3.1 POPULAÇÕES E VARIÁVEIS EM ESTUDO

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1 3.1 POPULAÇÕES E VARIÁVEIS EM ESTUDO Foram estudados 83 doentes com carcinoma urotelial da bexiga, admitidos consecutivamente no Instituto Português de Oncologia Centro Regional do Norte (IPO- CRN), de Agosto de 1992 a Setembro de 2005, e tratados com intenção curativa. Destes, 67 (80,7%) eram do sexo masculino e 16 (19,3%) eram do sexo feminino. A idade mediana da amostra era de 70 anos (mínimo - 41, máximo - 83). As neoplasias foram seleccionadas a partir do Arquivo do Departamento de Anatomia Patológica do IPO-CRN, com base na disponibilidade de blocos de tecidos incluídos em parafina e na existência de dados de follow-up adequados. Cortes (corados pela coloração de hematoxilina-eosina) de todos os tumores foram revistos independentemente por dois observadores, sendo classificados histologicamente de acordo com os critérios propostos pela WHO/ISUP (World Health Organization / International Society of Urological Pathology) (129). Assim, 22 (26,5%) tumores eram papilares, 45 (54,2%) eram não papilares e 16 (19,3%) eram mistos; em relação ao grau de diferenciação, todas as neoplasias eram de alto grau [segundo a classificação da WHO (130), 25 (30,1%) eram grau II e 58 (69,9%) eram grau III]. A classificação por estádios foi realizada segundo a proposta de 2002 do AJCC (American Joint Committee on Cancer) (122). Deste modo, 21 (25,3%) tumores eram superficiais e 62 (74,7%) tumores eram invasores [estratificando: 1 (1,2%) Ta, 18 (21,7%) T1, 2 (2,4%) Tis, 9 (10,8%) T2a, 4 (4,8%) T2b, 30 (36,1%) T3 e 19 (22,9%) T4]. Durante o exame histopatológico clássico, foi também avaliada a existência de permeação vascular sanguínea (venosa) e permeação vascular linfática. A distinção entre os DOENTES E MÉTODOS 99

2 dois tipos de vasos permeados por células malignas realizou-se, basicamente, tendo em conta a presença ou ausência de eritrócitos no lúmen de vasos sanguíneos ou linfáticos, respectivamente. Avaliou-se igualmente a presença de metástases loco-regionais (ganglionares ou noutros órgãos adjacentes). Como tal, foi diagnosticada a ocorrência de envolvimento vascular em 37 (44,6%) dos casos [19 (22,9%) casos apresentavam imagens de permeação vascular sanguínea e 18 (21,7%) casos apresentavam imagens de permeação vascular linfática]. Dos 5 casos onde tinham sido isolados gânglios linfáticos, 2 apresentavam metastização ganglionar; 23 (27,7%) casos apresentavam invasão directa ou metástases noutros órgãos loco-regionais (próstata, vesículas seminais, cólon sigmóide ou útero). O tratamento cirúrgico primário com intenção curativa foi, em 79 casos, a cistectomia radical. Em 4 doentes com tumores superficiais papilares foi realizada ressecção transuretral (RTU); nestes casos, dois a três anos após o primeiro tratamento cirúrgico com intenção curativa, foi necessário realizar a cistectomia radical, devido à ocorrência de recidiva. O tratamento global incluiu cirurgia, imunoterapia (2 casos), quimioterapia (23 casos) e/ou radioterapia (7 casos) adjuvante. O período mediano de follow-up foi de 13,5 meses (mínimo - 1, máximo - 110). Estudou-se a imunorreactividade para o CD31 [para determinação da densidade de vasos sanguíneos (DVS) e da ocorrência de permeação vascular sanguínea (PVS)], D2-40 [para determinação da densidade de vasos linfáticos (DVL) e da ocorrência de permeação vascular linfática (PVL)], VEGF-C e VEGFR-3. Correlacionaram-se estas variáveis entre si, com as características histopatológicas do tumor e com a sobrevivência livre de doença e a sobrevivência global. 100 DOENTES E MÉTODOS

3 3.2 DEFINIÇÃO DAS VARIÁVEIS EM ESTUDO Tumores superficiais Tumores papilares (estádios Ta e T1) e não papilares (Tis). Dado todos os tumores superficiais da série serem de alto grau, foram estudados em conjunto, pois são relativamente semelhantes em termos de prognóstico. Recidiva Reaparecimento da doença após cirurgia com intenção curativa (RTU ou cistectomia parcial), diagnosticado por cistoscopia e comprovado histologicamente. Nos casos cistectomizados, a recidiva foi determinada pelo reaparecimento loco-regional ou à distância da doença. Sobrevivência livre de doença Período compreendido entre a data do primeiro tratamento e a primeira recidiva ou a última consulta de seguimento sem ocorrência de recidiva. Sobrevivência global Período compreendido entre a data do primeiro tratamento e a morte por cancro ou a última consulta de seguimento. Permeação vascular EHC (Permeação vascular exame histopatológico clássico) Presença de, pelo menos, uma célula com características de malignidade (citoplasma escasso, núcleos proemi- DOENTES E MÉTODOS 101

4 nentes, nucléolos evidentes ou figuras de mitose) no lúmen de vasos (sanguíneos ou linfáticos) com revestimento endotelial contínuo. Diagnóstico realizado em cortes corados através da coloração de hematoxilina-eosina, sendo as estruturas vasculares distintas pela presença / ausência de eritrócitos em vasos sanguíneos / linfáticos, respectivamente. Permeação vascular EME 1 (Permeação vascular exame após marcação específica, tipo 1) Presença de, pelo menos, uma célula com características de malignidade no lúmen de vasos (sanguíneos ou linfáticos) com revestimento endotelial contínuo. Diagnóstico realizado em cortes submetidos a técnica imuno-histoquímica, para marcação específica de vasos sanguíneos ou linfáticos por imunoexpressão de CD31 e D2-40, respectivamente. Permeação vascular EME 2 (Permeação vascular exame após marcação específica, tipo 2) Presença de êmbolos constituídos por células malignas agregadas no lúmen de vasos (sanguíneos ou linfáticos) com revestimento endotelial contínuo. Diagnóstico realizado em cortes submetidos a técnica imuno-histoquímica, para marcação específica de vasos sanguíneos ou linfáticos por imunoexpressão de CD31 e D2-40, respectivamente. 102 DOENTES E MÉTODOS

5 3.3 METODOLOGIA Foi realizada a avaliação da imunoexpressão de CD31, D2-40, VEGF-C e VEGFR-3, utilizando anticorpos monoclonais Anticorpos Para marcação do endotélio vascular sanguíneo utilizou-se o anticorpo monoclonal anti-cd31 humano de ratinho (clone JC70A, DakoCytomation ). Esta molécula, também conhecida por PECAM-1 (platelet / endothelial cell adhesion molecule 1), é uma proteína transmembranar de 135 kda, pertencendo à super-família das imunoglobulinas (402). Ocorre expressão de CD31 em todos os endotélios contínuos (bem como em algumas células hematopoiéticas incluindo monócitos / macrófagos, plaquetas, granulócitos e linfócitos B). Esta proteína parece intervir na adesão entre células endoteliais e entre leucócitos e células endoteliais; está igualmente relatado o seu envolvimento em eventos biológicos como a angiogénese, trombose e cicatrização (402). Como tal, o anticorpo anti- CD31 é utilizado como marcador de células endoteliais sanguíneas para determinação da ocorrência de angiogénese em vários tipos de tumores ( ). Para marcação do endotélio vascular linfático utilizou-se o anticorpo monoclonal anti- D2-40 humano de ratinho (clone D2-40, DakoCytomation ). A molécula D2-40 (ou antigénio oncofetal M2A) é uma sialoglicoproteína expressa nas gónadas masculinas primitivas e em certos tumores das células germinativas testiculares (406); a sua expressão ocorre igualmente na superfície membranar de células endoteliais linfáticas, não se verificando em endotélio DOENTES E MÉTODOS 103

6 sanguíneo. O anticorpo correspondente é vulgarmente utilizado na identificação de endotélio linfático, para determinação da densidade de vasos linfáticos e da ocorrência de invasão linfovascular em certos tipos de tumores (407, 408). Para a avaliação da imunoexpressão de VEGF-C e VEGFR-3, utilizaram-se os anticorpos policlonais anti-vegf-c humano de coelho (clone Z-CVF3, Zymed Laboratories) e anti-flt-4 humano de coelho (clone C234, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) Técnica de Imuno-histoquímica O estudo imuno-histoquímico foi efectuado segundo o método da estreptavidinabiotina peroxidase, em cortes histológicos de fragmentos de neoplasia da bexiga da série referida (fixados em formol e incluídos em parafina) de 4 µm de espessura colocados em lâminas de vidro revestidas com Poli-L-Lisina (Sigma Chemical Co ). De um modo global, a técnica de imuno-histoquímica para avaliação da imunoexpressão de CD31, D2-40, VEGF-C e VEGFR-3, utilizando anticorpos monoclonais / policlonais, envolveu as seguintes etapas: - secagem a 37ºC, durante 18 horas, - desparafinação em xilol, - re-hidratação em concentrações decrescentes de etanol e, por fim, lavagem em água destilada, - recuperação antigénica em tampão citrato 10 mm (ph 6,0), em microondas, seguida de arrefecimento à temperatura ambiente, durante 20 minutos, 104 DOENTES E MÉTODOS

7 - lavagem em solução tampão salina, - bloqueio das peroxidases endógenas com peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 0,3%, E. Merck ) em metanol (E. Merck ), - lavagem em solução tampão salina, - incubação em solução de soro normal de cavalo, para bloqueio de ligações inespecíficas aos antigénios a identificar, - incubação em solução do anticorpo monoclonal específico, - lavagem em solução tampão salina, - incubação em solução de anticorpo secundário biotinilado, - lavagem em solução tampão salina, - incubação em solução de estreptavidina-peroxidase, - lavagem em solução tampão salina, - incubação em solução de diaminobenzidina, (DakoCytomation), durante 10 minutos, para revelação, - lavagem em água corrente, - contrastação com hematoxilina de Meyer (E. Merck ), - desidratação em concentrações crescentes de etanol, - diafinização em xilol, - montagem com entellan (E. Merck ). As condições e soluções específicas para as diferentes técnicas de imuno-histoquímica (Tabela 3.1) seguiram as instruções do fornecedor e testes realizados no laboratório. Para cada caso, foram efectuados um controlo negativo (substituindo o anticorpo primário por solução tampão salina) e um controlo positivo. DOENTES E MÉTODOS 105

8 Tabela 3.1 Condições e soluções específicas para as técnicas de imuno-histoquímica utilizando os anticorpos monoclonais CD31 e D2-40 e os anticorpos policlonais VEGF-C e VEGFR-3 Anticorpos CD31 D2-40 VEGF-C VEGFR-3 Recuperação antigénica Inibição das peroxidases endógenas Solução tampão salina Solução de soro normal de cavalo Solução de anticorpo monoclonal Solução de anticorpo secundário biotinilado Solução de estreptavidinaperoxidase Solução de diaminobenzidina 600 W, 10 min 600 W, 15 min 600 W, 15 min 700 W, 15 min Após lavagem seguida à recuperação antigénica, 10 min PBS 1 + Tween 0,02% Large volume Ultra V Block, Labvision Clone JC70A, DakoCytomation Diluição 1:100 Incubação 60 min, RT Goat Anti-Polyvalent, Labvision Large volume Streptavidin Peroxidase, Labvision Liquid DAB+substrate chromogen system, DakoCytomation Durante a re-hidratação, 30 min Durante a re-hidratação, 30 min PBS 1 PBS 1 RTU Normal Horse Serum, Vector Incubação 20 min, RT Clone D2-40, DakoCytomation Diluição 1:100 Incubação ON, 4ºC RTU Biotinylated Universal Antibody, Vector Incubação 30 min, RT Vectastain RTU Elite ABC reagent, Vector Incubação 45 min, 37ºC Liquid DAB+substrate chromogen system, DakoCytomation RTU Normal Horse Serum, Vector Incubação 20 min, RT Clone Z-CVF3, Zymed Laboratories Diluição 1:70 Incubação ON, 4ºC RTU Biotinylated Universal Antibody, Vector Incubação 30 min, RT Vectastain RTU Elite ABC reagent, Vector Incubação 45 min, 37ºC Liquid DAB+substrate chromogen system, DakoCytomation Após lavagem seguida à recuperação antigénica, 10 min PBS 1 + Tween 0,02% Large volume Ultra V Block, Labvision Clone C234, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Diluição 1:200 Incubação 60 min, RT Goat Anti-Polyvalent, Labvision Large volume Streptavidin Peroxidase, Labvision Liquid DAB+substrate chromogen system, DakoCytomation Controlo positivo Carcinoma da mama Amígdala Carcinoma do cólon Carcinoma da mama Padrão de marcação Citoplasmático Citoplasmático Citoplasmático Citoplasmático W: watt, min: minutos, PBS: Phosphate Buffer Saline, ON: overnight, RT: room temperature Avaliação e Quantificação da Imunorreactividade A imunorreactividade dos anticorpos monoclonais / policlonais foi avaliada através da visualização dos cortes histológicos por microscopia óptica, obtendo-se imagens digitais pela utilização de uma câmara fotográfica digital. Cada corte foi observado independentemente por dois observadores, sendo as divergências resolvidas por observação conjunta. 106 DOENTES E MÉTODOS

9 Para a avaliação da marcação de células endoteliais sanguíneas e linfáticas pelos anticorpos anti-cd31 e anti-d2-40, respectivamente, foram seleccionados, em cada caso, dez campos de densidade vascular aparentemente alta (hotspots vasculares) (200 ) (409). Em cada campo, contabilizaram-se os vasos com marcação endotelial inequívoca; aquando da existência de imagens de sobreposição, contabilizou-se apenas uma unidade vascular. Os vasos colapsados por compressão tumoral (fenómeno frequente na vascularização linfática intratumoral) foram também considerados. Distinguiram-se qualitativamente estruturas vasculares intratumorais e peritumorais; avaliou-se igualmente a existência de vasos intratumorais colapsados. A média da contagem de vasos sanguíneos (venosos) / linfáticos em dez campos foi definida como a densidade de vasos sanguíneos / linfáticos, respectivamente. A existência de permeação vascular sanguínea (venosa) ou linfática foi avaliada tendo em conta os vasos sanguíneos / linfáticos CD31 / D2-40 positivos, respectivamente. Realizouse igualmente a distinção entre as duas formas de permeação vascular durante o exame histopatológico clássico (ver definição das variáveis no Ponto 3.2). Os níveis de expressão de VEGF-C foram avaliados semi-quantitativamente, considerando a marcação citoplasmática de células neoplásicas. Em cada caso, foram seleccionados dez campos, sendo observadas aproximadamente 1000 células (100 células / campo), com um poder de ampliação de 200. A imunorreactividade foi graduada por (-) ausência de expressão, (+) expressão em menos de 10% das células, (++) expressão em 10% a 50% das células e (+++) expressão em mais de 50% das células. Consideraram-se igualmente quatro níveis para qualificar a intensidade da marcação (ausente, fraca, moderada e forte) (410). DOENTES E MÉTODOS 107

10 A avaliação da imunorreactividade para o VEGFR-3 foi realizada de modo semelhante ao descrito para o VEGF-C. Considerou-se, neste caso, a marcação citoplasmática de células neoplásicas e de células endoteliais (sanguíneas e linfáticas). Assim, foram seleccionadas áreas onde existissem estruturas vasculares em proliferação bem como células neoplásicas Análise Estatística Os resultados foram apresentados em tabelas de frequências. A análise univariada foi efectuada pelo teste do qui-quadrado (χ 2 ), pelo teste exacto de Fisher ou pelo teste de Mann- Whitney, quando apropriado. A sobrevivência livre de doença e a sobrevivência global foram analisadas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças das curvas encontradas foram estudadas pelo teste de Log-Rank ou pelo teste de Breslow, quando apropriado. Para o estudo da densidade vascular sanguínea (DVS) e da densidade vascular linfática (DVL) utilizou-se a mediana de cada um dos parâmetros como valor de referência. No caso da DVL, estabeleceu-se igualmente um ponto de corte através do método das curvas ROC (receiver operating characteristic curves) (411), com base na ocorrência de permeação vascular linfática (PVL). Para tal, utilizando a matriz que se aplica aos testes de prognóstico (412) (Tabela 3.2), constituiu-se um gráfico em que se relacionaram os valores percentuais dos verdadeiros positivos do teste (sensibilidade) com os valores percentuais dos falsos positivos (1 especificidade). Adoptou-se um ponto de corte com o máximo de sensibilidade e especificidade, uma vez que se pretendia o maior grau de acuidade no diagnóstico de 108 DOENTES E MÉTODOS

11 ocorrência (verdadeiros positivos) ou de ausência (verdadeiros negativos) de PVL, respectivamente. Tabela 3.2 Matriz utilizada para avaliar o interesse dos testes de prognóstico (412) Doença Presente (D+) Ausente (D-) Total Teste Positivo (T+) a c a + c Negativo (T-) b d b + d Total a + b c + d Verdadeiros positivos = P(T+/D+) = a/(a+b) SENSIBILIDADE Verdadeiros negativos = P(T-/D+) = d/(c+d) ESPECIFICIDADE Falsos positivos = P(T+/D-) = c/(c+d) 1 - ESPECIFICIDADE Falsos negativos = P(T-/D+) = b/(a+b) A análise multivariada dos factores de prognóstico identificados na análise univariada foi realizada pelo método de Cox (cyclooxygenase proportional hazards regression). Todas as variáveis dependentes foram consideradas como categóricas. Os resultados foram considerados significativos para valores de p<0,05. Para a análise estatística utilizou-se o programa específico SPSS 13.0 (Statistical Package for Social Sciences) para Windows. DOENTES E MÉTODOS 109

12 110 DOENTES E MÉTODOS