiro; p World Health Organization. TDR: For Research on deseases of Poverty Leishmaniasis; Disponível em: Sacks DL. Leishmania-sandfly interactions controlling speciesspecific vector competence. Cell Microbiol 2001; 3: Lainson R. The Neotropical Leishmania species: a brief historical review os their discovery, ecology anf taxonomy. Rev Pan-Amazon Saúde 2010; 1: Rey L. Parasitologia. 3. ed.guanabara Koogan; Aragão HB. Transmissão da leishmaniose no Brasil pelo Phlebotomus intermedius. Bras Med 1922; 36: D'utra e Silva O. Sobre a leishmaniose tegumentar e seu tratamento. Mem Inst Oswaldo Cruz 1915; 7: Kawa H, Sabroza PC. Spatial distribuition of tegumentary leishmaniasis in the city of Rio de Janeiro. Cad Saúde Pública 2002; 18: Rangel EF, Souza NA, Wemerllinger ED, Barbosa AF. Natural infection of Lutzomyia intermedia Lutz & Neiva, 1912, in an endemic area of visceral leishmaniasis of Rio de Janeiro.Mem Inst Oswaldo Cruz 1984; 79: Carvalho RW, Serra-Freire NM, Souza MB. Fauna de flebótomos da Ilha do Araújo, Município de Paraty, RJ - Diversidade e aspectos do comportamento. Parasitol Al Día 1995; 19: Souza MB, Pujol-Luz JR, Marzochi MCA, Carvalho RW, Pontes CS, Meira AM. Estudo da fauna flebotomínica em área de leishmanioses tegumentar americana e visceral, zona periurbana do Bairro de Jacarepaguá, Rio de Janeiro. Emtomol Vectores 2000; 7: Marzochi MCA, Sabroza PC, Toledo LM, Marzochi KBF, Tramontano NC, Rangel Filho FB. Leishmaniose visceral na cidade do Rio de Janeiro - Brasil. Cad saúde Pública 1985; 1: Araújo Filho NA, Coura JR, Reis VLP. Leishmaniose tegumentar americana na Ilha Grande, Rio de Janeiro. IV. Reservatórios domésticos. Rev Soc Bras Med Trop 1981; 14: Souza MB, Marzochi MCA, Carvalho RW, Ribeiro PC, Pontes CS, Caetano JM. Absence of Lutzomyia longipalpis in some endemic visceral leishmaniasis areas in Rio de Janeiro municipality. Cad Saúde Púplica 2003; 19: Fundação Nacional de Saúde. Leishmaniose Visceral no Brasil: situação atual, principais aspectos epidemiológicos, cl[inicos e medidas de controle. Boletim eletrônico 6. Brasília: FUNASA; Disponível em: br.pdf. 31. Marzochi MCA, Marzochi KBF, Schubach A. Leishmaniose Visceral Americana e Leishmaniose Visceral Americana. In: Cimerman B,

68 Cimerman S. Parasitologia Humana e Seus Fundamentos. São Paulo: Editora Atheneu; cap Nunes VLB, Yamamoto YY, Rego JrFA, Dorval MEC, Galati EAB, Oshiro ET, et al. Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral em cães de Corumbá, Mato Grosso do Sul. Pesq Vet Bras 1988; 8: Dantas-Torres F. Leishmania infantum versus Leishmania chagasi: do not forget the law of priority. Mem Inst Oswaldo Cruz 2006; 101: Lainson R, Rangel EF. Lutzomyia longipalpis and the ecoepidemiology of American visceral leishmaniasis, with particular reference to Brazil: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005; 100: Mauricio IL, Howard MK, Stothard JR, Miles MA. Genomic diversity in the Leishmania donovani complex. Parasitol 1999; 119: Young DG, Duncan MD. Guide to the identification and distribution of Lutzomyia sand flies in Mexico, the West Indies, Central and South America (Diptera: Psycodidae). Associated Publishers; Galati EAB. Classificação de Phlebotominae. In: Rangel EL, Lainson F. Flebotomíneos do Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz; p Missawa NA, Veloso MAE, Maciel GBML, Michalsky EM, Dias ES. Evidence of transmission of visceral leishmaniasis by Lutzomyia cruzi in the municipality of Jaciara, State of Mato Grosso, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop 2011; 44: Marcondes CB, Lozovei AL, Vilela JH. Geographic distribution of phlebotomine sandflies of the Lutzomyia intermedia (Lutz & Leiva, 1912) complex (Diptera, Psychodidae). Rev Soc Bras Med Trop 1998; 31: Andrade Filho JD, Galati EA, Falcão AL. Redescription of Nyssomyia intermedia (Lutz & Neiva, 1912) and Nyssomyia neivai (Pinto, 1926) (Diptera: Psychodidae). Mem Inst Oswaldo Cruz 2003; 98: Rangel EF, Azevedo ACR, Andrade CA, Souza NA, Wermelinger ED. Studies on sandfly fauna (Diptera: Psychodidae) in a foci of cutaneous leishmaniasis in mesquita, Rio de Janeiro State, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 1990; 85: Aguiar GM, Mederios WM, Marco TS, Santos SC, Gambardella S. Ecology of sandflies in Serra do Mar, Itaguaí, state of Rio de Janeiro, Brazil. I - Sandfly fauna and prevalence of the species in collections sites and method of capture. Cad Saúde Pública 1996; 12: Arias JR, Freitas RA. On the vectors of cutaneous leishmaniasis in the Central Amazon of Brazil. 3. Phlebotomine sand fly stratification on a terra firme forest. Acta Amazon 1982; 12: Nery LC, Lorosa NE, Franco AM. Feeding preference of the sand flies Lutzomyia umbratilis and L. spathotrichia (diptera: Psychodidae, Phlebotominae) in an urban forest patch in the city of Manaus, Amazonas, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99: Rebêlo JMM, Mendes WA, Costa JML, Cavaleiro N. Preliminary check list of species from genus Lutzomyia, França, 1924 (Psychodidae, Phlebotominae) from the State of Maranhão, Brazil. Cad Saúde Pública 1996; 12: Rebêlo JMM, Araújo JNA, Carvalho ML, Barros VLL, Silva FS, Oliveira ST. Flebótomo (Diptera, Phlebotominae) da Ilha de São Luis, zona do Golfão Maranhanse, Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 1999; 32:

69 47. Andrade Filho JD, Valente MB, Andrade WA, Brazil RP, Falcão AL. Phlebotomine sand flies in the State of Tocantins, Brazil (Diptera: Psychodidae). Rev Soc Bras Med Trop 2001; 34: Ribeiro A, Missawa N, Zeilhofer P. Distribution of Phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) of medical importance in Mato Grosso State, Brazil. Rev Inst Med Trop São Paulo 2007; 49: Galati EAB, Nunes VLB, Dorval MEC, Oshiro ET, Cristaldo G, Espíndola MA, et al. Study of Phlebotomines (Diptera, Psuchodidae), in area of cutaneous leishmaniasis in the Mato Grosso do Sul State, Brazil. Rev Saúde Pública 1996; 30: Teodoro U, Kuhl JB, Rodrigues M, Santos ES, Santos DR, Maróstica LMF. Flebotomíneos coletados em matas remanescentes e abrigos de animais silvestres de zoológico no perímetro urbano de Maringá, sul do Brasil. Estudo preliminar. Rev Soc Bras Med Trop 1998; 31: Souza NA, Andrade-Coelho CA, Vilela NL, Peixoto AA, Rangel EF.Seasonality of Lutzomyia intermedia and Lutzomyia whitmani (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae), occurring sympatrically in area of cutaneous leishmaniasis in the State of Rio de Janeiro, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2002; 97: Teodoro U, Salvia Filho V, Lima EM, Spinosa RP, Barbosa OC, Ferreira MEMC, et al.observations on the behavior of phlebotomines in forest and domiciliary environments in an endemic area of American cutaneous leishmaniasis in southern Brazil. Rev Saúde Pública 1993; 27: Carvalho MR, Valença HF, Silva FJ, Pita-Pereira D, Pereita TA, Britto C. Natural Leishmania infantum infection in Migonemyia migonei (França, 1920) (Diptera:Psychodidae:Phlebotominae) the putative vector of visceral leishmaniasis in Pernambuco State, Brazil. Acta Trop 2010; 116: Deane LM, Deane MP. Observações sobre abrigos e criadouros de flebotomíneos no Noroeste do Estado do Ceará. Rev Bras Mal D Trop 1957; 9: Souza MA, Sabroza PC, Marzochi MCA, Coutinho SG, Souza WJC. Leishmaniose Visceral no Rio de Janeiro. 1-Flebotomíneos da área de procedência de caso humano autóctone. Mem Inst Oswaldo Cruz 1981; 76: Resende MC, Camargo MCV, Vieira JRM, Nobi RCA, Porto NMN, Oliveira CL, et al. Seasonal variation of Lutzomyia longipalpis in Belo Horizonte, State of Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop 2006; 39: Dias ES, França-Silva JC, Silva JC, Monteiro EM, Paula KMP, Gonçalves CM, et al. Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) de um foco de leishmaniose tegumentar no Estado de Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop 2007; 40: Barata RA, França-Silva JC, Mayrink W, Silva JC, Prata A, Lorosa ES, et al. Aspectos da ecologia e do comportamento de flebotomíneos em área endêmica de leishmaniose visceral, Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop 2005; 38: Missawa NA, Lima GB. Spatial distribution of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) and Lutzomyia cruzi (Mangabeira, 1938) in the State of Mato Grosso. Rev Soc Bras Med Trop 2006; 39: Rutledge LC, Ellenwood DA. Production of Phlebotomine sand flies on the open forest floor in Panama: hydrologic and physiographic relations. Environ Entomol 1975; 4:

70 Casanova C, Andrighett, MTM, Sampaio SMP, Marcoris MLG, Colla-Jaccques FE, Prado AP. Larval breeding sites of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) in visceral leishmaniasis endemic urban areas in Southeastern Brazil. PLoS Negl Trop Dis 2013; 7: e Whittingham HE, Rook AF. Observations on the life-history and bionomics of Phlebotomus paparasii. British Med J 1923; 3285: Killick-Kendrick R. The biology and control of phlebotomine sand flies. Clin Dermatol 1999; 17: Hassan M, Elhassan AM, Musa AM, Osman OF, Els-Bara'a FMA, Balkew M, et al. Establishment and maintenance of a laboratory colony of the sandfly Phlebotomus orientalis (Diptera: Psychodidae), the vector of visceral leishmaniasis in Sudan. Khartoum Med J 2010; 3: Moncaz A, Faiman R, Warburg A. Bredding sites of Phebotomus sergenti, the sand fly vector of Cutaneous Leishmaniasis in the Judean Desert. Plos Negl Trop Dis 2012 Jul; 6(7): e Molina R. Laboratory adaptation of an autochthonous colony of Phlebotomus perniciosus Newstead, 1911 (Diptera: Psychodidae). Res Rev Parasitol 1991; 51(1-4): Nieves E, Ribeiro A, Brazil R. Physical factors influencing the oviposition of Lutzomyia migonei (Diptera: Psychodidae) in laboratory conditions. Mem Inst Oswaldo Cruz 1997; 92: Ivovic, V, Chaniotis V, Vujanic M, Bobic B, Nikilic A, Klun I, et al. Life tables and reproductiv parameters os phlebotumus neglectus Tonnoir, 1921 (Diptera, Psychodidae) under laboratory conditions. Arch Biol Sci Belgrade 2010; 3(2): Marzochi MCA, Fagundes A, Andrade MV, Souza MB, Madeira MF, Mouta-Confort, et al. Visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil: eco-epidemiological aspects and control. Rev Soc Bras Med Trop 2009;42: Teodoro U, Salvia Filho V, Lima EM, Misuta NM, Verginassi TG, Ferreira MEMC. Leishmaniose tegumentar americana: flebotomíneos de área de transmissão no Norte do Paraná, Brasil. Rev Saúde Pública 1991; 25: Domingos M, Carreri-Bruno GC, Ciaravolo RMC, Galati EAG, Wanderley DMV, Corrêa FMA. Leishmaniose tegumentar americana: flebotomíneos de área de transmissão, no município de Pedro detoledo, região sul do Estado de São Paulo, Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 1998; 31: Ferreira LC, Deane L, Mangabeira Filho O. Sobre a biologia dos flebótomos das zonas de leishmaniose visceral ora em estudo no Estado do Pará. O Hospital 1938; 14: Casanova C. A soil emergence trap for collections of phlebotomine sand flies. Mem Inst Oswaldo Cruz 2001 Feb; 96(2): Conde MMS, Lima HRP, Peixoto AL. Aspectos florísticos e vegetacionais da Marambaia, Rio de Janeiro, Brasil. In: Menezes LFT, Peixoto AL, Araújo DSD. História Natural da Marambaia.

71 58 Seropédica: Editora da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro; p Pereira L, Xerz R, Pereira A. Ilha da Marambaia (Baía de Sepetiba, Rj): resumo fisiográfico, histórico e importância cultural. Rev Soc Bras Prog Ciênc 1990; 42: World Maps of Koopen-Geiger Climate classification. Inst Vet Public Health Available from: Teodoro U, Silveira TGV, Santos DR, Santos ES, Santos AR, Oliveira O, et al. Influência da reorganização, da limpeza do peridomicílio e da desinsetização de edificações na densidade populacional de flebotomíneos no Município de Doutor Camargo, Estado do Paraná, Brasil. Cad Saúde Pública 2003; 6: Souza MC, Morim MP, Conde MMS, Menezes LFT. Subtribo Myrciinae O. Berg (Myrtaceae) na Restinga da Marambaia, RJ, Brasil. Acta Bot Bras 2007; 21: McCombie-Young TC, Richmond AE, Brendish GR. Sandfly and sandfly fever in the Peshawar District. Indian J Med Res 1926; 13:

72 59 9 APÊNDICES 9.1 Algumas armadilhas de emergência na área de estudo: (a) Ponto1; (b) Ponto 2.

73 Armadilhas luminosas do tipo CDC no campo: (a,b) Ponto 1; (c,b) Ponto 2.

74 9.3 Coleta do solo no perímetro das armadilhas de emergência. 61

75 Processo das amostras de solo na solução saturada de açúcar: (a) amostra do solo em solução saturada de açúcar; (b) amostra do solo em álcool 70% após o processamento na solução saturada de açucar; (c) material triado.

76 Formas imaturas de flebotomíneos obtidas através da solução saturada de açúcar: (a) larva de 2º estádio; (b) larva de 4º estádio; (c) pupa.